비디오: MACS: Isolation of Thymic T Lymphocytes

자기 활성화 세포 분류 (MACS): 흉선 T 림프구 분리

Overview

출처: 뮤니에 실베인^1,2,3,퍼셰 티보^1,2,3,소피 노볼트^4,레이첼 골럽^1,2,3
1 림프포포에이시스, 면역학학과, 파스퇴르 연구소, 파리, 프랑스
² INSERM U1223, 파리, 프랑스
³ 유니버시테 파리 디드로, 소르본 파리 시테, 셀룰레 파스퇴르, 파리, 프랑스
⁴ 흐름 세포측정플리트에서, 세포측정및 바이오마커 UtechS, 번역 과학 센터, 파스퇴르 연구소, 파리, 프랑스

병원체에 대한 방어는 면역 계통에 의한 감시에 달려 있습니다. 이 시스템은 복잡하고 많은 세포 유형, 특정 기능을 가진 각 세포 유형으로 구성됩니다. 이 복잡한 조성은 병원체와 상해의 큰 다양성에 면역 반응을 가능하게 합니다. 적응성 면역은 특정 병원체에 대한 특정 반응을 허용합니다. 면역의 이 모형을 책임지는 세포의 대다수는 림프구 (B 세포 및 T 세포)입니다. 일반적으로 B 세포는 세포 외 감염 (예 : 세균 감염)에 반응하고 T 세포는 세포 내 감염 (예 : 바이러스 감염)에 반응합니다. 림프구 집단에 있는 세포의 다른 모형은 그(것)들이 표현하는 세포 표면 단백질의 조합및/또는 분비한 사이토카인의 패널에 의해 특징지을 수 있습니다.

자기 선별은 자기 특성을 사용하여 표적 세포 집단의 농축을 허용하고 하나 또는 여러 세포 표면 단백질의 발현(1, 2). 이 기술은 세 단계로 구성됩니다. 첫째, 세포는 하나 또는 여러 개의 단일 클론 특이적 항체와 결합된 자기 구슬로 배양된다. 이러한 항체에 결합하는 표면 단백질을 표현하는 세포는 자기 구슬에 부착됩니다. 그런 다음 표적 세포 집단은 자석으로 캡처됩니다. 완료하려면 표적 세포가 자석에서 용출됩니다. 끝에, 2개의 선별 제품은 얻어지며, 하나는 라벨이 없는 세포를 포함하고 두 번째는 자기 비드와 결합된 표적 세포를 포함하는 것이다. 컬럼을 사용하여 자기 정렬의 효율성을 향상시킬 수 있습니다. 열에서 비자기 요소는 열을 통해 셀의 경로를 길게 합니다. 따라서 세포 흐름이 느려지고 자석에 의한 세포 캡처를 용이하게합니다.

그림 1: 자기 분리의 회로도 표현. 흉백구세포는 항 CD3 바이오티니화 항체로 염색된다. 세척 후, 스트렙타비딘 (SAV) 결합 된 구슬은 특히 안티 CD3 항체에 비오틴을 고정합니다. (1) 셀은 열로 전송됩니다. (2) 자석은 표지되지 않은 세포를 유지하지 않으며 CD3 양성 셀은 열에 남아 있습니다. 마지막으로, 컬럼은 자석으로부터 분리되고 (3) CD3 양성 세포는 매체로 용출된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

자기 선별 (3)의 두 가지 유형이 있습니다. 양색 선별에서 관심 있는 셀은 자기 구슬로 포획됩니다. 음의 선별에서 원치 않는 세포는 적절한 항체를 운반하는 자기 구슬로 캡처하여 제거됩니다. 이 MACS 기술은 표적으로 한 세포의 좋은 농축을 허용하고 기관에 있는 1-20%에서 60-98%로 복구된 세포의 비율을 향상합니다. 정렬 후, 셀 순도 및 다른 방법(예: 유동 세포측정)에 의해 정렬되는지 확인해야 합니다. MACS 기술은 세포 배양 또는 세포 주기 분석과 같은 그밖 실험을 위한 표적 인구를 풍부하게 하기 위하여 이상적입니다.

이 실험실 운동에서는, 우리는 자기 세포 분류 기술을 사용하여 혼합에서 흉선 백혈구를 분리하고 그 후에 백혈구를 풍부하게 하는 방법을 보여줍니다.

Procedure

1. 준비

시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
먼저 세제로 모든 해부 도구를 씻은 다음 70 % 에탄올로 씻은 다음 깨끗한 종이 타월로 말리십시오.
2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)의 200mL를 준비한다.

2. 해부

supine 위치에 있는 해부 플레이트에 안락사 마우스를 고정합니다.
가위와 집게를 사용하여 흉부 구멍에 접근하기 위해 세로 복강경을 수행합니다.
심장을 제거하여 심장 위에 있는 흉선에 접근할 수 있습니다. 그런 다음, 두 개의 흰 엽으로 구성되고 심장 위의 가슴 구멍에 위치하는 흉통을 식별합니다.
포셉을 사용하여 흉선을 조심스럽게 분리하고 5mL의 HBSS 2 % FCS로 페트리 접시에 놓습니다.
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Results

이 프로토콜에서, CD3 양성 세포는 자기 세포 분류를 사용하여 흉백세포로부터 농축되었다(도 1). 자기 세포 농축 CD3 양성 세포가 전체 흉구 세포의 53.6 %를 나타내기 전에 (그림 2, 상단 패널). 자기 세포 농축 후 CD3 양성 세포의 백분율은 95%로 증가했습니다(그림 2, 하단 패널). 따라서 MACS는 세포 현탁액 혼합물로부터 원하는 세포 집단을 풍부하게 하는 간단하고 빠르며 효율?...

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Application and Summary

자기 분리 기술은 표적 세포 집단을 쉽고 빠르게 정렬하는 일반적인 방법입니다. T 세포를 사용하여 특정 항체와 자기 구슬우리는 우리의 견본에 있는 T 세포 주파수를 풍부하게 했습니다. 실험의 끝에 있는 순도율은 초기 세포 현탁액에 있는 표적 세포의 백분율의 달려 있습니다. 자기 세포 분류 후 얻은 세포는 세포 전달 또는 세포 주기 분석과 같은 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 유동 세?...

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References

Owen, C. S. and Sykes, N. L. Magnetic labeling and cell sorting. Journal of Immunological Methods. 73 (1), 41-48 (1984).
Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W. and Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
Plouffe, B. D., Murthy, S. K. and Lewis, L. H. Fundamentals and application of magnetic particles in cell isolation and enrichment: a review. Reports on Progress in Physics. 78 (1), (2014).

Tags

1. 준비

시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
먼저 세제로 모든 해부 도구를 씻은 다음 70 % 에탄올로 씻은 다음 깨끗한 종이 타월로 말리십시오.
2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)의 200mL를 준비한다.

2. 해부

supine 위치에 있는 해부 플레이트에 안락사 마우스를 고정합니다.
가위와 집게를 사용하여 흉부 구멍에 접근하기 위해 세로 복강경을 수행합니다.
심장을 제거하여 심장 위에 있는 흉선에 접근할 수 있습니다. 그런 다음, 두 개의 흰 엽으로 구성되고 심장 위의 가슴 구멍에 위치하는 흉통을 식별합니다.
포셉을 사용하여 흉선을 조심스럽게 분리하고 5mL의 HBSS 2 % FCS로 페트리 접시에 놓습니다.

3. 면역 세포 격리

같은 페트리 접시 위에 40 μm 세포 여과기에 흉기를 놓습니다. 플런저로 흉기를 분쇄하여 같은 접시에 해리합니다.
해리된 흉선과 유체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮킨다.
페트리 접시를 HBSS 2% FCS 5mL로 세척하고 세척된 배지도 동일한 원심분리기 튜브로 옮겨 넣습니다.
20°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하는 상퍼를 폐기하십시오.
적혈구를 lyse 칼륨 아세테이트 의 2 mL에 펠릿을 다시 중단. 2 분 기다린 다음 HBSS 2 % FCS를 사용하여 최대 14 mL의 볼륨을 구성하십시오.
20°C에서 7분 동안 370 x g로 튜브를 다시 원심 분리합니다. 슈퍼네티드를 버리고 5mL의 HBSS 2% FCS로 펠릿을 다시 놓습니다.
트라이판 블루 염색 분석기를 사용하여 세포 농도를 추정하고 HBSS 2% FCS의 적절한 부피를 사용하여 최종 세포 농도를 10⁷ 세포/mL로 조정한다.

4. 면역 세포의 자기 라벨링

두 개의 FACS 튜브를 가져 가라. 자기 라벨링을 사용하여 분리될 하나의 튜브, "비농축 T 세포", 그리고 다른 튜브인 "농축 된 T 세포"에 라벨을 붙입니다.
두 개의 FACS 튜브 각각에 세포 용액을 분배합니다.
원심 분리기 "농축 된 T 세포"튜브는 370 x g에서 20 °C에서 3 분 동안 3 분 동안 펠릿을 피하는 슈퍼 네티얼을 폐기하십시오.
항 CD3 생체개화 항체 혼합물의 250 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다(표 1, 혼합 1).

섞다	라벨링 시약	희석
1	항 CD3 바이오티니화 항체	1/400 (HBSS 2% FCS)
2	스트렙타비딘 커플비즈	1/5 (HBSS 2% FCS)
3	안티 CD3 BV421	1/200 (HBSS 2% FCS)

표 1: 항체 혼합 조성. 믹스 1과 2는 자기 분리에 사용됩니다. 혼합 3은 자기 분리 후 세포 농축을 평가하는 데 사용됩니다.

세포 서스펜션 항체 믹스를 어둠 속에서 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
3mL의 HBSS 2% FCS를 튜브와 원심분리기모두에 370 x g로 다시 넣고 20°C에서 3분 동안 추가합니다.
상체를 버리고 250 μL 스트렙타비딘 커플 비즈 (표 1, 혼합 2)에서 펠릿을 다시 놓습니다.
세포 혼합물과 구슬을 얼음에 20분 동안 배양합니다.
다음으로, HBSS 2% FCS의 3mL를 추가하고 20°C에서 3분 동안 370 x g에서 잘 섞고 원심분리기를 다시 섞습니다.
HBSS 2% FCS의 2mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.

5. CD3 양성 세포의 자기 분리

자석에 컬럼을 놓고 HBSS 2% FCS3mL을 추가하여 시스템을 가습합니다. 5분 간 기다립니다.
다음으로 레이블이 지정된 셀을 열에 파이프로 넣습니다.
셀 서스펜션이 컬럼을 통과한 후, HBSS 2% FCS의 3mL로 컬럼 X3를 세척합니다.
그런 다음 자석에서 컬럼을 제거하고 15mL 수집 튜브에 놓습니다.
대상 셀을 elute하려면 열에 HBSS 2% FCS5mL을 추가하고 플런저로 열을 플러시합니다.
HBSS 2% FCS의 또 다른 5mL와 함께 용출 단계를 반복합니다.

6. 유동 세포측정에 의한 표적 세포 농축 평가

"농축 된 T 세포"라는 레이블이 붙은 FACS 튜브로 용출 된 세포 현탁액 500 μL을 전송합니다. "비 농축 T 셀" 서스펜션의 200 μL을 제2 FACS로 전송합니다.
그런 다음 20°C에서 7분 동안 370 x g의 두 튜브를 원심분리합니다.
수퍼나탄을 폐기한 다음 형광 항체 믹스 3(표 1 참조)의 100 μL을 두 튜브에 추가합니다.
어둠 속에서 4 °C에서 20 분 동안 두 튜브를 배양하십시오.
다음으로, 20°C에서 3분 동안 370 x g에서 튜브에 HBS S 2% FCS 3mL을 추가하고 원심분리기.
상체를 폐기한 다음 각 튜브를 HBSS 2% FCS의 250μL로 재보설합니다.
지금, 유동 세포측정에 의하여 CD3 양성 세포 농축 속도를 평가합니다.

7. 데이터 분석

'FlowJo' 아이콘을 열고"모든 샘플"창에서 각 튜브의 파일을 드래그합니다.
"농축된 T 셀" 파일을 두 번 클릭하여 Y축의 X축 및 측면 분산(SSC-A)에 전방 분산(FSC-A)을 표시하는 점 플롯을 표시합니다.
림프구 인구를 동그라미로"다각형"을클릭합니다.
다음으로 동그라미를 한 채우기를 두 번 클릭하여 새 창을 만듭니다.
X 축에서 Y축및"FSC-A"에서"FSC-W"를선택하고 FSA-W 음수 셀을 동그라미로 선택합니다. "하위채우기 식별"에서셀 집단을 "단일 셀"이라고 지칭합니다.
동그라미를 한 채우기를 두 번 클릭하여 새 창을 만듭니다. Y 축에서"CD3"를선택하고 CD3 양성 셀을 동그라미로 합니다. "하위인구 식별"에서"창 이름 셀 채우기 "T 셀".
"비 농축 된 T 셀"로 반복합니다.
셀 채우기를 시각화하려면"레이아웃 편집기"를클릭하고 "농축 된 T 셀"과 "비 농축 된 T 셀"파일에서"T 셀"을탭으로 드래그합니다.
CD3+ 림프구를 나타내는 점 플롯이 나타납니다. CD3+ 셀은 CD3+ 농축 튜브에 대한 관심 의 집단에만 나타나야 합니다.
정렬된 셀에서 CD3+ 림프구의 농축을 평가하려면"테이블 편집기"를클릭한 다음 "농축 된 T 셀"과 "농축되지 않은 T 셀" 파일에서 "T 셀"모집단을 테이블에 드래그합니다.
"통계"메뉴에서"림프구 의 빈도"셀을 선택하여 모든 림프구에서 CD3+ 셀의 백분율을 확인한 다음"테이블 만들기"를클릭합니다.
매개 변수 값이 새 테이블에 나타납니다. "농축 된 T 세포"의 경우 CD3 + 셀의 주파수는 약 80 %여야합니다.

건너뛰기...

0:03

Concepts

2:33

Preparation of Materials and Dissection

3:39

Immune Cell Isolation

5:22

Magnetic Labeling of Immune Cells

6:59

Magnetic Separation of CD3-Positive Cells

7:48

Evaluation of Target-Cell Enrichment by Flow Cytometry

9:00

Data Analysis

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