Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (HiPSCs)

먼저, 배양된 섬유아세포 플라스크를 취하고, hiPSC 배양에 적합한 10센티미터의 세포 배양 플레이트를 플레이트당 4밀리리터의 저온 코팅 용액으로 코팅하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한다. 그 후, 섬유아세포로부터 배지를 제거하고, 플라스크 당 4밀리리터의 예열된 PBS로 이들을 세척한다. PBS를 흡인하고 섭씨 37도에서 5-7분 동안 배양하여 플라스크당 4밀리리터의 트립신-EDTA와 섬유아세포를 연관시킵니다.

위상차 현미경을 사용하여 세포 분리를 모니터링하고, 필요한 경우 플라스크 측면을 두드려 플라스틱 표면에서 세포를 분리합니다. 분리된 세포를 50밀리리터의 원뿔형 튜브로 옮기고, 빈 플라스크를 6밀리리터의 예열된 섬유아세포 배지로 세척한다. 원뿔형 튜브에 나머지 세포를 수집하고 풀링합니다.

그런 다음 섭씨 20도에서 5분 동안 200g에서 세포를 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 3밀리리터의 신선하고 예열된 PBS에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 세포를 세고, 1.5 곱하기 10 내지 6번째 섬유아세포를 새로운 원뿔형 튜브로 옮기고, PBS로 5 밀리미터 표시까지 채운다.

튜브를 섭씨 20도에서 5분 동안 200g에서 원심분리합니다. 상층액을 버리고, 세포 펠릿을 5밀리리터의 전기천공 매질에 재현탁하고, 다시 원심분리한다. 그 동안, 코팅된 10센티미터 세포 배양 플레이트로부터 코팅 용액을 흡인하고, 예열된 섬유아세포 배지 7밀리리터를 첨가한다.

원심분리가 끝날 때, 상층액을 버리고, 세포 펠릿을 전기천공 매질에 1.5배 10 내지 250 마이크로리터의 6번째 세포에 재현탁시킨다. 250 마이크로리터 셀 현탁액을 4mm 간격 거리의 전기천공 큐벳으로 옮깁니다. 다음으로, 각 플라스미드 4 마이크로그램을 전기천공 매질의 총 부피 50 마이크로리터에 첨가하여 혈장 형질감염 혼합물을 제조한다.

형질주입 혼합물을 큐벳으로 옮기고, 가볍게 튕겨서 부드럽게 혼합하고, 280V에서 한 펄스로 전기포증합니다. 마지막으로, 전기천공된 섬유아세포 150 마이크로리터를 제조된 10 센티미터 세포 배양 용기에 옮긴다. 세포를 분배하기 위해 플레이트를 모든 방향으로 세 번 교반하고 밤새 배양합니다.

섬유아세포는 150 내지 300 나노미터 크기의 긴 방추형 표현형으로 존재한다. 재프로그래밍 후 50마이크로미터의 작은 hiPSC가 있는 콜로니가 발생하여 뚜렷한 경계를 표시합니다. hiPSC는 높은 핵 대 신체 비율과 증가된 증식 속도로 구별됩니다.