세포 기반 프로토콜의 일반적인 목표는 인간 멜라닌세포 세포를 분리하고 배양하여 기존의 방법의 단점을 개선하는 것이다. 새로운 방법에서 우리는 재료 와 장비에 따라 상대적으로 짧은 시간에 1 차적인 멜라닌 세포의 더 많은 양을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 인간 조직은 2015년 5월 12일 자, 병원의 할례 수술에서 버려지고 기관의 인간 연구 윤리위원회 번호 2015120401의 지침에 따라 취급된 피부 조직에 대한 신선한 성인입니다.
이것은 필요한 모든 시약의 표시입니다. 멸균 기기와 재료를 미리 준비하고 조직을 접시에 넣고, 조직을 75%에탄올로 30초 간 세척하고, 세차액으로 조직을 5분간 편리하게 잘라내고 수술용 블레이드로 조직을 스크랩하여 지방층을 제거한다. 진피 측으로 조직을 평평하게 하여 밀리리터당 2.5밀리그램을 피부 조직에 공간 용액을 추가합니다.
뚜껑을 덮고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 둘째 날, 진피에서 표피를 벗겨 내고 즉시 37도센티미터의 수조에서 30분 동안 배양된 튜브에 0.05%의 트립신을 침수하여 세척용으로 다른 3가지 접시로 표피를 옮기는 다. 중화 솔루션의 동일한 볼륨을 추가합니다.
10~15회 용액을 위아래로 피펫합니다. 100 마이크로미터 매시 필터를 통해 솔루션을 전달합니다. 5 분 동안 200 배 g에서 원심 분리기는 티바 배지의 10 밀리리터에서 셀 팔레트를 다시 중단하는 슈퍼 네티얼을 제거합니다.
Y-27632의 10 마이크로미터를 추가합니다. 현미경의 밑에 보기의 필드인 정보를 표시합니다. 그것은 37섭씨 인큐베이터에서 배지 인큐베이트에 떠있는 세포를 보여줍니다.
이 뷰는 세포가 접시의 바닥을 연결하기 시작한 둘째 날의 보기를 보여줍니다. 그리고 9일째에 보는 것은 멜라닌세포의 명백한 예금이 존재한다는 것을 보여줍니다. PBS로 셀을 세척하는 상체 세척을 제거하면 2 분 동안 세포를 배양하는 0.05 %의 2 밀리미터를 추가하여 중화 용액의 2 밀리리터를 추가합니다.
원심 분리기는 5 분 동안 200 배 g에서. 10mm의 티바 배지로 셀 팔레트를 천천히 다시 일시 중단하는 상체를 제거합니다. 2일마다 배지를 변경합니다.
이 사진은 새로운 방법과 종래의 방법이 이 그림에 제시되도록 하나의 회로도도의 구절의 전망을 보여줍니다. 조직 제제 및 새로운 방법의 소화를 위한 절차는 종래의 방법과 동일하다. 유일한 차이점은 10 마이크로 미터 Y-27632의 존재와 그녀의 티바 매체에서 10 분 안에 접종 된 고립 된 지방 세포입니다.
이틀 후 Y-27632에서 보충 교재 없이 티바 매체로 미디어를 대체. 본 패널은 종래의 메소드 탑 행에 의해 제조된 멜라닌세포의 대표적인 이미지를 보여주며, 3일째, 6일째, 8일째에 멜라닌세포의 수를 호출한 후 3일째, 6일째 및 8일째에 새로운 방법 하단행에 의해, 새로운 방법은 멜라닌세포 수율을 약 5배 증가시켰다는 것을 발견했다. 8 일 카운터 후 우리는 다스를했고 각 단일 요리에 멜라닌 세포의 수를 계산합니다.
결과는 새로운 방법에 의해 분리된 멜라닌세포의 수가 종래의 방법보다 훨씬 더 많은 것을 보여주었다. Ki67 서 새로운 방법에 의해 분리 된 멜라닌 세포가 일반적으로 증식 할 수 있음을 확인 더 중요하게 우리는 새로운 방법으로 멜라닌 세포의 정상적인 기능을 얻었다. 우리는 격리에서 초기 통로 후에 멜라닌세포의 순도를 확인했습니다.
멜라닌세포에서만 표현된 MITF 발현을 위한 1개의 멜라닌세포통로. 그리고 우리는 거의 100%의 세포가 첫번째 통로 후에 얻은 순수한 멜라닌세포를 나타내는 MITF를 위해 긍정적이었다는 것을 것을을 발견했습니다. 새로운 방법에서 분리된 멜라닌세포를 테스트하는 것은 정상적으로 작동할 수 있다.
우리는 체외에서 90 개 이상의 힘 냉각으로 멜라닌세포를 처리하고 힘 냉각이 멜라닌세포의 색소 침착을 유도 할 수 있음을 관찰했다. 이러한 데이터를 종합해서 새로운 방법에서 분리된 멜라닌세포가 일반적으로 색소 침착을 생성할 수 있음을 시사한다. 1 차적인 멜라닌세포는, 위에 명시되고 문화에서 확장된 바와 같이 실험실 연구 및 임상 응용을 위해 쉽게 사용되었습니다.
ID Y-27632가 2일 전에 초기 배양 배지로 보고하면 멜라닌세포에서 크게 증가할 수 있다. 요약하자면, 우리는 성공적으로 성인 조직에서 순수한 기본 멜라닌세포를 분리하는 새로운 간단하고 매우 효율적인 방법을 설립했다.
