이 작품은 VA 리서치 서비스에서 C. - MT에 NIH와 메리트 리뷰에서 RO1 지원하고, CWL하는 개인 NRSA했습니다

일반적인 설계 고려 사항 사진 자극의 파장 이러한 optogenetic의 실험으로 보이는 범위에있는 경우, 시스템의 레이아웃이 UV 광분해 실험에 비해 상당히 간단합니다. 하나는 현미경 회사의 모든에서 사용할 수있는 듀얼 카메라 포트 모듈을 구매해야합니다. DMD 비행기는 두 카메라의 포트 중 하나의 공액 이미지 평면에서 위치 수 있습니다. 카메라 선도 이미징 튜브 렌즈를 상용 현미경에도 자외선 파장에 대한 수정되지 않기 때문에 자외선 광분해에있는 치과에서 발생하는 빛을은 에피 조명 경로 (그림 3A)를 통해 가지고 있어야합니다. 350 nm의에서 이미징 튜브 렌즈의 구면 수차가 꽉 조여에 빛을 집중하고 충분한 공간 해상도를 생성할 수있는 능력을 막기 위해 충분히 심각한 것입니다. collimated 레이저가 같은 광학 축을 따라 가져온 때 튜브 렌즈가 제거되기 때문에이 문제는 공촛점 현미경에서 발생하지 않습니다. 거기 튜브 렌즈가 모든 부분 UV 파장에서 구면 수차에 대한 수정 때문에 자외선 조명의 문제는 에피 형광 경로를 통해 조명을 동원하여 해결하실 수 있습니다. 우리는 어떤 학위 저널 소원에 현미경의 광학에 확장할 수 있습니다. 과학 커뮤니티는이 주제에 일반적으로 빠른 관심에 잘 그것을 가르치는 많은 소스이 없습니다. 현미경의 수정을 최소화하고 있기 때문에 에피 형광 장치에 꽉 공간 제약을하기 위해서는 DMD은 릴레이 렌즈 (관련하여 DMD 장치의 위치 지적 만든 새로 만든 공액 이미지 비행기에 배치됩니다 현미경). 상업적인 자외선은 릴레이 렌즈 (그림과 현미경에 지적) (특수 광학) 구입한 수정. DMD의 조명 는 바이너리 입력을 받으면 micromirror는 긍정적이고 부정적인 12 ° 기울기 칩의 비행기에 상대적으로 전환할 수 있습니다. 회전의 축은 각 미러 (칩의 양쪽에 45 °)의 대각선 모서리를 따라합니다. 미러 회전의 방향은 칩의 전면 표면 한 모서리에서 황금 색의 삼각형으로 지정되어 있습니다. micromirror의 기울기 각도가 들어오는 조명 빔의 높이와 azithmus의 정렬을 지시. 조명 광선의 피치는 DMD 칩 및 미러 회전 축에 수직으로 azithmus 요구의 수직 축에서 24 °해야합니다. 정확한 빔 정렬 효율적인 운영을 위해 중요합니다. 프로토 타입 시스템에서 우리는 우리가 설계와 가공에 대한 정확한 부족한 허용 여러 수동 기울기 조정을 설계했습니다. 이것은 필요한 것보다 상당히 더 부피가있는 시스템에서 발생. 빛 가운데에 데려 와서 대체보다 소형 협정 (유용하다고 판단하는 경우 대체 디자인을 표시) 할 수 있습니다. 광분해 실험을위한 레이저 소스 신속한 uncaging에 대한 높은 빛의 강도 집중 광선이 필요한 생성하기 위해 필요합니다. 고휘도 급격히 집중 조명이 필요하지 않습니다 optogenetic 실험 들어, 비 코히어런트 광원은 적절한 것입니다. 광분해 실험은 여기에 설명된 우리는 유사 지속적인 다이오드는 주파수 NdVO4 레이저 (1 W, 355 nm의)를 배로 고체 (DPSS)을 펌핑 고용. (광분해에 대한 광원의 선택에 대한 자세한 논의에 대한 참조 2 참조). DMD 시스템을 사용할 때 레이저 출력의 작은 파편만이 실제로 표본 전달되기 때문에 상대적으로 높은 전력 레이저 여기에서 설명하는 실험이 필요합니다. 표본에게 전달 빛의 금액은 레이저 빔 조명에 의해 지역 내에 ON / OFF 거울의 숫자의 비율에 비례합니다. 레이저 광원이 필요한 경우, 그것은 치과를 조명에 대한 올바른 축을 따라 위치와 방향을 쉽게 할 수 있도록 다중 광섬유로 레이저의 출력을 실행하는 것이 좋습니다. 광섬유를 통해 빛을 전송하는 것은 일관된 조명에 내재된 작은 반점 패턴을 제거하는 방법을, 두 번째 문제를 해결합니다. 섬유 ~ 40 kHz에서에서 진동 압전 섬유 신장기 (모델 915, 캐나다 계측 및 연구, (주)) 주위에 상처입니다. (장비에 지점이 밖으로) 섬유의 스트레칭 미세한는식으로 효과적으로 speckling의 효과를 제거, 각 사진의 자극 펄스의 밀리초 기간 동안 패턴을 여러 번 작은 반점 이동하기 충분합니다. 광섬유의 출력은 다음 자외선 현미경 목표 (올림푸스 DApo20UV)와 collimated 있습니다. (이것을 시점) 시스템의 광학 해상도의 교정은 그림에 표시됩니다. 3B. 로 사진의 장소의 위치의 함수로 전류 흐름의 진폭에 의해 측정된 유효 생리 해상도자극은 그림에 표시됩니다. 3C. 다양한 농도의 photostimulation 전류 응답을 그림 그림입니다. 3D. 시스템 운영 : DMD 거울과 공동 등록 CCD 픽셀 사내 소프트웨어는 이미지 CCD 카메라의 특정 픽셀 개별 DMD 미러의 서신을 결정하는 것을 작성되었습니다. 이 소프트웨어 내에있는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)는 다음 사용자가 마우스로 태그 CCD 이미지의 영역에 해당하는 DMD 미러를 지정할 수 있습니다. 따라서 사진 자극에 대한 위치는 단순히 컴퓨터 화면에 표시되는 이미지 위로 커서를 이동하고 관심있는 태그 영역을 클릭하여 태그를하실 수 있습니다. (돌기 아버의 형광 이미지는 컴퓨터 화면에 표시됩니다. 학생이 컴퓨터 화면에 이미지를 통해 위치 번호를 표시합니다.) 빛의 전송을위한 패턴을 프로그래밍 운영자에 의해 컴퓨터 화면에 표시된 패턴은 별도의 이미지 시리즈로 저장됩니다. 각각의 공간적 패턴에 대한 레이저 펄스의 타이밍은 다음 데이터 수집 프로그램 (pClamp)와 통합되어 소프트웨어로 프로그래밍합니다. (이것을 보여줍니다.) DMD 패턴에 레이저 펄스를 조정 데이터 수집 프로그램은 시작하고 대상 신경 세포에서 전기 신호를 채워 DMD 전자, 레이저의 게이팅 및 패치 인수의 타이밍을 조정합니다. (컴퓨터에서이 시퀀스를 시뮬레이트) 실험 데이터 말초 돌기 분기 지점에 걸쳐 비선형 변론 전극과 돌기 통합은 전통적으로 개별 지역에서 자극의 진폭을 변화보다는 일정한 강도를 유지하면서 자극의 영역을 확대하여 실시되었습니다. electrogenesis과 위치에 의존 채널 모집의 포화에 관한 문제는 결과와 결론에 영향을 미칠 수있다. 분산 모수 석의 자극을 쉽게 DMD 기반 시스템 (그림 4A)를 사용하여 구현할 수 있습니다. 입력 강도는 photostimulation의 명소의 수를 늘림으로써 다양한했다. 우리는 공간 변론은 두 딸 지점에 도착 증가 입력 amplitudes와 함께 점점 위에 - 선형되는 지점 지점에 걸쳐 비선형 수 있습니다 볼 수 있습니다. 위에 - 선형성은 크게 NMDA 수용체를 중재하고 문이 채널 (그림 5) 전압하지 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. DMD에있는 micromirrors 운영. (사이드 뷰) 개인 거울에서 감독 정전기 세력이 거울은 두 가지 방향 12 ° 수평에서 중 하나에 기울어져되도록. ON 위치에 입사 빔은 칩의 광학 축 직각 따라 이동합니다. OFF 위치에 입사 빔은 48 °에서 축을 이동합니다. 거울 사이의 얇은 간격을 조회 라이트는 24 °에서 축을 이동합니다. (톱 뷰) 기울기는 45 ° 방향이다 거울과 칩의 측면과 관련하여. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 현대 형광 현미경의 기본 레이아웃. 필터 큐브는 객관적이고 튜브 렌즈 사이의 &quot;무한의 공간&quot;에 위치합니다. 카메라 연결 및 샘플에 빛을 가져다 조명 경로가 이미지 경로가 있습니다. 이 두 빛의 경로 튜브 렌즈는 일반적으로 디자인과 초점 길이 다릅니다. 조명은 아니지만 영상, 튜브 렌즈는 자외선 스펙트럼에서 작동하도록 설계되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. UV 기반 DMD 시스템 레이아웃. 조명은 UV 스펙트럼에있다면, 그것은 자외선에 대한 해결 튜브 렌즈를 통해 가지고 있어야합니다. 이미지 경로에 튜브 렌즈는 자외선을 위해 설계되지 않습니다. 릴레이 시스템을 쉽게 액세스할 수 공액 이미지 비행기를 만들 필요합니다. 현미경의 다른 공액 이미지 비행기도 곳곳에 빨간색 선으로 표시됩니다. 하나의 이미지 평면에 밝은 패턴이 다른 공액 비행기에서 예상하고 있습니다. 이미징 동안 샘플 비행기의 패턴은 감지기 / 카메라로 예상된다. 조명에 대한 DMD에 의해 생성된 패턴은 샘플로 예상된다. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 가시 광선 DMD 프로젝션 시스템 레이아웃. 조명 빛이 보이는 범위에있다면, 그것은 영상 조명 경로를 통해 DMD 생성된 빛의 패턴을 제공할 수 있습니다. 이것은 쉽게 commerci로 구현할 수 있습니다알 듀얼 카메라 포트 첨부하고 해당 이색성 거울. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 체제의 래터럴 해상도. (A) 형광 목표 광학 해상도는 ~ 2 μm의 수 있습니다. (B)로 dendrite에 걸쳐 갇힌 글루 탐 산염의 광분해에 의해 측정된 유효 해상도는 ~ 5 μm의 수 있습니다. 증가 거리는 글루 탐 산염의 확산과 dendrite의 유한 너비의 조합에 의한 것입니다. (C) 광분해은 시냅스 사건의 속도론을 모방 수 있습니다. 전압의 가족이 현재의 응답 dendrite로 전달 빛 에너지의 차이에 의한 것입니다 고정되어. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6. 돌기 분기 지점에 걸쳐 비선형 변론. (A) 분산 입력은 별도로 두 가지 돌기에 적용됩니다. 각각의 전압 응답은 다음과 같습니다. (B) 자극 그러면 동시에 주어집니다. 측정 응답 (적색 추적)이 두 개인 응답 (회색 추적)의 산술 합계 다를 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7. Supralinear 변론은 NMDA 수용체 따라 달라집니다. (A) APV는 선택 NMDA 수용체 길항제는 supralinear 변론을 차단합니다. (B) 자극 강도 관계 및 NMDA 수용체 길항제하기 위해 감도는 꾸몄다됩니다.

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	<li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li><li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+neurotransmitters:+Theory+and+procedures+for+light+delivery.">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+Technology+Feature,+Cell+imaging:+Light+activated.">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li><li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters.">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li><li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Digital Light Processing and MEMs: An overview. , .</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

DMD 기반 photostimulation 접근의 장점은 목표가 비교적 큰 지역을 차지하고 상황에 가장 분명합니다. 관심의 대상이 같은 몇 가지 돌기의 쪽이 같은 매우 작은 경우, 순차 스캐닝 공촛점 및 2 광자 시스템은 좀더 나은 접근 방법이 될 가능성이 높습니다. DMD 접근법 중 하나는 큰 약점이 가능한 조명 자사의 비효율적 사용합니다. 사용 가능한 빛의 대량은 반드시 OFF 거울로 이동하고 사용되지 않습니다. ...

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Modern upright fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera and image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and data acquisition/interface system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DLP Discovery Developer Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ALP3 USB interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S2 + Optics w/LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual camera port unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPSS Laser Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser shutter Model LS6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canadian Instrument and Research, Ltd </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100 um core multimode fiber</td>
</tr>
<tr>
<td>Multimode Fiber launcher </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Oz Optics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Signal generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>up to 50 kHz</td>
</tr>
<tr>
<td>Beam collimator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>DApo20UV340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UV relay lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Special Optics</td>
<td>#: 54-25-60-355</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patterned photostimulation with digital micromirror devices to investigate dendritic integration across branch points

라이트의 연결을 흥분을 제어하는​​ 다목적 정확한 의미합니다. 이러한 채널 rhodopsin 및 갇힌 신경 전달 물질로 빛이 민감한 effectors의 최근 도입 공간 및 실험 신경 과학에 대한 유용한 시간에 빛의 패턴을 제어하는​​ 더 나은 방법을 개발에 관심이 들어서있다. 공촛점 및 2 광자 현미경에서 근무 한 종래의 전략은, 회절 제한된 장소에 조명을 집중하고 관심의 영역을 통해 순차적으로 그 하나의 자리를 검사하는 것입니다. 큰 영역을 짧은 시간 창, 이미지에 비해 photostimulation 더 적용 문제 이내에 자극해야 할 경우이 방법은 문제가된다. 대체 전략은 디지털 micromirror 장치 (DMD)의 도움을 대상에 전체 공간 패턴을 프로젝트에있다. DMD 접근 방식은 하드웨어 구성 요소가 상대적으로 저렴한 때문에 매력이며 상업적 이익에 의해 지원됩니다. 이러한 시스템이 직립 현미경 사용할 수 없기 때문에, 우리는 DMD 시스템의 구축 및 운영에 중요한 문제를 논의합니다. 우리가 주로 UV 광분해을위한 시스템의 구축을 설명한다하더라도, optogenetic 실험에 대해 훨씬 더 간단 가시 광선 시스템을 구축하기위한 수정도 제공됩니다. UV 광분해 시스템 신경 과학에 근본적인 질문을 연구하기 위해 실험을 carryout 위해 사용되었던, 어떻게 공간 말초 돌기 분기 지점에 걸쳐 통합된 입력을 배포합니다. 결과는 통합 지점 지점에 걸쳐 비선형 수 있으며 supralinearity가 주로 NMDA 수용체에 의해 중재되어 좋습니다.

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Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

디지털 micromirror 장치 (DMD)는 흥분의 연결을 제어할 수있는 시간과 공간의 복잡한 패턴을 생성할 수 있습니다. 설계, 건설 및 DMD 시스템의 운영과 관련된 문제가 논의됩니다. 이러한 시스템은 말초 돌기 분기 지점에 걸쳐 비선형 통합의 데모를 활성화.

브랜치 지점 간 돌기 통합을 맡은 이후로 디지털 Micromirror 장치와 패턴 Photostimulation

Light is a versatile and precise means to control neuronal excitability. The recent introduction of light sensitive effectors such as channel-rhodopsin ...

patterned-photostimulation-with-digital-micromirror-devices-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.6K 조회수.  University of Maryland School of Medicine. 디지털 micromirror 장치 (DMD)는 흥분의 연결을 제어할 수있는 시간과 공간의 복잡한 패턴을 생성할 수 있습니다. 설계, 건설 및 DMD 시스템의 운영과 관련된 문제가 논의됩니다. 이러한 시스템은 말초 돌기 분기 지점에 걸쳐 비선형 통합의 데모를 활성화.

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

연구

생체공학

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and membrane environment2.
Coagulation Factor VIII (FVIII)3 is a multi-domain blood plasma glycoprotein. Defect or deficiency of FVIII is the cause for Hemophilia type A&#160;-&#160;a severe bleeding disorder. Upon proteolytic activation, FVIII binds to the serine protease Factor IXa on the negatively charged platelet membrane, which is critical for normal blood clotting4. Despite the pivotal role FVIII plays in coagulation, structural information for its membrane-bound state is incomplete5. Recombinant FVIII concentrate is the most effective drug against Hemophilia type A and commercially available FVIII can be expressed as human or porcine, both forming functional complexes with human Factor IXa6,7.
In this study we present a combination of Cryo-electron microscopy (Cryo-EM), lipid nanotechnology and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.&#160;The representative results demonstrate that our approach is sufficiently sensitive to define the differences in the helical organization between the two highly homologous in sequence (86% sequence identity) proteins. Detailed protocols for the helical organization, Cryo-EM and electron tomography (ET) data acquisition are given. The two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) structure analysis applied to obtain the 3D reconstructions of human and porcine FVIII-LNT is discussed. The presented human and porcine FVIII-LNT structures show the potential of the proposed methodology to calculate the functional, membrane-bound organization of blood coagulation Factor VIII at high resolution.

We present a combination of Cryo-electron microscopy, lipid nanotechnology, and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory&#160;to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.

지질 나노 튜브에 혈액 응고 인자 VIII의 나선형 조직

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

철 산화물 나노 입자와 기능화 자기 세균 Nanocellulose의 제작

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

면 분석 장치를 제조

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3D 종이 미세 유체 장치를 구축하기 위해 접착제 패터닝을 사용하여

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

실험적 및 유한 요소 의정서는 관절 연골에서 중립 및 충전 용질의 운송을 조사하기 위해

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

3D Bioprinting을 이용한 Spheroids의 기계적 통합을 보여주는 심장 조직의 생성

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable microfluidic devices. Here, a protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices is demonstrated, where soft lithographic techniques are used to embed transparent Calcium Fluoride (CaF2) view-ports in connection with observation chamber(s). The method is based on a replica casting approach, where a polydimethylsiloxane (PDMS) mold is produced through standard lithographic procedures and then used as the template to produce a plastic device. The plastic device features ultraviolet/visible/infrared (UV/Vis/IR) -transparent windows made of CaF2 to allow for direct observation with visible and IR light. The advantages of the proposed method include: a reduced need for accessing a clean room micro-fabrication facility, multiple view-ports, an easy and versatile connection to an external pumping system through the plastic body, flexibility of the design, e.g., open/closed channels configuration, and the possibility to add sophisticated features such as nanoporous membranes.

A protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices with transparent view-ports for visible and infrared light imaging is described.

뷰-포트 표시 하 고 적외선 빛에 투명 한 플라스틱 미세 소자를 제작 하기 위한 소프트 리소 절차

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...