1. 준비

1. 시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
2. 먼저 세제로 모든 해부 도구를 살균한 다음 70%의 에탄올로 닦은 다음 철저히 닦아냅니다.
3. 2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 50mL준비한다.

2. 해부

1. 이산화탄소 전달 시스템을 사용하여 저산소증으로 마우스를 안락사시합니다. supine 위치에 있는 해부 판에 안락사 마우스를 고정하고 가위와 집게를 사용하여 세로 복강경을 수행합니다.
2. 집게를 사용하여 복부 오른쪽에 내장과 위를 움직여 위와 비장을 노출시십시오. 비장은 위장에 부착됩니다.
3. 집게를 사용하여 조심스럽게 위에서 비장을 분리하고 HBSS 2 % FCS의 5 mL가 들어있는 페트리 접시에 놓습니다.

3. 면역 세포 격리

1. 같은 페트리 접시 위에 40 μm 세포 여과기에 비장을 놓습니다. 비장을 플런저로 분쇄하여 해리합니다.
2. 해리된 비장과 유체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기.
3. 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하는 상퍼를 폐기하십시오.
4. 적혈구를 lyse 칼륨 아세테이트 의 2 mL에 펠릿을 다시 중단. 2 분 기다린 다음 HBSS 2 % FCS를 사용하여 최대 15 mL의 볼륨을 구성하십시오.
5. 10°C에서 7분 동안 370 x g로 튜브를 다시 원심 분리합니다. 슈퍼네티드를 버리고 5mL의 HBSS 2% FCS로 펠릿을 다시 놓습니다.
6. 트라이판 블루 염색 분석기를 사용하여 세포를 계산하고 HBSS 2% FCS의 적절한 부피를 사용하여 최종 세포 농도를 10⁷ 세포/mL로 조정합니다.

4. CFSE 염색 및 T 세포 자극

1. 4개의 관에^107개의 격리된 비장 세포/튜브를 분배합니다 (15mL 튜브, 1-4로 표시)
2. 각 튜브에 3mL HBSS 2% FCS를 추가합니다.
3. 각 튜브에 CSFE 1 μL을 추가합니다(최종 농도- 5 μM).
4. 튜브를 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터로 10분 동안 배양합니다.
5. 튜브 3 및 4에서는 2.5 μg/mL의 최종 농도에서 HBSS 2% FCS + 안티 CD3 항체의 12mL을 추가합니다. 튜브 3 과 4항 CD3 항체를 사용하여 자극되고, 세포 주기에 미치는 영향을 관찰한다.
6. 튜브 1과 2에서 HBSS 2 % FCS의 12 mL을 추가합니다. 튜브 1과 2의 세포는 자극되지 않습니다.
7. 원심 분리기는 10 °C에서 7 분 동안 370 x g의 모든 튜브를 합니다. 초월체를 폐기합니다.
8. HBSS 2% FCS의 2mL에서 펠릿을 재중단합니다.
9. 결과 용액을 6웰 플레이트의 별도의 우물로 옮기.
10. 37°C에서 세포를 배양하고 3일 동안 5% CO_2를 배양합니다.

5. 셀 염색

1. 3일째에는 1, 3번면 2mL HBSS 2%FCS를 추가합니다.
2. 적극적으로 파이프와 5 mL FACS 튜브로 샘플을 전송합니다.
3. 37°C에서 나머지 세포를 우물 2-4, 5% CO_2에서계속 배양한다. 그(것)들은 세포 주기에 자극의 장기 효력을 조사하기 위하여 5일에 분석될 것입니다.
4. 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브원심분리기. 초월체를 폐기합니다.
5. 각 튜브에 항체 믹스 100 μL을 추가합니다(표 1참조).

표 1: 항체 혼합 조성물. 농축 항체 형광 접합및 HBSS를 사용하여 4개의 항체 칵테일 제제.

6. 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 튜브를 배양.
7. HBSS 2%FCS 1mL을 추가하고 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브원심분리기를 추가합니다.
8. 상체를 버리고 200 μL의 HBSS 2 % FCS에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
9. 재일시 중단된 펠릿을 새 FACS 튜브로 전송합니다.
10. FACS를 사용하여 T 세포 증식을 평가합니다.
11. 5일째에, 6웰 플레이트의 나머지 2개의 우물에서 세포로 세포 염색 과정을 반복한다.

6. 데이터 분석

1. "FlowJo"소프트웨어를 열고 파일을"모든 샘플"창으로 드래그합니다.
2. 3일째에 수집된 자극되지 않은 셀에 대한 파일을 두 번 클릭하여 Y 축에 전방 분산이 있는 점 플롯과 X 축의 측면 분산을 표시합니다.
3. "다각형"을클릭하고 림프구 세포, Thy1.2⁺ CD3⁺ 세포를 선택하고 CD4⁺ 및 CD8⁺ 셀을 구별하는 게이팅 전략을 만듭니다 (그림 1참조).

그림 1: 게이팅 전략. 세포는 그들의 형태에 따라 먼저 문이 됩니다 (왼쪽: FSC-A, SSC-A). T 셀은 게이트(중간: CD3, Thy1.2) CD4⁺ T 셀(주황색) 및 CD8⁺ T 셀(파란색) (오른쪽: CD4, CD8)에 더 나뉜다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 다른 파일로 단계를 반복합니다.
5. 분할 및 비분할 셀의 주파수를 확인하려면 먼저"레이아웃 편집기"를클릭하여 셀 모집단을 시각화합니다.
6. CD4 T 셀 및 CD8 T 셀을 각각 4개의 튜브에서"모든 샘플 창"으로드래그합니다.
7. 각 인구를 나타내는 그래프가 나타납니다.
8. 히스토그램을 사용하여 결과를 시각화하고"CFSE"를다른 튜브및 다른 집단의 비교를 위한 매개 변수로 선택합니다.
9. 비 분할 세포는 CFSE의 상부를 유지, 확산 세포는 세포를 분할CFSE의 내용을 분할하는 반면
10. 분할되지 않은 셀에 게이트를 만들고 모든 튜브에 적용합니다.
11. 셀 분할에 게이트를 만들고 모든 튜브에 적용합니다.
12. CD3+ 셀 분할 빈도를 검사하려면"테이블 편집기"를클릭합니다.
13. CD8 T 셀을 나누고 CD4 T 셀을 나누는 관심 있는 인구를"표"로드래그합니다.
14. "통계"메뉴에서"T 셀 의 주파수"를선택한 다음"테이블 만들기"를클릭하여 새 테이블에서 빈도를 표시합니다.
15. "테이블만들기"를클릭합니다. 주파수 값을 표시하려면 새 테이블에 나타납니다.