면역침전반응 기반 기술: 아가로스 비즈를 사용한 내인성 단백질의 정제

Overview

출처: 수잔나 C. 시슬러^1,토냐 J. 웹¹
¹ 미생물학 및 면역학학과, 메릴랜드 대학교 볼티모어, MD 21201

면역 침전물(IP, '풀다운' 분석이라고도 함)은 다양한 분야에서 응용 분야를 가지고 있는 널리 사용되는 기술이다. 1984년에 처음 구상된 이 요리는 1988년(1, 2)에 정제되었다. IP의 근본적인 목표는 그 단백질에 대하여 항체를 사용하여 특정 단백질의 정제 그리고 격리입니다. 단어 "면역"은 "강수량"이라는 단어가 용액에서 특정 물질을 당기는 것을 의미하는 동안 항체의 사용을 지칭한다. 표적 단백질은 내인성 또는 재조합일 지도 모릅니다. 대부분의 재조합 단백질에는 후속 정화를 단순화하기 위해 에피토프 태그(즉, myc 또는 flag)가 부착되어 있습니다. 전형적으로, 재조합 에피토프 태그에 대한 항체가 매우 강하고 효과적이기 때문에 재조합 단백질 IP를 최적화하는 것이 더 쉽습니다. 내인 성 단백질에 대한 항체는 매우 가변적 인 효능을 가지고 있어 이러한 IP를 최적화하기가 훨씬 더 어려워지게됩니다. 면역 침전 후 필요한 단계는 정화의 검증이다. 격리된 단백질은 SDS-PAGE를 사용하여 해결되고 그 후 서양 얼룩에 의한 순도를 위해 조사됩니다(그림 1). 중요한 대조군은 정확한 단백질의 당김을 확인하기 위해 서양 블롯 동안 다른 항체를 사용하는 것이다. IP와 후속 기술의 조합은 강력한 분석 도구입니다. 정제 후의 목표는 NMR, 질량 분광법 및 시험관 내 분석, 또는 단백질의 상호 작용 파트너(즉, 단백질, DNA, RNA)의 분석(즉, 단백질, DNA, RNA) (3, 4, 5)에 의해 단백질 자체의 특성화일 수 있다.

그림 1: 면역 침전 절차의 개요. 면역 침전은 항체를 사용하여 특정 단백질의 격리이다. 세포로부터 용재를 생산한 후, 두 가지 주요 단계-사전 정리 및 풀다운이 있습니다. 사전 클리어링 단계 동안, 세포-lysates는 isotype 대조군 항체를 사용하여 비특이적으로 항체에 결합하는 단백질의 미리 지워집니다. 당기면, 표적 단백질은 단백질 특이적 항체를 사용하여 아래로 당겨졌다. 고립 된 단백질은 서양 얼룩에 의해 분석됩니다. 동형 항체 및 단백질 특이적 항체는 동일한 상수 도메인을 가지지만, 상이한 항원 결합 도메인이 있다. 이 프로토콜의 핵심 성분은 항체의 일정한 도메인을 결합하는 단백질 A/G 아가로즈 구슬입니다 - 표적 단백질의 면역 침전을 허용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

항체는 다른 형태의 단백질 정제(즉, 니켈 친화 컬럼 정제)와 구별되는 면역 침전의 핵심 성분이다. 항체는 특정 단백질 에피토프를 인식할 수 있는 B 세포에 의해 만들어진 분자입니다. 항체에는 상수(Fc) 및 항원 결합(Fab)(도 1)의 두 가지 영역이 있습니다. 상수 도메인은 항체의 유형을 식별하고 생체 내에서기능을 지시한다. 일반적으로 IP에 사용되는 항체의 상수 영역은 마우스, 쥐 또는 토끼 IgG입니다. 항체의 항원 결합 부는 특정 단백질의 특정 에피토프를 인식한다. 항체는 단백질이 변성될 때 존재하지 않을 수 있는 접힌 단백질에 대한 전형체를 인식할 수 있고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 따라서, 에피토프의 가용성은 단백질 접이식에 달려 있습니다 - IP에 대한 항체 및 조건을 선택할 때 고려해야 할 중요한 요소를 식별합니다.

대핵계와 진핵계에는 항체 결합 단백질이 있습니다. 진핵 계통에서, 목적은 근생 계통에 있는 동안 박테리아로부터 면역 보호입니다, 목적은 면역 계통으로부터 보호입니다. 항체 결합 단백질은 두 가지 방법으로 IP 방법론에 영향을 미칩니다. 첫째, 항체를 결합하는 단백질의 용액을 제거하는 데 필요한 사전 정리 단계(도 1)가 있어 최종 제품에 비특이적 결합을 줄입니다. 이 단계는 단백질 특이적 항체와 는 다른 항체 결합 도메인과 동일한 상수 영역을 가지고 있는 동종형 항체를 사용합니다. 세균성 항체 결합 단백질은 이 방법의 두 번째 핵심 성분이다. 단백질 특이적 항체가 표적 단백질을 결합한 후, 항체: 단백질 복합체는 아래로 당겨져야 한다(도 1). 단백질 A, G 및 L은 항체의 일정한 도메인을 결합하는 세균성 단백질입니다. 박테리아는 면역 계통을 전복하기 위하여 이것을 사용하는 동안, 연구원은 쉬운 항체 정화를 위한 이 시스템을 공동 선택했습니다, 그리고 사전 정리 및 풀다운 단계 둘 다 도중 이용됩니다. 이 단백질은 다른 종 및 다른 일정한 도메인 하위형에 대한 상이한 결합 친화성을 가지고 있습니다 - IP를 위한 조건을 선택할 때 고려해야 할 또 다른 요인. 많은 회사에서 단백질 A/G 라벨아가로즈 구슬(그림 1), 미리 만들어진 스핀 컬럼 또는 수지를 판매하여 컬럼을 만듭니다. 일반적으로 구슬과 스핀 컬럼은 더 작은 샘플 크기에 사용되는 반면 수지는 대량 정화에 사용됩니다.

이 실험실 운동에서, 우리는 단백질 A/G 플러스 아가로즈 구슬 기지를 둔 기본적인 면역 침전 기술을 사용하여, 1 차적인 뮤린 흉구에서 내인성 단백질 c-myc를 정화하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 세포 용해 준비에서 시작하고 서양 얼룩 분석을 사용하여 성공적인 단백질 풀다운의 검증으로 끝납니다.

Procedure

1. 단백질 A/G 플러스 아가로즈 구슬을 이용한 면역 침전

세포 리세이트 제제

심심분리기 10⁸ 티모세포는 마이크로센심분리기에서 3분 동안 13,000rpm에 상복부를 제거합니다.
참고: 세포 수는 원하는 단백질과 선택한 세포 유형의 발현 수준에 따라 달라집니다.
PMSF를 통해 500 μL 용해 버퍼 RIPA에서 세포를 다시 일시 중단합니다.
소용돌이로 몇 가지 빠른 펄스를 사용하여 세포를 방해한 다음 주사기에 부착 된 25 G 바늘로 lysate을 몇 번 흡입하십시오.
참고: 거품을 만들지 마십시오. 더 큰 세포 모형을 위한 21G 바늘과 같은 더 큰 바늘을 사용하십시오.
10 분 동안 얼음에 세포 용해를 배양.
4°C에서 15분 동안 13,000rpm의 lysate원심분리기.
상체를 신선한 마이크로 센심 분리기 튜브로 옮기십시오.

사전 클리어링

20 μL 단백질 A/G PLUS 아가로즈 구슬과 등류형 대조군 항체의 1 μg(여기, 마우스 IgG1 동형 대조군 항체가 사용됨)를 용액에 첨가한다.
참고: 사용되는 동형 항체의 선택은 풀다운 단계에서 나중에 사용되는 단백질 특이적 항체에 의존할 것이다.
차가운 방(4°C)의 원심분리기 회전기에 lysate 믹스를 30분 동안 배양합니다.
4°C에서 30s의 3200 rpm에서 샘플을 원심분리합니다.
미리 클리어된 상체를 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기습니다. 펠릿을 버리십시오.

단백질 농도 측정

브래드포드 분석능력을 수행하여 세포 의 단백질 농도를 결정한다.
Aliquot 1000 μL 브래드포드 시약7 마이크로 센심 분리기 튜브로.
다음과 같은 양의 BSA 단백질 표준(2 mg/mL)을 튜브 6개(표 1)에 넣습니다.

튜브 번호	BSA 부피(μL) (2 mg/mL)	단백질 농도(μg/μL)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

표 1: BSA 단백질 표준 금액

7^번째 튜브에서 미리 지워진 lysate의 1 μL을 추가합니다.
참고: 샘플 농도가 분석 감지 범위 내에 있는지 확인하려면 1:2 또는 1:5 용액 희석을 준비하고 분석합니다.
7개의 튜브 각각에서 200 μL을 평평한 바닥의 개별 우물에 넣고, 96웰 플레이트는 각 샘플을 삼중으로 반복합니다.
595 nm에서 플레이트 리더의 접시를 읽으십시오.
표준 곡선을 엑셀로 생성하고 미리 지워진 lysate의 단백질 농도를 계산합니다.

아래로 당겨

이 예에서 c-myc인 '제어'로 두 개의 신선한 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브를 '제어'로 표시하고 다른 하나는 '테스트'로 레이블을 지정합니다.
미리 지워진 용해 500μg를 각 튜브에 넣습니다.
참고: 여기서 사용되는 단백질의 양은 정제되기를 원하는 단백질의 양에 따라 달라집니다.
리시스 버퍼를 사용하여 각 튜브의 총 부피를 최대 500 μL까지 끌어올수 있습니다.
시험단관에 항-c-myc 항체 2μg을 추가하고 2μg 마우스 IgG1 이소타입 대조군 항체를 대조군에 첨가한다.
참고: 항체의 양은 항체 효능 및 표적 단백질의 양에 따라 달라집니다.
차가운 방 (4 °C)의 회전에 튜브를 2 시간 동안 배양하십시오.
각 튜브에 20 μL 단백질 A/G PLUS 아가로즈 구슬을 추가합니다.
참고: 구슬의 손상을 방지하기 위해 끝 차단된 파이펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다.
하룻밤 동안 차가운 방 (4 °C)에서 회전에 배양하십시오.
참고: 표적 단백질및 항체 효능에 따라, 이 단계는 1시간에서 하룻밤사이에 달라질 수 있다.
30s 4°C의 경우 3200rpm의 튜브를 원심분리하여 구슬을 끌어당깁니다.
각 튜브에서 슈퍼네티드를 흡인합니다.
참고: 표적 단백질은 이제 구슬에 묶여 있습니다.
500 μL 1X 덜벡코의 PBS를 사용하여 구슬을 두 번 세척합니다.
30 s 4 °C의 경우 3200 rpm의 튜브원심분리기.
참고: 보다 엄격한 세척을 위해 RIPA와 같은 보다 엄격한 버퍼를 사용하십시오.
각 튜브에서 버퍼를 흡인합니다. 젤 로딩 팁을 사용하여 구슬에서 남은 버퍼를 제거하고 구슬을 얼음위에 두어 단백질을 엘로우시합니다.
참고: 이 예에서, 단백질은 서양 얼룩 분석을 위해 구슬을 끓여서 SDS-PAGE 실행 버퍼로 용출됩니다. 이 접근법은 IP 결과를 확인하거나 단백질 단백질 상호 작용을 검사하는 데 적합합니다. 구조적 또는 효소 분석을 위한 단백질의 정제와 같은 다른 다운스트림 응용 분야의 경우, 에피토프 태그(플래그 태그 또는 myc-tag)와 같은 보다 정교한 시스템은 관심 있는 단백질을 가진 항체의 용출을 피하기 위해 사용된다.

2. 웨스턴 블롯 분석을 통한 IP 검증

SDS 페이지 전기 포레시스:

20 μL SDS-PAGE 로딩 염료에서 β-메카토-에토놀을 포함하는 비드를 다시 일시 중단합니다.
샘플을 95°C에서 5분간 끓입니다.
원심 분리구는 실온에서 10 초 동안 13,000 rpm에서 구슬을 원심분리합니다.
젤 로딩 팁을 사용하여 구슬에서 얻은 샘플을 조심스럽게 파이프화하여 4-15 % 그라데이션 SDS-PAGE 젤의 우물에 로드하십시오.
샘플 외에도 단백질 사다리가 있는 차선과 미리 지워진 리세이트가 있는 차선을 적재하여 로딩 컨트롤로 작용합니다.
염료 전면이 젤의 바닥에 도달 할 때까지 100 V에서 실행 (~1h).

웨스턴 블롯 분석:

PVDF 멤브레인이 젤과 붉은 음극 사이에 있는지 확인, 웨스턴 블롯 샌드위치를 확인합니다.
100 V에서 1 시간 동안 전송합니다.
낮은 설정에서 로커에 1 h에 대한 실온에서 5 mL 차단 버퍼에 멤브레인을 배치, 비 특정 단백질 결합 부위를 차단합니다.
참고: 블로킹 버퍼, 1차 항체, 이차 항체 및 세차의 부피가 더 큰 크기의 블롯에 대해 증가해야 할 수도 있다.
블로우를 5mL 항-c-myc 항체로 낮은 설정에서 로커의 4°C에서 밤새 블로킹 버퍼에 배양합니다.
참고: 여기에 사용되는 항체는 풀다운 단계에서 사용되는 항체와 다릅니다.
5mL TBST를 사용하여 블로트 3-6번 세척할 수 있으며, 각 세척은 낮은 설정에서 로커의 실온에서 5분입니다.
HRP 태그된 래키 안티래빗 라이트 체인 이차 항체로 블롯을 버퍼블로 배양하고, 낮은 환경에서 로커의 실온에서 1h를 배양한다.
참고: 이차 항체의 선택은 서양 얼룩에 사용되는 1 차적인 항체에 달려 있습니다. 또한, 표적 단백질이 항체의 중사슬에 분자량이 가깝기 때문에 특정 이차광사슬이 프로토콜에 사용된다. 표적 단백질이 50kDa에 가까우면, 라이트 체인 특정 이차를 사용하십시오. 표적 단백질이 25kDa에 가까운 경우, 사용 및 중고 사슬 특정 이차.
5mL TBST를 사용하여 블로트 3-6번 세척할 수 있으며, 각 세척은 낮은 설정에서 로커의 실온에서 5분입니다.
여분의 액체를 제거하기 위해 실험실 와이프에 얼룩에서 액체를 제거하고 얼룩의 가장자리를 두드려.
1x 화학 발광 검출 시약으로 얼룩을 덮고 1 분 동안 배양하십시오.
참고: 감지 시약이 가볍고 시간에 민감하기 때문에 다음 단계를 신속하게 수행해야 합니다.
실험실 와이프에 블롯의 가장자리를 두드려 과도한 검출 시약을 제거합니다.
이미징 표면에 블롯을 놓습니다.
참고: 케미발광 얼룩도 필름을 사용하여 시각화할 수 있습니다.
'Chemiluminescent 프로그램'을사용하여 이미지를 사용하여 10초에서 5분까지 여러 시간 지점을 캡처합니다.
참고: 최적의 시간은 단백질 양과 항체의 품질에 따라 변경될 수 있습니다.
최적의 밴드 가시성을 가진 이미지를 선택한 다음 해당 이미지를 내보냅니다.
블롯을 이동하기 전에 이미저를 사용하여 블로트 사진을 찍어 사다리의 위치를 캡처합니다. 그런 다음 해당 이미지도 내보냅니다.
슬라이드 준비 소프트웨어(예: 파워포인트)를 사용하여 밴드와 래더 이미지를 정렬하여 단일 이미지를 형성합니다.

Results

위에 자세히 설명된 절차의 결과는 그림 2에 나와 있습니다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 차선에는 대조군(isotype), 시험 군(c-myc), 미리 지워진 용해(lysate), 분자량 사다리(사다리)가 포함됩니다. 25 kDa 래더 밴드가 표시됩니다. ~25 kDa 및 50 kDa의 두 개의 눈에 띄는 밴드는 결합 항체의 빛과 무거운 사슬이며, 각각 IP 또는 샘플에 특이적이지 않습니다. c-myc 단백질은 서양 얼룩에서 약 67kDa를 실행하고 일반적으로 바로 아래 볼 수 있습니다 75 kDa 사다리 밴드. 이 블롯에서 c-myc 대역은 두 번째 차선에서 볼 수 있지만 첫 번째 차선에는 존재하지 만 IP 항체가 성공적으로 c-myc를 끌어 내렸다는 것을 나타냅니다. 미리 지워진 용해 차선에는 눈에 보이는 밴드가 없기 때문에 이 단백질은 내인성 발현 수준이 낮다는 것을 시사합니다.

그림 2: 면역 침전에 의한 c-myc의 정제를 평가하는 데 사용되는 웨스턴 블롯 분석의 결과. c-myc에 대응하는 67 kDa의 밴드는 항 c-myc 레인에서 볼 수 있지만 등류형 제어 차선은 볼 수 없습니다. c-myc 수준은 lysate 차선에서 시각화될 만큼 높지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Application and Summary

요컨대, 면역 침전은 항체를 이용한 특정 단백질의 분리이다. 이 예에서, 면역 침전의 결과는 순도를 평가하기 위해 서양 블롯에 의해 분석되었다. 고립 된 단백질은 단백질 구조를 위한 NMR, 아미노산 서열에 대한 질량 분광법 또는 효소 특성화를 위한 체외 분석 등 여러 가지 응용 분야에서 사용될 수 있습니다. IP는 또한 단백질의 상호 작용 파트너를 특성화할 수 있습니다. 예를 들면, 격리를 따르는, DNA 또는 RNA는 순서를 위해 격리될 수 있었습니다. 공동 면역 전성은 단백질 단백질 상호 작용을 평가합니다. 표적 단백질이 IP 도중 아래로 당길 때, 상호 작용하는 단백질은 또한 아래로 당길 수 있습니다. 이러한 상호 작용 파트너는 질량 분석 및 서양 얼룩에 의해 평가 될 수있다. 면역 강수량은 단백질 생물학을 연구하기위한 강력한 기술입니다.

References

Olliver, C. L. and Boyd, C. D. (1984). Immunoprecipitation of In Vitro Translation Products with Protein A Bound to Sepharose. In J. M. Walker (eds), Nucleic Acids. Methods in Molecular Biology (pp. 157-160). New Jersey: Humana Press.
Thurston, C. F. and Henley, L. F. (1988). Direct Immunoprecipitation of Protein. In J. M. Walker (eds), New Protein Techniques. Methods in Molecular Biology (pp. 149-158). New Jersey: Humana Press.
Anderson, N. G. (1998). Co-immunoprecipitation: Identification of Interacting Proteins. In R. A. Clegg (eds), Protein Targeting Protocols.Methods in Molecular Biology (pp. 35-45). New Jersey: Humana Press.
Jackson, D. I. and Dickson, C. (1999). Protein Techniques: Immunoprecipitation, In Vitro Kinase Assays, and Western Blotting. In P.T. Sharpe and I. Mason (eds), Molecular Embryology. Methods in Molecular Biology (pp. 699-708). New Jersey: Humana Press.
Trieu, E. P. and Targoff, I. N. (2015). Immunoprecipitation: Western Blot for Proteins of Low Abundance. In B. Kurien and R. Scofield (eds), Western Blotting. Methods in Molecular Biology (pp. 327-342). New York, NY: Humana Press.

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1. 단백질 A/G 플러스 아가로즈 구슬을 이용한 면역 침전

세포 리세이트 제제

심심분리기 10⁸ 티모세포는 마이크로센심분리기에서 3분 동안 13,000rpm에 상복부를 제거합니다.
참고: 세포 수는 원하는 단백질과 선택한 세포 유형의 발현 수준에 따라 달라집니다.
PMSF를 통해 500 μL 용해 버퍼 RIPA에서 세포를 다시 일시 중단합니다.
소용돌이로 몇 가지 빠른 펄스를 사용하여 세포를 방해한 다음 주사기에 부착 된 25 G 바늘로 lysate을 몇 번 흡입하십시오.
참고: 거품을 만들지 마십시오. 더 큰 세포 모형을 위한 21G 바늘과 같은 더 큰 바늘을 사용하십시오.
10 분 동안 얼음에 세포 용해를 배양.
4°C에서 15분 동안 13,000rpm의 lysate원심분리기.
상체를 신선한 마이크로 센심 분리기 튜브로 옮기십시오.

사전 클리어링

20 μL 단백질 A/G PLUS 아가로즈 구슬과 등류형 대조군 항체의 1 μg(여기, 마우스 IgG1 동형 대조군 항체가 사용됨)를 용액에 첨가한다.
참고: 사용되는 동형 항체의 선택은 풀다운 단계에서 나중에 사용되는 단백질 특이적 항체에 의존할 것이다.
차가운 방(4°C)의 원심분리기 회전기에 lysate 믹스를 30분 동안 배양합니다.
4°C에서 30s의 3200 rpm에서 샘플을 원심분리합니다.
미리 클리어된 상체를 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기습니다. 펠릿을 버리십시오.

단백질 농도 측정

브래드포드 분석능력을 수행하여 세포 의 단백질 농도를 결정한다.
Aliquot 1000 μL 브래드포드 시약7 마이크로 센심 분리기 튜브로.
다음과 같은 양의 BSA 단백질 표준(2 mg/mL)을 튜브 6개(표 1)에 넣습니다.

튜브 번호	BSA 부피(μL) (2 mg/mL)	단백질 농도(μg/μL)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

표 1: BSA 단백질 표준 금액

7^번째 튜브에서 미리 지워진 lysate의 1 μL을 추가합니다.
참고: 샘플 농도가 분석 감지 범위 내에 있는지 확인하려면 1:2 또는 1:5 용액 희석을 준비하고 분석합니다.
7개의 튜브 각각에서 200 μL을 평평한 바닥의 개별 우물에 넣고, 96웰 플레이트는 각 샘플을 삼중으로 반복합니다.
595 nm에서 플레이트 리더의 접시를 읽으십시오.
표준 곡선을 엑셀로 생성하고 미리 지워진 lysate의 단백질 농도를 계산합니다.

아래로 당겨

이 예에서 c-myc인 '제어'로 두 개의 신선한 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브를 '제어'로 표시하고 다른 하나는 '테스트'로 레이블을 지정합니다.
미리 지워진 용해 500μg를 각 튜브에 넣습니다.
참고: 여기서 사용되는 단백질의 양은 정제되기를 원하는 단백질의 양에 따라 달라집니다.
리시스 버퍼를 사용하여 각 튜브의 총 부피를 최대 500 μL까지 끌어올수 있습니다.
시험단관에 항-c-myc 항체 2μg을 추가하고 2μg 마우스 IgG1 이소타입 대조군 항체를 대조군에 첨가한다.
참고: 항체의 양은 항체 효능 및 표적 단백질의 양에 따라 달라집니다.
차가운 방 (4 °C)의 회전에 튜브를 2 시간 동안 배양하십시오.
각 튜브에 20 μL 단백질 A/G PLUS 아가로즈 구슬을 추가합니다.
참고: 구슬의 손상을 방지하기 위해 끝 차단된 파이펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다.
하룻밤 동안 차가운 방 (4 °C)에서 회전에 배양하십시오.
참고: 표적 단백질및 항체 효능에 따라, 이 단계는 1시간에서 하룻밤사이에 달라질 수 있다.
30s 4°C의 경우 3200rpm의 튜브를 원심분리하여 구슬을 끌어당깁니다.
각 튜브에서 슈퍼네티드를 흡인합니다.
참고: 표적 단백질은 이제 구슬에 묶여 있습니다.
500 μL 1X 덜벡코의 PBS를 사용하여 구슬을 두 번 세척합니다.
30 s 4 °C의 경우 3200 rpm의 튜브원심분리기.
참고: 보다 엄격한 세척을 위해 RIPA와 같은 보다 엄격한 버퍼를 사용하십시오.
각 튜브에서 버퍼를 흡인합니다. 젤 로딩 팁을 사용하여 구슬에서 남은 버퍼를 제거하고 구슬을 얼음위에 두어 단백질을 엘로우시합니다.
참고: 이 예에서, 단백질은 서양 얼룩 분석을 위해 구슬을 끓여서 SDS-PAGE 실행 버퍼로 용출됩니다. 이 접근법은 IP 결과를 확인하거나 단백질 단백질 상호 작용을 검사하는 데 적합합니다. 구조적 또는 효소 분석을 위한 단백질의 정제와 같은 다른 다운스트림 응용 분야의 경우, 에피토프 태그(플래그 태그 또는 myc-tag)와 같은 보다 정교한 시스템은 관심 있는 단백질을 가진 항체의 용출을 피하기 위해 사용된다.

2. 웨스턴 블롯 분석을 통한 IP 검증

SDS 페이지 전기 포레시스:

20 μL SDS-PAGE 로딩 염료에서 β-메카토-에토놀을 포함하는 비드를 다시 일시 중단합니다.
샘플을 95°C에서 5분간 끓입니다.
원심 분리구는 실온에서 10 초 동안 13,000 rpm에서 구슬을 원심분리합니다.
젤 로딩 팁을 사용하여 구슬에서 얻은 샘플을 조심스럽게 파이프화하여 4-15 % 그라데이션 SDS-PAGE 젤의 우물에 로드하십시오.
샘플 외에도 단백질 사다리가 있는 차선과 미리 지워진 리세이트가 있는 차선을 적재하여 로딩 컨트롤로 작용합니다.
염료 전면이 젤의 바닥에 도달 할 때까지 100 V에서 실행 (~1h).

웨스턴 블롯 분석:

PVDF 멤브레인이 젤과 붉은 음극 사이에 있는지 확인, 웨스턴 블롯 샌드위치를 확인합니다.
100 V에서 1 시간 동안 전송합니다.
낮은 설정에서 로커에 1 h에 대한 실온에서 5 mL 차단 버퍼에 멤브레인을 배치, 비 특정 단백질 결합 부위를 차단합니다.
참고: 블로킹 버퍼, 1차 항체, 이차 항체 및 세차의 부피가 더 큰 크기의 블롯에 대해 증가해야 할 수도 있다.
블로우를 5mL 항-c-myc 항체로 낮은 설정에서 로커의 4°C에서 밤새 블로킹 버퍼에 배양합니다.
참고: 여기에 사용되는 항체는 풀다운 단계에서 사용되는 항체와 다릅니다.
5mL TBST를 사용하여 블로트 3-6번 세척할 수 있으며, 각 세척은 낮은 설정에서 로커의 실온에서 5분입니다.
HRP 태그된 래키 안티래빗 라이트 체인 이차 항체로 블롯을 버퍼블로 배양하고, 낮은 환경에서 로커의 실온에서 1h를 배양한다.
참고: 이차 항체의 선택은 서양 얼룩에 사용되는 1 차적인 항체에 달려 있습니다. 또한, 표적 단백질이 항체의 중사슬에 분자량이 가깝기 때문에 특정 이차광사슬이 프로토콜에 사용된다. 표적 단백질이 50kDa에 가까우면, 라이트 체인 특정 이차를 사용하십시오. 표적 단백질이 25kDa에 가까운 경우, 사용 및 중고 사슬 특정 이차.
5mL TBST를 사용하여 블로트 3-6번 세척할 수 있으며, 각 세척은 낮은 설정에서 로커의 실온에서 5분입니다.
여분의 액체를 제거하기 위해 실험실 와이프에 얼룩에서 액체를 제거하고 얼룩의 가장자리를 두드려.
1x 화학 발광 검출 시약으로 얼룩을 덮고 1 분 동안 배양하십시오.
참고: 감지 시약이 가볍고 시간에 민감하기 때문에 다음 단계를 신속하게 수행해야 합니다.
실험실 와이프에 블롯의 가장자리를 두드려 과도한 검출 시약을 제거합니다.
이미징 표면에 블롯을 놓습니다.
참고: 케미발광 얼룩도 필름을 사용하여 시각화할 수 있습니다.
'Chemiluminescent 프로그램'을사용하여 이미지를 사용하여 10초에서 5분까지 여러 시간 지점을 캡처합니다.
참고: 최적의 시간은 단백질 양과 항체의 품질에 따라 변경될 수 있습니다.
최적의 밴드 가시성을 가진 이미지를 선택한 다음 해당 이미지를 내보냅니다.
블롯을 이동하기 전에 이미저를 사용하여 블로트 사진을 찍어 사다리의 위치를 캡처합니다. 그런 다음 해당 이미지도 내보냅니다.
슬라이드 준비 소프트웨어(예: 파워포인트)를 사용하여 밴드와 래더 이미지를 정렬하여 단일 이미지를 형성합니다.

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0:01

Concepts

3:25

Immunoprecipitation Using Protein A/G Plus Agarose Beads

8:18

IP Verification Through Western Blot Analysis

12:36

Results

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