저자는 원고에게 유용한 의견, 다니엘라 탈러 및 Margaretha 천 hwirth 기술 지원, 언어 편집을위한 모니카 패럴, UWE 랑, 마짓 Holzapfel 및 산과학학과에서 산드라 Eppich에 대한 pHPL, 에바 Rohde과 니콜 호프만를 제공 Katharina Schallmoser 감사 코드를 제공. 이 작품은 오스트리아 연구 재단 (FWF, DS 부여 N211 - 할머니), 오스트리아 연구 진흥 공사 (FFG, DS 부여 N200)와 성인 줄기 세포 연구 재단 (AR)에 의해 지원되었습니다. AR는 그라츠의 의과 대학의 박사 과정 분자 의학의 동료입니다.

1 부 : 설정 1. 세포 배양 매체의 준비 매체 준비를 시작하기 전에 모든 자료 및 필요한 도구를 수집합니다. 해동이 풀링 인간의 혈소판 lysate의 X 56 ML aliquots (pHPL, 자수 성 가한 : 참조 1 &amp; 조브 # 1523), 100x 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션, 2의 10 ML L - 글루타민의 X 5 ML (시그마 모두). EGM - 2 중간 (Lonza) 1 병 (500 ML)를 보완을위한 조정 시토킨과 성장 인자의 aliquots을 (VEGF, bFGF, EGF, IGF 하이드로코티손, Amphotericin는 &#39;단일 quots&#39;로 제공 아스코르비 산, 헤파린) 해동. 냉장고 한 500 ML 병 각 (I) 최소한의 필수적인 매체 알파 - 수정 (A - 멤)과 (ii) 본 내피 기초 매체 (EBM)을 가져가라. 다음 단계의 모든 무균 조건 하에서 층류 조직 문화 후드에서 수행됩니다. 멸균 물 1,000 IU / ML의 최종 농도에 분말을 분해하여 방부제없는 헤파린 (예, Biochrom) 준비. MSC - 중간 : A - 멤 500 ML을 사용하여 해동 pHPL 56 ML (또한 자세한 내용은 1 참조 참조) 2 IU / ML (재고 솔루션의 μl = 224) 방부제없는 헤파린의을 (의 clumping을 통해 매체의 응고를 방지 추가 플라즈마에있는 섬유소)는 10 % pHPL의 최종 농도에 도달합니다. 또한 페니실린 (100U/mL) / 스트렙토 마이신 (100μg/mL) 솔루션과 L - Glutamin의 2mM을 (시그마 모두) 추가합니다. 20 μm의 기공 크기 - 진공 필터 (Millipore)을 통해 매체를 필터링합니다. (내용, 날짜) 적절하게 병을 라벨. ECFC - 중간 : 시토킨 - aliquots, 방부제없는 헤파린의 pHPL, 10 IU / ML (재고 솔루션 = 1120μl) 56 ML 페니실린 (100U/mL) / 스트렙토 마이신 (100 추가 EBM 한 병 (500 ML)를 사용하여 G / ML) 솔루션과 20 μl - 기공 크기의 진공 필터 (Millipore)와 기저 매체와 필터 L - Glutamin의 2mM. (내용, 날짜) 적절하게 병을 라벨. 2. 수술 악기 살균 집게, 가위와 메스 수술 자의 날카로운 한 쌍의 열이 소독 살균 광석 disposables해야합니다. 3. 코드 수집 튜브의 준비 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브 (팔콘) 무료로 헤파린과 PBS 20 ML의 최종 볼륨 조정 - 방부제 500 IU를 추가합니다. 배달 방에 튜브를 전송합니다. 4. 정보 동의 (해당 지역 윤리위원회 또는 IRB에서 확인). 그들은 코드의 조각을 기부하고 적절하게 그것이 될 것입니다 목적을 알려하려는 경우 이전에 배달하는 부모에게 물어보십시오. 5. 코드 기증 태반과 탯줄의 전달 및 검사는 10cm의 조각을 잘라 즉시 코드 혈관 내부에 남아있는 혈액의 응고를 방지하기 위해 헤파린과 prefilled하여 튜브로 전송 후. 가능한 한 빨리 세포 격리으로 계속합니다. 2 부 : 휴대 절연 <ol><li> Incidin 또는 70 % EtOH로 표면을 청소하여 층류 조직 문화 후드를 준비합니다. 플레이스 무균 150cm 2 세포 배양 접시, 75cm의 세포 배양 flasks (코닝 모두), PBS는 수술기구, 세포기구, 튜브 홀더, 25 ML stripettes 및 청소 모자에 적절하게 뭉툭한 끝 바늘을 갖춘 5 ML 주사기를 소독. </li><li> 사전 따뜻한 당신의 준비 α - 멤 및 EGM - 2 37 세포 배양 매체 ° C 물 목욕 인치 </li><li> 출산 실에서 세포 배양 후드가 장착된 귀하의 연구실에 코드를 가져와. 층류 흐름에 코드를 전송 후 혈액 세포를 오염 제거하는 (새 접시에 전송하여) PBS로 두 번 씻는다. 코드의 다른 쪽 끝을 나오는 액체까지 PBS와 뭉툭한 끝을 바늘을 갖춘 무균 5mL 주사기로 한쪽에 canulating 후 제대 정맥 린스하면 (붉은 혈액 오염을 나타냅니다) 완전히 투명하게됩니다. </li></ol> ECFCs : <ol start="4"><li> 75cm 2 플라스크 (코닝)를 준비, 그것을 분류하고 미리 예열 EGM - 2 매체의 15-20 ML 입력합니다. </li><li> 멸균 PBS로 가득 새 접시에 코드를 삽입합니다. 외과 가위를 가지고 길이 약 5cm의 두 조각 (제대 혈관이 자신의 축을 따라 꼬여 있기 때문에 짧은 조각은 프로세스에 쉽게)에 탯줄을 잘라. </li><li> 배꼽 정맥 (대형 선박)을 찾으려고 당신의 외과 가위 중 하나 블레이드를 삽입하고 길이 방향 정맥을 잘라. 당신이 더 컷 동안 조수 두 집게로 이미 절단 정맥을 보유할 수있다면이 시점에서 그것은 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 코드 파이 플레이스CE는 PBS없이 새 접시에 자른 정맥과 세포 스크레이퍼 한 끝에서 다른 rubbings하여 제대 정맥의 내부 (내피) 표면의 다쳤어요 가져가라. 매체에 스크레이퍼의 팁을 청소하여 준비 플라스크에 세포를 전송합니다. 이 절차를 적어도 10 번 반복합니다. </li><li> 당신의 휴대용 술병을 닫고에 넣어 배양기 (37 ° C 5 % CO 2, 95 % 습도). </li></ol> MSCS : <ol start="4"><li> 150cm 두 문화 플레이트 (코닝)을 준비하고 레이블을 붙입니다. </li><li> 코드의 조각을 (내피 층을 근근이 살아가고 이후) 타고 살균 및 멸균 메스 가위를 사용하여 매우 작은 조각으로 전체 코드를 잘라. 코드 조각의 최대 크기는 1~2mm해야합니다. </li><li> 예약 표시 문화 판에 멸균 포셉하여 코드 조각을 전송합니다. 판 중간 차오르고 전에 5 분 동안 열어두고으로 플라스틱 표면에 조각의 첨부 파일이 강화됩니다. </li><li> 코드 조각은 플라스틱에 적절하게 연결되면, 부드럽게 멤으로 바뀌었 사전 예열 알파의 30-35 ML에 추가합니다. 모든 조각이 붙어 남아 있는지 확인하기 위해 낮은 속도를 사용해 봅니다. </li><li> 접시를 닫고에 넣어 배양기 (37 ° C 5 % CO 2, 95 % 습도). </li></ol> 파트 3 : 셀 확장 및 유동세포계측법에 의해 면역 - 표현형의 확인 셀 확장 EFCFs : <ol><li> 거꾸로 현미경 및 교환에 대한 내피 세포의 부착 다음날 체크 전체 EGM - 2 이외의 모든 연결된 세포 및 입자 제거하는 매체. </li><li> 매체의 합류와 교환 삼분의 일 일주일에 두 번 때까지 전지를 확장합니다. 합류에 도달하면, 0.05 % Trypsin/0.7 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)으로 세포를 분리하고 새로운 문화 선박에게 전송할 수 있습니다. 귀하의 T75 플라스크 내에서 세포의 숫자에 따라 추가 확장을위한 낮은 시딩 밀도를 보장하는 새로운 flasks의 크기와 숫자를 선택해야합니다. </li><li> 세포의 확장하는 동안 중간 일주일에 두 번 교환 삼분의 일. </li></ol> MSCS : <ol><li> 코드에서 MSCS의 가지는 많은 시간이 걸릴 것입니다, 그래서 당신은 첨부된 조직 조각의 주변에서 스핀들 모양의 세포의 모양에 대해 거꾸로 현미경을 확인까지 적어도 3~4일 기다릴 수 있습니다. 충분한 세포 밖으로 성장이 때, 조각들은 플라스틱과 접촉을 잃고 있기 때문에 분리하는 경향이있다. </li><li> 10-12일이 조직 조각을 제거한 후 0.05 % Trypsin/0.7 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 플라스틱에서 MSCS를 분리하고 새로운 문화 선박에게 전송할 수 있습니다. 당신이 더 확장을 위해 낮은 시딩 밀도를 보장하는 새로운 flasks의 크기와 수를 결정해야합니다 접시 내에서 세포의 크기에 따라 다릅니다. </li><li> 세포의 확장하는 동안 중간 일주일에 두 번 교환 삼분의 일. </li></ol> 유동세포계측법 장비 필요 : 흐름 cytometer (BD FACSCalibur), micronic 튜브 (코닝), 튜브 홀더, 양 혈청 (시약을 차단), Eppifuge (Eppendorf), 단클론 항체 MSCS : CD45, CD14, CD19, HLA - DR, CD31, CD73, CD90, CD105, isotype 컨트롤 ECFCs : CD45, CD14, CD19, HLA - DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, isotype 컨트롤 <ol><li> 합류에 도달 후, 4 7 분 300g에 0.05 % Trypsin/0.7 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 원심 분리기로 세포를 분리 ° C. </li><li> 수정 PBS 10 % 4 20 분 V / V 양 혈청 ° C.와 블록 unspecific 항체 바인딩에 1x10 6 셀 / ML의 농도로 세포를 Resuspend </li><li> micronic 튜브를 라벨 및 라벨 형광 항체의 적절한 농도를 추가합니다. </li><li> 각각의 튜브에 세포 현탁액 (차단) 50 μl를 추가하고 4 30 분 품어 ° C. </li><li> 구속력 항체를 제거하기 위해 수정 PBS를 추가하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 흐름 cytometer에 표시된 세포로 이동하여 분석을 수행합니다. </li></ol> 4 부 : ECFC 식민지의 성장, 고정, 얼룩 및 계층 분석 <ol><li> 종자 세포 배양 접시에 cm2 당 3 또는 10 세포의 매우 낮은 도금 밀도에 거의 순수 수확 ECFCs 단일 콜로니 성장 수 있습니다. </li><li> 매체 일주일에 두 번 교환 삼분의 일. </li><li> 십사일은 (문화의 끝) 매체를 제거한 후 PBS로 두 번 씻어 얼음 차가운 고정 솔루션 (아세톤 2 : 메탄올 = 3)으로 식민지를 수정 냉장고에 15 분. </li><li> 고정 솔루션을 버리고 접시 10 분 동안 건조 열어두고. </li><li> 10 분 증류수로 세포 Rehydrate. </li><li> 해리스 Hematoxylin 솔루션을 추가 12 분 동안 고정 식민지를 얼룩. </li><li> H matoxylin 솔루션을 제거하고 남은 얼룩 솔루션 없애 수돗물로 씻어 접시. </li><li> 각 식민지의 사진을 찍어stereomicroscope 및 가져오기를 사용하여 *. JPG 또는 귀하의 컴퓨터에 *. TIF 형식의 파일을. </li><li> ImageJ 소프트웨어로 사진을 열고 애니메이션에서 설명한대로 각 식민지의 정확한 휴대폰 번호를 분석합니다. </li><li> ImageJ 소프트웨어를 열고 풀다운 메뉴에서 &#39;파일 \ 열기&#39;기능을 사용하여 식민지 이미지를 가져옵니다. </li><li> 함수 &#39;\ 빼기 배경 프로세스&#39;를 사용하여 진행 </li><li> 식민지의 마진을 표시 ImageJ 메뉴에서 &#39;* * 또는 타원형 브러쉬 선택&#39;기능을 사용하십시오. </li><li> &#39;편집 \ 밖에는&#39;기능과 자르기 &#39;\ 자르기 이미지&#39;를 선택하여 사진을 사용하여 주변 이미지를 지웁니다. </li><li> 사용하여 수동으로 임계값을 조정 &#39;이미지 \ \ 임계값 조정&#39;모든 세포가 완전히 붉은 색 있도록 기능을. </li><li> &#39;분석 \ 분석 입자&#39;를 선택하여 식민지의 휴대폰 번호를 계산합니다. 적절한 설정 (각 세포 유형에 대한 최적화)를 선택하고 &#39;확인&#39;을 선택합니다. 셀 계산 및 계산 세포의 해당 윤곽선을 포함하는 새로운 이미지를 포함한 결과 상자가 나타납니다. <img src="/files/ftp_upload/1525/1525op2.jpg" alt="그림 1" /></li></ol>

<ol>
	<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+can+replace+fetal+bovine+serum+for+clinical-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stromal+cells.">Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells.</a> Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+system+to+propagate+cord+blood-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+clinical+application.">Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.</a> Regen Med. 2, 371-382 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo.">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. 113, 6716-6725 (2009).</li><li>Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+preclinical+production+of+human+lineage-negative+cells+for+regenerative+stem+cell+therapy.">Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy.</a> Transfusion. 45, 315-326 (2005).</li></ol>

저자는 선언에 관심의 금융 충돌이 없습니다.

골수, 지방 조직, 코드 혈액 등 MSCS 또는 ECFCs를 얻을 수있는 소스에서 다양한있다 그것은 동일한 소스에서 progenitors 두 가지 유형의 직접 조직과 혈관 재생 또는 종양 진행에 기여와 같은 프로세스에서 다른 세포 유형의 개입을 비교 얻을 필요합니다. 분리하고 이후 같은 기증자로부터 ECFCs 및 MSCS의 autologous 쌍을 공부하는 데 쉽게 개별 실험 이내에 기증?...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>alpha modified MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-GLutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EBM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Single cytokine quots</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>75 cm2 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>150 cm2 plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell scraper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin/EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monoclonal antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>500 mL filter 20 &mu;m pore size </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Preservative free heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (mscs) and endothelial colony forming progenitor cells (ecfcs)

탯줄은 mesenchymal stromal 세포 (또한 칭했다 mesenchymal 줄기 세포, MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)를 포함하여 높은 proliferative 가능성 전구 세포에 대한 풍부한 소스입니다. 두 세포 유형은 조직의 무결성을 유지하는 핵심 선수이며, 아마도 이것도 재생 프로세스와 종양 형성에 관여하고 있습니다. 비교 방식으로 자신의 생물학과 기능을 연구하기 위해이 같은 기증자에서 사용할 수 두 세포 유형을 가지고하는 것이 중요합니다. 또한 같은 조직에서 MSCS와 ECFCs를 추출 재생 목적을 위해 도움이 될 수 있습니다. 세포 치료제 결국 벤치에서 병상 그들의 방법을 발견해야하기 때문에 우리가 분리하는 새로운 방법을 설립하여 추가로 동물 단백질을 사용하지 않고 전구 세포를 확장합니다. 풀링 인간의 혈소판의 lysate (pHPL)는 완전히 xenogeneic 단백질로 세포의 접촉을 방지하기 위해 프로토콜의 모든 단계에서 태아 소 혈청을 대체. 이 동영상은 하나의 탯줄에서 전구 세포의 분리 및 확장을위한 방법을 보여줍니다. 모든 자료와 절차가 설명됩니다.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

isolation-animal-serum-free-expansion-human-umbilical-cord-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

15.4K 조회수.  Medical University of Graz, Austria. 이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

비디오: Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

인간 제대 베인 내피 세포의 절연 (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

연구

생물학

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

분리 및 랫 Mesenchymal 줄기 세포의 농축 (MSCS)와 MSCS를 유래 단일 식민지의 분리

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

인간의 탯줄 아티 평활근 세포 절연 (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

내피 콜로니 형성 세포의 Phenotypic 및 기능성 특성은 인간 탯줄의 혈액에서 유래

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

CD146의 분리<sup&gt; +</sup쥐 폐에서&gt; 주민 폐 중간 엽 기질 세포

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...