우리는 원고의 비판적 읽기에 도움이 토론과 크리스 캐리에 대한 위르겐 Soll에 감사를드립니다. 이 프로젝트는 DFG 및 드퐁 데르 chemischen 인더스트리 (부여 번호 SFB 1035 SS에 프로젝트 A04 및 RS 187 개의 22 / 수행)에 의해 투자되었다.

1. BiFC의 변환은 아그로 박테리아에 구축 <ol><li> BiFC 구조의 클로닝 <ol><li> 측면에서는 attB - 사이트를 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 적절한 템플릿에서 관심의 유전자를 증폭. 교정 중합 효소를 사용하여 PCR을 수행합니다. 설계된 프라이머 조합 어닐링 단계의 길이와 단편 크기에 따른 연신 공정의 길이를 적응시킨다. 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 확인 PCR 클린 - 업 키트를 사용하여 정제. </li><li> 얻어진 단편 BP 반응과 BP의 재조합 효소를 사용하여 입력 벡터를 수행합니다. 항목 벡터의 150 NG와 attB-PCR 제품의 15-150 NG를 혼합, BP의 재조합 효소의 2 μl를 추가하고 8 μL의 총 부피에 TE 버퍼와 입력합니다. 실온에서 1 시간 동안 반응을 품어 37 ℃에서 10 분 동안 2 μL 테 K를 추가하여 반응을 중지 </li><li> 관할 E.으로 전체 반응을 변환 대장균 DH5α, 세포와 벡터에 DNA 단편의 해당 위치에 식민지 PCR에 의해 얻어진 식민지 화면. 양의 플라스미드 DNA 서열은 돌연변이의 부재를 확인하기 위해 수행된다. </li><li> LR의 재조합 효소를 사용하여 해당 대상 벡터와 LR 재결합을 위해 얻어진 항목 복제를 사용합니다. 대상 벡터의 150 NG와 입력 벡터의 50 ~ 150 NG를 혼합, 1 μL의 LR의 재조합 효소를 추가하고 5 μL의 총 부피에 TE 버퍼와 입력합니다. 실온에서 1 시간 동안 반응을 품어 37 ℃에서 10 분 동안 1 μL 테 K를 추가하여 반응을 중지 </li><li> 벡터에 DNA 단편의 해당 위치에 식민지 PCR에 의해 식민지를 획득 능력 대장균 DH5α 세포와 화면에 전체 반응을 변환 할 수 있습니다. DNA의 염기 서열이 단계에서 필요하지 않습니다. </li><li> 높은 순도를 보장하기 위해 플라스미드 미니 키트 플라스미드 DNA를 분리. </li></ol></li><li> 화학적 능력 아그로 박테리아 (준비변형 AGL1, 리팜피신 및 실린 저항) <ol><li> 행진 중 주식 문화에서 아그로 박테리아 및 28 ℃에서 24 시간 동안 성장 </li><li> 하나의 식민지로 5 ㎖ LB 배지에 접종하고 28 ℃에서 하룻밤 배양 </li><li> 접종 50 2 하룻밤 문화 ㎖의 OD 1.0 600 28 ° C에서 약 4 시간 동안 성장과 ml의 LB 배지. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 3,000 XG에서 세포를 원심 분리기와 얼음처럼 차가운 염화칼슘 (10 ㎜) 멸균 된 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 이 단계 후 얼음에 세포를 보관하십시오. </li><li> -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 즉시 동결 세포의 분취 량 (100 μL)를 준비 </li></ol></li><li> 화학적 능력 아그로 박테리아의 변환 <ol><li> 얼음에 유능한 AGL1 세포의 하나 나누어지는 해동. 세포에 플라스미드 DNA의 1-2 μg을 추가합니다. 얼음에 5 분, 37 ℃에서 액체 질소와 5 분에서 5 분 알을 품다 세포와의 600 μL LB 매체를 추가28 ℃에서 4 시간 동안 650 rpm에서 메르 루사 </li><li> 8,000 XG에서 1 분 동안 세포를 원심 분리기 및 뜨는 폐기하십시오. 적절한 항생제를 포함하는 LB 플레이트 상에, 나머지 LB 배지 플레이트 50 μL에 펠렛을 재현 탁. 플레이트를 밀봉하고 28 ℃에서 2 일 동안 배양 식민지 PCR에 의한 플라스미드의 존재를위한 스크린 식민지. </li><li> 적절한 항생제를 포함하는 5 ㎖ LB 배지에서 하나의 긍정적 인 식민지의 예방과 밤 동안 28 ° C에서 알을 품다. 500 ㎕의 50 % 살균 글리세롤 하룻밤 문화의 500 μl를 혼합하여 -80 ℃에서 동결 </li><li> 담배 잎의 일시적인 변화를위한 글리세롤 주식에서 직접 적절한 항생제를 포함하는 LB 배지에서 아그로 박테리아를 접종한다. </li></ol></li></ol> 2. 담배 잎의 과도 변환 <ol><li> 아그로 박테리아 성장 <ol><li> 다음 주식 솔루션을 준비 : 아세토 시린 곤 (150 MM은 70에서 용해-20 ° C에서 분주 % 정도의 EtOH), 저장 MES / KOH (0.1 M)의 pH 5.7, 4 ° C (이상 보관시 세균의 증식을 방지하기 위해 0.2 μm의 필터를 통해 살균 필터)에서 저장, MgCl2를 (1 M) 주식, 실온에서 저장. </li><li> 멸균 50 ML 튜브에 대한 관심의 플라스미드를 포함하는 AGL1 글리세롤 주식 문화의 50 μL와 적절한 항생제를 포함하는 10 ㎖의 LB 배지에 접종하고 적어도 24 시간이 1.0 사이의 OD 600까지 190 rpm으로 흔들어 28 ° C에서 알을 품다 -2.0가 도달한다. </li><li> 원심 분리기 박테리아 15 분 3,000 XG에. 갓 침투 매체에서 펠렛 [MgCl2를 (10 ㎜), MES / KOH (10 ㎜)의 pH 5.7, 아세토 시린 곤 (150 μM)]을 재현 탁하고 OD 1.0 600 서스펜션을 조정합니다. </li><li> 어둠 속에서 2 시간 동안 오버 헤드 통에 아그로 박테리아 세포를 품어. 세포는 침투를 위해 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 담배 잎의 침투 <ol><li> 세 가지를 사용주 이전 담배 (는 담배 benthamiana) 식물. 침투에 대한 몇 가지 오래된 잎을 선택합니다. </li><li> 관심의 구조 (3 ml의 각을) 들고 아그로 박테리아의 동일한 볼륨을 섞는다. 침투를위한 바늘없이 5 ML의 주사기를 가져 가라. 여러 위치에서 잎의 밑면에 주사기를 눌러 잎담배에 신중 세포 현탁액을 침투. </li><li> 식물을 물과 이틀 동안 어둠 속에서 그들을두고. </li></ol></li></ol> 3. 원형질체 준비 담배 잎의 원형질체 준비는 쿠프 등. 16에서 적응 약간 수정되었습니다. <ol><li> 버퍼 준비 <ol><li> F-PCN 매체를 준비 매크로 염 [3 (1012 ㎍ / ㎖) KNO, 염화칼슘 2 • 2H 2 O (440 ㎍ / ㎖), 망초 • 7H 2 O (370 ㎍ / ㎖), KH 2 PO 4 ( 170 ㎍ / ㎖), NH 4-숙시 네이트 [(20 ㎜, 2 M 주식 졸을 준비의 ution (숙시 네이트 (236 ㎍ / ㎖)과 NH 4 망할 CIA (106 ㎍ / ㎖)을, 용해 pH를 5.8로 조정), 마이크로 염은 [EDTA-FE (III), 나 소금 (40 ㎍ / ㎖의) × KJ (825 ㎍ / ㎖), H 3 BO 3 (3 ㎍ / ㎖) MnSO 4 • H 2 O (10 ㎍ / ml)에 ZnSO 4 • 7H 2 O (2 ㎍ / ㎖) 나 2 무 4 • 7H 2 O (0.25 ㎍ / ㎖), CuSO 4 • 5 H 2 O (0.025 ㎍ / ㎖)의 CoCl2 2 • 6H 2 O (0.025 ㎍ / ㎖)], MES (390 ㎍ / ㎖), 포도당 (약 80 μg / ㎖) 삼투압이 550 mOsm, pH가 5.8 (KOH). -20 ° C에서 분주에 보관 </li><li> F-PIN 매체를 준비 F-PCN으로 대신 포도당을 사용 자당 (약 110 ㎍ / ㎖), 삼투압이 550 mOsm, pH가 5.8 (KOH)의 모든 성분. -20 ° C에서 분주에 보관 </li><li> W5 매체를 준비 : 150 밀리미터의 NaCl, 125 mM의 염화칼슘, 5 밀리미터의 KCl, 2 MM의 MES, 삼투압 550-580 mOsm, pH가 5.7 (KOH)을. 4 °에서 보관; C (이상 보관 중에 박테리아의 성장을 방지하기 위해 0.2 ㎛의 필터를 통해 필터 멸균). </li><li> 원형질체 분리 (0.1 g 셀룰라아제, 10 ㎖ F-PIN에 0.03 g의 macerozym) 신선한 효소 솔루션을 준비합니다. 10 분, 실온으로 냉각을 위해 55 ° C에서 솔루션을 품어. 10 ㎖ 용액에 10 % BSA 100 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 원형질체의 분리 <ol><li> 페트리 접시에 하나의 침투 잎을 배치하고 신선한 효소 솔루션을 추가합니다. 약 0.5 cm 2 크기의 조각으로 잎을 잘라 새로운 면도칼을 사용합니다. 진공 침투 플라스크에 효소 용액으로 잎 조각을 전송하고 기포가 (매우 신중하게 릴리스 진공) 잎에서 나올 때까지 진공은 약 20 초 동안 침투. </li><li> 어둠 속에서 40 rpm으로 90 분 동안 플라스크를 흔들어. </li><li> 90 rpm에서 1 분간 흔들어 원형질체를 놓습니다. 15 ㎖의 원심 분리 관 (둥근 바닥)에 거즈 (100 μM)를 통해 솔루션을 필터링합니다. </li&gt; <li> 70 XG RT에서 (느린 가속 및 감속)에서 10 분 동안 2 ㎖ F-PCN 버퍼와 원심 분리 원형질체 용액 오버레이. </li><li> 본래 원형질체는 효소액 및 F-PCN의 계면에 축적된다. 신선한 원심 분리 관에 그대로 원형질체를 전송하고 W5 버퍼에 채우기 위해 넓은 구멍 1 ㎖ 피펫 팁을 가져 가라. 원형질체 펠렛 100 XG (느린 가속과 감속)에서 2 분 동안 원심 분리기. </li><li> 원형질체의 양에 따라 약 200 μL 5,000 버퍼에 피펫에 resuspend 펠렛을 사용하여 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. </li><li> 항상 그대로 원형질체의 파열을 방지하기 위해 다양한 오리피스 팁을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 4. 레이저 스캐닝 현미경 <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 현미경 슬라이드 정도 밀봉 두 개의 작은 스트립 (2cm 간격)을 붙여 넣습니다. 스트립 사이의 원형질 용액 20 μl를 놓고 조심스럽게 덮개 유리를 배치상단에. 밀봉 스트립은 원형질체는 커버 유리에 의해 숙청하지 있는지 확인하십시오. </li><li> 총 잎 샘플은 잎에서 1cm 조각을 잘라 위쪽으로 향하게 잎의 바닥면과 현미경 슬라이드에 배치하십시오. 약 30 μL의 H 2 O를 추가 상단에 커버 유리를 배치하고 양쪽에 접착 테이프로 단단히 고정합니다. </li></ol></li><li> 공 촛점 이미징 및 현미경 설정 <ol><li> TCS SP5 : 이미지는 라이카, 형식에서 공 초점 레이저 주사 현미경으로 수행됩니다. 확대를 위해 영상 매체로 글리세롤 63X의 크기와 대물 렌즈 (HCX PL APO CS)를 사용합니다. 개구 수를 1.3로 설정합니다. 평가를위한 라이카 응용 프로그램 제품군 / 고급 형광 소프트웨어를 (추가 데이터 S1 참조)를 사용합니다. </li><li> 515 nm에서 재구성 BiFC 신호를 모니터링 및 495-550 개의 PMT 검출기 방출 대역폭을 설정하는 18 %의 강도로 488 nm에서 30 % 아르곤 레이저 및 레이저 파워를 설정한다. </lI&gt; <li> 엽록소 형광도를 모니터링하려면 650-705 두 번째 PMT 검출기 방출 대역폭을 설정합니다. </li><li> mCherry 신호 헬륨 네온 레이저 (561)를 사용하여 모니터링하기 위해, 레이저의 강도 561-18% 및 587-610 제 PMT 검출기의 방사 대역폭을 설정한다. </li><li> 모든 PMT 검출기 채널의 사진은 동일한 게인 설정 (게인 배경 신호를 제외하는 800 ~ 900 사이 여야합니다)로 촬영되어 있는지 확인합니다. </li><li> 100 Hz의 스캔 속도와 1024 × 1024 픽셀의 형식 너비 / 높이에서 사진을 촬영합니다. </li><li> Z-스태킹 각 스택에서 0.5 ㎛의 최대 거리를 사용하십시오. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. 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BiFC 실험 계획에 여러 지점이 고려되어야한다. 관심의 단백질에 대한 구조적 정보가 필요하지 않지만, 토폴로지는 막 단백질에 걸친 작업을 할 때 알고 있어야합니다. 형광 단백질은 동일한 세포 내 구획에서 상주하거나 상호 작용을 허용하는 멤브레인의 동일 측면에 직면한다. N-말단 서열을 타겟팅 필요 단백질을 분석 할 때 당연히, 단지 C-말단 태그가 고려 될 수있다. 그 태그는 GFP-태그 된 단?...

단백질 복합체의 형성을 공부하고 생체 내에서 식물 세포에서의 현지화는 셀룰러 네트워크를 조사하는 것이 필수적입니다, 신호 및 신진 대사 과정. BiFC 직접 살아있는 식물 세포 1-5 내에서의 자연 환경에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화 할 수 있습니다. BiFC에서 재구성 형광 단백질에 형광 단백질 리드의 두 비 형광 N-및 C-말단 조각의 보완에 접근. 많은 다른 형광 단백질의 단편은 녹색 형광 단백질 (GFP) 화학적 세 가지 잔기 (6)에 의해 형성되어있는 발색단 예 : 단백질 상호 작용을 검출하기 위해 사용되어왔다. 형광 단백질은 관심의 두 단백질에 융합 될 수있는 두 개의 비 형광 조각 될 수있는 루프 또는 ß-가닥 내 반감 될 수있다. 분석은 어떤 세포 내 compartme에 상호 작용을 검출하는데 사용될 수있다유전자 융합 단백질을 표현하기 위해 수정 될 수있는 기적으로 성장하는 유기체 또는 세포 NT. 이 단백질은 세포 내에서 근접에 오면, 형광 재구성되고 외인성 또는 형광 염료 (3)의 추가없이 현미경에 의해 모니터링 될 수있다. 단백질은 쉽게 담배 생성 구문 남긴다의 아그로 박테 리움 - 매개 형질 전환을 이용하여 표현 될 수 있기 때문에, 담배 (는 담배 benthamiana)는, 식물성 단백질의 상호 작용을 시각화하기 편리한 모델 생물로 입증되었다. 아그로 박테리아는 식물 세포로 그 유전자의 전달을 매개하는 효소를 코딩하는 소위의 Ti 플라스미드 (종양 유도)를 사용한다. BiFC는 가용성뿐만 아니라 모든 세포 구획 내에서 막 단백질 잘 적용하고 성공적으로 생체 내에서 단백질 상호 작용을 식별 할뿐만 아니라 상호 작용 사이트를 분석하기 위해 지난 몇 년 동안 사용되었습니다7-9 단백질 내. 도입 된 유전자의 발현시에, 형광 단백질의 상호 작용은 소포체 (ER), 세포막 또는 엽록체 같은 큰 셀룰러 구조 위해 적당한, 나뭇잎에 직접 시각화 될 수있다. 그러나,보다 세련된 구조에서 지역화을 모니터링, 예를 들어, 엽록체 봉투, 그것은 변형 담배 잎에서 분리 된 원형질체에서 형광을 시각화하는 것이 바람직하다. C-말단 또는 N-말단 형광 태그 식물 10 BiFC 접근을 위해 사용되어야하는 하나를 함유 BiFC 벡터들의 집합. 이하 설명 프로토콜은 tetratricopeptide 반복 도킹 단백질 Toc64 및 AtTPR7는 엽록체 외부 봉투와 각각 소포체, 11-13에 거주를 포함 (TPR) 도메인과 세포질 열 충격 단백질 90 (HSP90)의 상호 작용을 연구하는 데 사용되었다. 이를 위해, HSP90은 캐럿에 융합시켰다SCFP (SCFP C)의 erminal 부분. 태그는 N-말단 TPR 도메인 형 클램프 HSP90의 C-말단 MEEVD 결합 모티프의 접근성을 보장하기 위해 보호자에 융합했다. 병행 금성 (비너스 N)의 N-말단 부분은 도킹 단백질 각각 Toc64 및 AtTPR7을 함유 TPR 도메인의 세포질 도메인에 융합시켰다. 음성 대조군으로 우리는 세포질에 존재하고, 따라서 적절한 컨트롤입니다 전적으로 SCFP C의 수용성 C-말단 부분을 복제. 연구 단백질의 형광 태그는 근접시켜 형광 신호의 재구성을 할 수 있도록 동일한 세포 구획을 직시해야합니다. 다른 형광 태그에 융합 마커 단백질이 상호 작용의 세포 내 현지화를 보여 cotransformed 할 수있는 재구성 된 형광 신호의 지역화를 결정합니다. mCherrry에 융합 ER 마커 단백질에 동시에 형질 전환AtTPR7 14에 위치한 ER 경우. 엽록소의 형광도는 Toc64의 경우에는 엽록체 마커로 봉사했다. 이것에 의해뿐만 아니라 세포질 HSP90의 보호자와 각각 Toc64 및 AtTPR7,,의 생체 상호 작용은 담배 잎에 직접 모니터링 할 수 있습니다뿐만 아니라 상호 작용의 세포 내 현지화를 조사 할 수 있습니다. BiFC 잘 단백질 - 단백질 상호 작용을 공부하는 다른 방법에 대한 보완 방법으로 적합합니다. coimmunoprecipitation에 또는 시험 관내 풀다운 실험에 비교하여, 예를 들면, 특정의 항체는 관심의 단백질에 해당 될 필요없고, 단백질은 특히 막 단백질에 대한 도전 일 수있는 재조합 적으로 시험 관내에서 발현 될 필요가 없다. 단백질 융합 형광 태그 (15)의 상호 작용에 의해 포착되기 때문에 더욱, 또한 과도 상호 작용은 BiFC을 사용하여 모니터링 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

많은 단백질은 다른 단백질과 상호 작용을 일시적으로 또는 생물학적 기능을 수행하기 위해 다중 단백질 복합체에 통합되어 있습니다. 이분자 형광 보완 (BiFC)는 식물 세포에서 이러한 상호 작용을 모니터링 할 수있는 생체 내 방법입니다. 제시된 프로토콜 추궁 후보 단백질이 형광 단백질의 상보 반쪽에 융합되고, 각 구조물은 아그로 박테 리움 - 매개 형질 전환을 통해 식물 세포 내로 도입된다. 이어서, 단백질은 일시적으로 담배 잎에서 발현되고 복원 된 형광 신호는 그대로 셀의 공 초점 레이저 주사 현미경으로 검출 할 수있다. 이것은 상호 작용 자체뿐만 아니라 시각화를 허용하지만, 또한 단백질 복합체의 세포 내 지역화는 결정될 수있다. 이를 위해, 형광 태그를 함유하는 표지 유전자는 이와 같은 t 셀룰러 구조를 시각화 BiFC 구조와 함께 공 발현 될 수있다그는 세망, 미토콘드리아, 골지체 또는 원형질막을 세포질. 형광 신호를 직접 표피 잎 세포 또는 쉽게 변형 담배 잎으로부터 단리 할 수​​있다 단일 원형질체에서 모니터링 할 수있다. BiFC 이상적으로 살아있는 세포 내에서 자연 환경에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하기에 적합합니다. 그러나, 식 강한 프로모터에 의해 구동되어야하고 상호 작용 파트너 인해 상호 작용 메카니즘을 방해 할 수있는 비교적 큰 형광 태그의 융합으로 변성되어 있음을 고려하여야한다. 그럼에도 불구하고, BiFC는 coimmunoprecipitation 같은 단백질 - 단백질 상호 작용, 생체 풀다운 분석 또는 효모 두 하이브리드 실험을 조사하고 다른 일반적으로 적용되는 방법에 대한 훌륭한 보완적인 접근 방식입니다.

이 예에서는 막 도킹 단백질 AtTPR7 및 Toc64와 세포질 분자 샤페론 HSP90의 상호 작용을 모니터링하는 BiFC 방법을 사용했다. AtTPR7는 초 translocon의 일부이며 아마도 ER 막에 번역 후 전위에 대한 분비 preproteins을 제공 세포질 보호자와 상호 작용합니다. 마찬가지로, 엽록체 외부 봉투에 Toc64는 HSP90 관련 엽록체 preproteins를 수신하여 번역 후 수입의 역할을합니다. 두 단백질 HSP90의 C-말단 MEEVD 모티브와의 ?...

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Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K 조회수.  Ludwig-Maximilians-Universität, München.  생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다. 

비디오: Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

연구

생물학

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimolecular 형광 Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...