저희 실험실의 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램, 알코올 남용과 알코올 중독에 국립 연구소에 의해 지원됩니다.

<html> 주사 I. 준비 이 섹션에서는 뉴런의 핵으로 cDNA 주입하기 전에 이동해야하는 준비 단계를 설명합니다. 뉴런에 절연 절차는이 문서의 범위를 벗어나지만, 그것은 각각의 세포에 dissociated 뉴런을 가지고 있으며 (이것을 달성하기위한 유용한 정보에 대한 토론 참조) 35mm의 세포 배양 접시의 바닥 표면에 잘 준수하는 것이 중요합니다. 다른 뉴런의 다양한 잠재적으로 사용될 수 있지만 그들이 편리하게 이용할 수 있으며, 뉴런의 다수를 얻을 수 있기 때문에, 그러한 우수한 경추 신경 (SCG) 또는 지느러미 루트 신경으로 말초 신경은 해부 선호하고 있습니다. SCG 뉴런을 사용하는 추가적인 장점들은 세포의 비교적 동질적인 인구 것을하고 1,2,3,4를 잘 묘사. 주사에 대한 cDNA 플라스미드의 A. 준비 <ol><li> 오염이나 DNA의 고장을 방지하기 위해, 장갑은 준비 기간 동안 착용해야합니다. </li><li> 관심의 단백질을 인코딩 DNA는 고도와 constitutively 활성 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 발기인의 규정에 따라 이러한 PCI (Promega, 매디슨, WI)와 같은 적당한 포유 동물 발현 벡터,에 subcloned입니다. 단백질이 표시되지 않는 경우, 플라스미드 기자 예를 들어, 인코딩 EGFP는 (pEGFP - N1, BD Biosciences Clontech, 팔로 알토, CA), 성공적인 분사와 표현을 확인하는 공동 주입이다. DNA은의 입자를 제거하는 PVDF 필터 (0.1 μm의, Millipore, 베드 포드, MA)와 원심 필터 장치를 사용하여 고품질의 분리 칼럼 (예 : QIAfilter 미디 준비 키트, Qiagen, 챗스워스, CA)와 더 정화를 사용하여 격리 사출 과정에서 사출 pipets 방해가 될 수 있습니다 플라스미드 준비. Plasmids는 적절한 DNA 저장 버퍼 (: 10 MM 트리스, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0 예 : TE 버퍼)에 약 1 μg / μl의 농도에서 -20 ° C에 저장됩니다. </li><li> microinjection 즉시 이전, 플라스미드 cDNAs는 TE 버퍼 또는 H 2 O.에서 원하는 최종 농도로 희석 및 혼합 일반적으로 50-10 NG / 리포터 유전자의 μl가 주입된 세포를 분류하기 위해 충분하고, DNA가 높은 농도에서 점성이며 사출 pipets을 방해할 수 있기 때문에 주입하는 cDNA의 총 농도는 200 NG / μl를 초과해서는 안됩니다. 분사에 대한 cDNA의 작은 볼륨 (5-10 μl)가 Parafilm (종이 후원 아래 쪽)의 작은 조각의 깨끗한 표면에 솔루션의 혼합 방울에 의해 준비가되어 있습니다. pipetor로 여러 번을 pipeting 아래에서 함께 솔루션의 방울을 혼합하고 혼합하는 동안 공기 방울을 도입하지 마십시오. </li><li> microloader의 pipet 팁을 (Eppendorf, Brinkmann 인 스트 루먼트, 베리, NY)를 사용하여, 특별히 준비 혈소판 튜브 (피셔 과학, 피츠버그, PA)에 cDNA 솔루션을 전송합니다. 혈소판 튜브 (자료 표) 준비에 대한 지침 자료 섹션을 참조하십시오. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 cDNA 사출 솔루션을 포함하고있는 혈소판 튜브를 놓습니다. </li><li> 실내 온도 (20-24 ° C) 침전 입자로 cDNA 솔루션을 차단할 수에서 고정 각도 또는 스윙 버킷 로터 (Eppendorf)이 장착된 microcentrifuge 10 000g에 15-30 분 튜브를 원심 분리기 microinjection pipet. cDNA 분사 솔루션은 사출 세션 동안 실온에서 보관하실 수 있습니다. </li></ol> 사출 pipets의 B. 제작 <ol><li> 일회용 유리 microinjection의 pipets은 (microinjection의 pipet 당 $ 10) 편리하지만 비싼되는 (예 : Femtotips, Eppendorf) 상업적으로 사용할 수 있습니다. 사출 pipets는 프로그램 P - 97 플라밍 브라운 pipet의 풀러 (서터 악기 회사 노바토, CA)와 filamented, 얇은 벽으로 borosilicate 유리 모세관 튜브 (세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다)를 사용하여 실험실에서 제조 수 있습니다. 이 옵션은 더 비용 효율적인 있으며, microinjection의 pipet의 모양과 크기의 제어를위한 수 있습니다. </li><li> 2 단계 프로그램은 좁은 microinjection의 pipet 팁 당겨하는 데 사용됩니다. microinjection의 pipets의 개통은 가벼운 현미경 검사가 너무 좁은 것이므로 분사 pipets의 품질은 프로그램 설정이 완료되기 전에 몇 가지 세포를 주사하여 직접 평가해야합니다. 다음은 열, 당겨, 속도 및 시간 설정에 대한 대략적인 설정은 다음과 같습니다 (당기 1) 600, 115, 15, 250, (당겨 2) 640, 130, 65, 200. 이러한 설정은 유리의 다른 일괄와 풀러의 가열 필라멘트의 상태에 따라 다를 수 있으며 필요에 따라 조정해야합니다. 5 참조 자세한 내용은을 보려면. </li><li> 사출 세션 중에 손상이나 문제의 경우, 주입하는 뉴런의 요리마다 여러 가지 (2-5) 사출 pipets을 당기세요. 스토어 사출 microinjection의 pipet 팁 입력에서 먼지를 방지하기 위해 대상 컨테이너에 pipets. </li></ol> II. Intranuclear microinjection 십t &quot;&gt;이 섹션에서는 세부 뉴런의 핵으로 cDNA 주입의 과정. 기본 microinjection은 설정 프로세스를 시각화하기 위해 거꾸로 위상 대비 현미경 (예 : 니콘 Diaphot TMD, 니콘, 멜빌, NY), micromanipulator를 (포함 예 pipet에서 cDNA 솔루션을 추방하기 위해 분사 pipet의 움직임과 압력 주입기 (예 : Eppendorf FemtoJet 익스프레스)를 제어할 수 Eppendorf 5171)가. micromanipulator에 압력 주입기를 연결 주사 중 후자의 두 프로세스의 동기화를위한 수 있습니다. 기타 옵션지만, 추천, 구성 요소가 장착된 비디오 모니터링 시스템 (CCD 카메라, Cohu 주식 회사, 샌디에고, CA, 흑백 비디오 모니터, 소니 주식 회사, 도쿄, 일본)가 있습니다.이 시스템은 주사에 대한 절대적인 요구하지 않습니다; 그러나, 흑백 모니터는 세포 핵의 개선 시각화를위한 높은 콘트라스트를 제공하며 긴 사출 세션 동안 더 편안하게 볼 수 경험을 제공합니다. 또한, 휴대용 컨트롤러를 작동하는 소프트웨어를 실행하는 노트북 컴퓨터에 세미 활용할 수 (자세한 내용은 토론 참조) 사출 과정을 자동화합니다. SCG 뉴런를 삽입하는 이상적인 시간은 3~6시간 이후 해리이다. 이 단계에서는 세포가 단단히 접시의 바닥에 붙어하고, 핵이 하나 또는 여러 개의 nucleoli (그림을 포함하는, 어두운 막과 중앙 둥근 organelle으로 위상 대비 현미경으로, 명확하게 볼 수 있습니다, 구형 아르 1A). <ol><li> 현미경 단계의 중앙에 dissociated 뉴런 한 접시를 놓습니다. 초점을 조절하고 신경의 핵이 명확하게 볼 수 있도록 현미경의 위상 콘트라스트 광학을 최적화합니다. </li><li> microloader의 pipet 팁을 사용하여 microinjection의 pipet으로 준비 cDNA 솔루션의 Pipet 2 μl. 이 원심 분리하는 동안 정착 입자를 저어 수 있으므로 혈소판 튜브 하단의 솔루션을 그리기하지 마십시오. microinjection의 pipets의 필라멘트 끝에 솔루션을 그리기에 도움이 있지만, 작은 기포가 발생하면 부드럽게 그들을 이동시키다하는 유리의 측면 버려해야합니다. </li><li> 압력 주입기의 모세관 홀더에 microinjection의 pipet를 삽입하고 다음 micromanipulator에 홀더를 확보. 홀더는 45 °의 각도로 고정됩니다. </li><li> 그릇에 microinjection의 pipet를 낮춥니다. pipet는 문화 매체를 입력으로 초승달 모양은 그 빛의 굴절에 영향을 주며 뉴런의 이미지 품질을 절감 형성됩니다. 뉴런의 핵이 다시 명확하게 표시되기 전까지는이 문제를 완화하려면 위상 링 터렛은 약간 오프셋 수 있습니다. </li><li> 일부 압력 분사 시스템은 짧은 기간 동안 microinjection의 pipet 팁에서 최대 공기 압력을 적용하는 &quot;깨끗한&quot;기능이 있습니다. 팁이 막혀 나타나는 경우에는 시작하기 전에 주사 중에 파편의 pipet을 지우려면이 기능을 사용하십시오. 이 기능을 사용하면서 무너 뜨 리신 액체가 화면에 표시되지 않으면, 새로운 사출 pipet로 바꿉니다. </li><li> 센터 microinjection의 모니터에서 보는 pipet과 신경 옆에와 nucleolus 같은 초점 비행기의 제보를 맞춥니다. micromanipulator에 낮은 Z 축 제한으로 위치를 설정합니다. 이 위치는 microinjection의 pipet은 주사하는 동안에 진출하게됩니다 깊이입니다. microinjection의 pipet은 뉴런의 맨 위에를 지우는 그래서 지금 약 30 μm의이 시점 위의 팁을 위치. </li><li> Eppendorf 5171 micromanipulator의 &quot;삽입&quot;모드는 intranuclear 주사를 수행하기 위해 다음과 같은 설정으로 정의할 수 있습니다. 주입 기능에 대한 설정, 찌르려고 기능이 해제 남아 반면. 대각선 주입 경로는 (X와 Z - 축을 따라) 세포 손상의 최소 금액을 생산하고, 따라서 축 모드는 주사에 사용해야합니다. 300 μm의 / s의 주사 속도가 충분하고, microinjection의 pipet는 Z 축 제한 설정에 도달하면 압력을 빌드 - 업 동기화할 수 있습니다. </li><li> 압력 주입기는 핵에 주입 cDNA 솔루션의 수량을 제어합니다. &quot;자동&quot;분사 모드에서, DNA의 전달 시간을 제어하고 연결 micromanipulator에 의해 시작됩니다. 사출 압력 (PI)는 100-200 hectopascals (, 1 고전력 증폭기 ~ 0.015 PSI 고전력 증폭기); 사이에 설정해야 높은 사출 압력 주사의 성공 속도 또는 품질을 개선하지 않으며 microinjection의 pipet 팁 크기 또는 DNA 순도 다른 문제를 나타낼 수 있습니다 . 0.3 s의 주입 기간 (TI)와 pipet 팁에 배지에서 입자 occluding의 항목을 피하기 위해 지속적으로 긍정적인 압력을 공급 30 고전력 증폭기의 보상 압력 (PC)를, 사용해야합니다. </li><li> 현미경의 XY 축 스테이지 컨트롤을 사용하여 microinjection의 pipet의 일각에 따라 주입하는 신경 세포를 놓습니다. t 사이에서 앞뒤로 초점에 의해 핵의 중앙 위에 pipet의 팁을 정렬그는 팁 및 nucleoli. </li><li> 주입 단추 (micromanipulator)에 눌러 핵을 주입. 사출 단계에 대한, microinjection의 pipet과 cDNA 솔루션의 릴리스의 움직임은 micromanipulator에 의해 제어됩니다. 그것은 눈으로 성공 intranuclear 주사를 확인하기 어렵지만, 상대적으로 낮은 점도 cDNA 용액의 주입 (점성 원자력 환경에 비해)는 종종 위상 대비 광학 아래 흰 깃털로 표시하고 주입의 지표로 사용될 수 핵으로. 가끔 microinjection의 pipet는 핵 막에 침투하지 않고 단순히 핵을 nudges. 같은 위치에서 두 번째 주입 시도가 핵에 DNA의 성공적인 주사가 발생할 수 있습니다. 세포의 팽창하는 것은 신성 모독이 세포질 주입 대개 나타내는 것입니다. 또한, 중요한 핵 붓기는 물론 곧 이후에 세포 죽음에 신경 일반적으로 결과가 용납하지 않습니다, 따라서 분사 압력과 기간은 제안된 값을 넘지 않아야합니다. </li><li> microinjection의 pipet에서 다음 신경 세포를 정렬하기 위해 현미경의 무대를 재배치하여 뉴런를 넣고 계속합니다. 체계적으로 하룻밤 배양을위한 인큐베이터로 뉴런의 요리를 제공하기 전에 약 50-100 핵을 삽입하기 위해 요리를 통해 이동합니다. 성공적으로 주입 뉴런은 기자의 유전자 표현하여 다음날 확인할 수 있습니다. </li></ol> III. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 우수 자궁 경부 신경절 (SCG) 뉴런. 뉴런을 SCG의 위상 대비 영상 삼시간 후 분리 (A). 이 단계에서는 핵은 microinjection의 pipet 팁의 정렬 에이즈있는 명확하게 볼 수 있습니다. 핵은 단일 (왼쪽) 또는 여러 (오른쪽) 어두운 nucleoli와 뉴런의 중심에 나타납니다. 핵 (B)로 cDNA EGFP의 주입에 따라 뉴런 16 시간 SCG. 왼쪽, 위상 콘트라스트 조명 아래에 많이 신경을 SCG. 맞아, 성공적인 주사를 보여주는 하나의 신경 세포에서 EGFP 표현을 발생하는 동일한 뉴런의 epifluorescent 이미지. 화이트 규모 표시줄은 20 μm의 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="그림 2" border="0" /> 그림 2 : 전류를 통해 전체 세포 녹음 heterologously - 표현 G - 단백질 내심 신경을 SCG에서 K + (GIRK) 채널을 정류 결합. GIRK 전류 (I GIRK)는 -140에서 -60 뮤직 비디오의 개최 가능성에서 40 뮤직 비디오에 200 MS 전압 램프 (중 삽입된 페이지) norepinephrine에 의해 내생 α 2 - adrenoceptors 중 다음과 활성화 (NE, 10 μm의)에 의해 evoked되었습니다 . 겹쳐 흔적 전에 (검은색)와 NE 혼자 (파란색) 또는 NE 중 하나의 응용 프로그램에 추가로 10 MM 바 2 + (적색) 후 동일한 신경 세포에서 녹음되고 있음을 나타냅니다. 점선 라인은 제로 현재 수준을 나타냅니다. I GIRK, 포함된 외부 솔루션 (MM)를 130 NaCl, 5.4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl 2, 0.8 MgCl 2, 15 포도당, 15 자당과 NaOH로 pH의 7.4 조정 0.0003 TTX를 기록하십시오. 내부 녹음 솔루션 (MM)를 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, 그리고 코와 산도 7.2 조정 0.3 나 2 GTP를 포함. 현재의 부족이 uninjected SCG의 뉴런에서 NE의 존재에 전압 램프에 의해 elicited (A)는 SCG 뉴런은 내생 GIRK 채널을 표현하지 보여줍니다. NE (B, 왼쪽)에 노출되면 플라스미드 cDNA 인코딩 기능 GIRK 11 번 채널의 성공적인 주입은 전압 램프 중에 큰 전류에 상승을 제공합니다. G - 단백질 결합 수용체 작용제 (NE), 내면 정류 및 putative GIRK 채널 차단, 바 2 + (B, 오른쪽 붉은 추적)에 의해 전류 차단에 의해 활성화 : 해류가 GIRK 채널을 통해 전류의 전형적인 특성을합니다. 열고 채워진 동그라미가 나는 각각 잡고 정상 전류에 GIRK 나타냅니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

일반적인 문제가 발생하여 제안 : 언급했듯이 이전, 성공적인 핵 주사는 조직 문화 판에 점착 성의 세포를 필요에 따라 달라집니다. 주사의 시작을 연기 세포 분리 절차를 따라 몇 시간이 뉴런은 요리의 하단을 준수 할 수 있습니다. 또한, 0.1 MG / 고분자량 폴리 - L - 라이신 (시그마, 세인트 루이스, MO) 요리의 하단 표면에 뉴런의 에이즈 접착력의 ML과 코팅 요리. DNA의 높은 농도를 삽입하려고 시도하는 특히 microinjection의 pipets의 차단은, 자주 문제가 될 수 있습니다. 플라스미드 DNA를 분리하고 정화 고품질의 분리 컬럼을 사용하고, (스핀 필터, 혈소판 튜브의 회전) 언급된 추가 정화 단계를 수행하면 이전에 주입하는 입자를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주사하는 동안 압력 주입기의 &quot;깨끗한&quot;함수는 (0.2 s에 대한 충분합니다) 사용할 수 있지만 그 문제가 해결되지 않으면, 새로운 사출 pipet을 사용해야합니다. microinjection의 pipets의 대부분이 사출 세션 동안 막힌 될 경우, 더 큰 개방과 microinjection의 pipet 도움말을 생산하는 유리 pipet의 풀러의 설정을 변경 고려하십시오. 핵 주사하는 동안 발생 또 다른 문제는 조직 문화 요리의 바닥 표면의 얼룩이다. 이 변화는 바로 깊이 이후 주사하는 동안 pipet 탐색이 고정되는 핵에 주입 pipet 팁의 타겟팅 정확성에 영향을 미칩니다. 따라서,이 Z 축 제한은 같은 접시 내에 주사하는 과정 중에 조정해야합니다. 조정이 필요한 때 명백한 것입니다 (이 핵 주입에 대한 표시 (핵이나 세포가 완전히 놓친 것입니다에 없음 흰색 깃털) 없다, 또는 사출 pipet 팁 가까이 접시의 바닥에 오는 될 세포 압축 혹은) 접시의 바닥에 pipet 팁을 충돌. 유리 - 복제 실린더가 (. OD 10mm, 캣 번호 2090-01010, Bellco 유리, 바인랜드, 뉴저지)보다 작은 밀폐된 공간에서 그들을 제한하는 뉴런의 도금을하는 동안 사용할 수 있으므로 이동하는 데 필요한 거리를 최소화 주사 사이 사출 pipet. 이러한 복제 실린더는 microinjections를 수행하기 전에 제거됩니다. 기술의 단점 : Intranuclear microinjections은 기술적으로 인내와 운영자가 수동 손재주의 높은 수준을 요구하는, 요구하고 있습니다. 이 기술 능력, 다른 기술과 마찬가지로, 연습과 함께 제공됩니다. 그러므로, 그것은 실제 실험을 시도하기 전에 혼자 리포터 유전자의 핵 주사 연습 좋습니다. 더 사출 과정을 돕기 위해, 그것은 컴퓨터 프로그램에 micromanipulator과 압력 주입기의 단계를 통합하는 것이 가능해 질 수 있습니다. 이러한 이고르 프로 (WaveMetrics, 레이크 오스 베고, OR)와 같은 프로그램은 (대한 6,7,8 참조 microinjection 설정을 저장하고 반 자동화 사출 과정 다기능 컨트롤러 (ShuttlePro, 컨투어 디자인, 윈더험, NH) 프로그램에 활용할 수 세부 사항). intranuclear microinjection 기법의 또 다른 단점은 낮은 성공률이다. 시도 핵 주사의 약 10-20% 단백질 표현식로 이어집니다. 이 효율이 표현 세포의 많은 예를 들어, 전기 생리학, 다양한 생화학 assays이 충분하지 않을 수 있습니다 필요하지 않은 애플 리케이션을위한 충분히있을 수 있습니다 반면. 기술의 응용 : 그 결점에도 불구하고, DNA의 intranuclear microinjection은 heterologously 뉴런의 단백질을 표현하는 매우 유용한 기술입니다. 단백질 표현의 높은 수준 때문에 주사, 유전자 전사, 그리고 핵의 plasmids 긴 안정성을 조절 높은 활성 CMV 프로 모터 동안 핵에 출시 plasmids의 다수의 핵 microinjections 함께 얻을 수 있습니다. 표현 이상의 단백질은 단백질 heterologous 높은 수준의이 내생 단백질을 압도하는 데 필요한 지배 - 부정적인 실험에 특히 유용합니다. intranuclear 주사의 또 다른 장점은 여러 구성을 주입 때 핵으로 cDNA 구성의 일관성 비율을 제공하는 능력입니다. 다른 transfection 방법으로, 그것은 reproducibly 같은 접시 이내에 transfections 사이의 서로 다른 세포로 구성 각 DNA의 동일한 비율을 소개하기가 어렵습니다. 핵으로 cDNA 솔루션의 직접 분사는 다양성의 원인을 제거하고 표현 단백질의 비율이 효과적으로 titered 수 있습니다. 전통 transfection 방법 때문에 transfection의 reag과 관련된 핵 9 화학 독성에 DNA의 낮은 정관의 사후 mitotic 세포의 제한된 효과를 가지고엔트 10. 핵 microinjections는 핵에 기계적으로 유전 물질을 도입하여 이러한 문제를 극복합니다. 이 기술이 더 관련되어 있지만, 기능적인 생물 학적 시스템에서 단백질의 효과를 연구하는 능력,이 기술의 힘드는 자연에 대한 보상보다, 내생 신호 경로와 함께 완료되었습니다. 동물의 모든 실험 절차는 애니멀 케어 및 사용을위한 건강의 지침 국립 연구소에 따라 수행되었다.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ultrafree-MC Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC30VV00</td>
<td>Durapore PVDF filter; 0.1 &mu;m pore-size</td>
</tr>
<tr>
<td>TE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc</td>
<td>351-010-131</td>
<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-hematocrit capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-362-574</td>
<td>Unheparinized Preparation: 
Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&deg;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5417 R</td>
<td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader 20 &mu;l pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection capillary glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW120F-4</td>
<td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td>
</tr>
<tr>
<td>Charge-coupled device (CCD) camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cohu Inc.</td>
<td>6410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Video monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony Corporation</td>
<td>PVM-122</td>
<td>Black and White, 9&#x201D; screen </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5171</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>FemtoJet Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contour Design</td>
<td>S-PROV2</td>
<td>Programmable multimedia controller</td>
</tr>
<tr>
<td>Igor Pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WaveMetrics</td>
<td>Version 4.05A</td>
<td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

기본의 연결을 세포 문화는 그들이 영원히 세포 라인에 비해보다 생물학적으로 관련 시스템을 나타내는 이후 단백질 기능을 연구하기 위해 귀중한 도구입니다. 그러나, 기본 뉴런의 포스트 mitotic 자연은 electroporation 또는 화학적 - 중재 transfection과 같은 일반적인 절차를 사용하여 효과적인 heterologous 단백질 발현을 방지합니다. 따라서, 다른 기술은 효과적이 아닌 나누어 세포의 단백질을 표현하기 위해 채용해야합니다. 이 문서에서는, 우리는 dissociated 성인 동정 뉴런으로 cDNA 구성의 intranuclear 주사를 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 뉴런의 다른 유형에 적용되어이 기술은, 성공적으로 heterologous 단백질 발현을 유도하실 수 있습니다. microinjection 절차에 필수적인 장비는 세포, N 2 (g) 압력 전달 시스템에 연결된 cDNA 용액 가득한 유리 사출 pipet 및 micromanipulator을 시각화하기 위해 거꾸로 현미경을 포함합니다. micromanipulator은 pipet 팁로부터 cDNA 솔루션을 꺼낼 수 가압 N 2의 간단한 펄스로 microinjection의 pipet의 사출 움직임을 조정합니다. 이 기술은 다른 많은 transfection 방법과 관련된 독성을 가지고 일관된 비율로 표현되는 여러 DNA 구조를 가능하게하지 않습니다. 주입된 세포의 낮은 숫자는 물론 같은 electrophysiological 녹음 및 광학 이미징과 같은 단일 세포 연구에 적합 microinjection 절차를 만들지만, 세포 높은 transfection 효율의 큰 숫자를 요구 생화학 assays 적합하지 않을 수 있습니다. intranuclear microinjections는 장비와 시간 투자를 필요로하지만, 생리학 관련 환경에서 heterologous 단백질 표현의 높은 수준을 달성하는 능력이 기술에게 단백질 기능을 조사하기 위해 매우 유용한 도구를합니다.

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Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

cDNA의 직접 intranuclear 주사 후 mitotic 세포에 대한 효과적인 transfection 기술입니다. 이 방법은 하나 또는 여러 개의 cDNA 구조에서 heterologous 단백질 표현의 높은 수준을 제공하고 단일 셀 assays의 다양한 생리학 관련 환경에서 공부하는 단백질 기능을 수 있습니다.

Dissociated 성인 포유류의 뉴런으로 DNA의 Microinjection Intranuclear

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K 조회수.  National Institutes of Health (NIH). cDNA의 직접 intranuclear 주사 후 mitotic 세포에 대한 효과적인 transfection 기술입니다. 이 방법은 하나 또는 여러 개의 cDNA 구조에서 heterologous 단백질 표현의 높은 수준을 제공하고 단일 셀 assays의 다양한 생리학 관련 환경에서 공부하는 단백질 기능을 수 있습니다.

비디오: Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

연구

생물학

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

성인 Zebrafish에 Intraperitoneal 사출

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

편광 상피 세포에 Plasmids의 Microinjection에 의해 작은 GTPases의 기능을 분석

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

직접 성인 Zebrafish의 신장에 세포의 이식

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.