This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).

모든 생체 연구는 노트르담 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인과 여성 C57 / BL6J 마우스를 사용 하였다. 1. 쥐 난소 암 세포 배양 <ol><li> 다음과 같이 ID8 뮤린 난소 암 세포 배양액을 4 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 5 μg의 / ㎖ 트랜스페린으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 1 L 5 NG / ㎖ 나트륨 셀레 나이트. </li><li> RFP 및 선별 마커 (블라스트 유전자)를 발현하는 렌티 바이러스 상업적 조달 입자를 사용하여 적색 형광 단백질 (RFP)를 표현하는 ID8 뮤린 난소 암 세포를 형질 도입 13. 녹색 형광 단백질이 사용되지만, 약한 형광 신호를 제공 할 수 있습니다. <ol><li> 직전 전달에, 배양 세포를 50 - 70 % 최종 1 ml의 폴리 브렌 (5 μg의 / ㎖를 포함 합류하고 (페니실린 / 스트렙토 마이신)없이 신선한 매체를 추가집중). </li><li> 조심스럽게 피펫 RFP-렌티 바이러스 (20 μL)는 접시에 적가하고 72 시간 동안 37 ℃로 배양한다. 매체를 제거하고 24 시간 동안 새로운 배지와 배양한다. 배양 배지 (5 μg의 / ㎖)로 블라스트를 첨가하여 형질 도입 된 세포의 선택을 시작하고, 형광 현미경 (그림 1)을 사용하여 적혈구를 모니터링. </li></ol></li><li> 배양 조직 배양 접시에 약 106 개 세포를 파종하고, 세포 단층이 합류 할 때까지 광학 현미경을 이용하여 가시화 일일 ID8 매체에 RFP 표지 된 세포. </li><li> 융합은, 트립신 (0.25 %, 3 분)를 사용하여 세포를 수확하고, 세포가 분리 될 때까지 37 O C의 배양기에 플라스크를 반환하는 경우. </li><li> 혈청을 함유 ID8 배지 6 mL를 트립신을 중화. 최대 피펫과 접시의 바닥에 대한 아래로, 다음 15 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 2 분 동안 1,200 RPM에서 원심 분리는 다음 GL을 사용한 매체 대기음엉덩이 피펫. </li><li> 부드럽게 따뜻한 PBS 6 ㎖에 재현 탁 이상 1.5로 원심 분리하여 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 세포를 씻으십시오. 5 × 106 세포 / ml의 최종 농도로 PBS에 재현 탁. 주입 할 때까지 따뜻한 세포 (37 O를 C)를 유지합니다. </li></ol> 2. 복강 내 ID8 세포의 주입 및 생체 이미징 <ol><li> 복강 내 (IP) 주입을 통해 천만 세포의 총 따뜻한 ID8-PBS 용액 2 ml로 각각의 마우스를 주입한다. 종양 세포는 매주 라이브 영상과 함께 약 10 주 동안 생체 내에서 성장 할 수 있습니다. </li><li> 즉시 (0.5 L / 분, O 2 유량에 2.5 % 유량) 이소 플루오 란을 사용하여 각각의 마우스를 마취 한 다음 마우스의 무게 및, 그 후 주입 매주 다음. 주 : 마우스하지 종양 부담 정량적 측정 아니라 연구에 걸쳐 마우스 개체 실제 진행하는 일반적인 수단으로 칭량 하였다. 마우스는 무게TS는 자신의 기존의 가중치와 비교 하​​였다. <ol><li> 이소 플루오 란 챔버에 배치하여 쥐를 마취. 절차 전반에 걸쳐 2.5 % 유량 이소 플루오 란에 노출 코 콘에 마우스 머리를 배치하여 스캔하는 동안 일정한 마취를 유지한다. </li></ol></li><li> 검은 머리는 형광 신호의 감쇠 원인이됩니다, 각 마우스의 몸통과 복부에 머리를 제거하는 제모 크림을 사용합니다. 마우스는 제모 크림의 도포 후 따뜻한 물로 목욕을하고 RT 종이 타월로 건조된다. </li><li> 마취 동안, 작은 동물 광학 이미징 시스템을 이용하여 각각의 마우스의 전신 스캔. 각 시점에서 일대의 모든 마우스를 스캔합니다. 다음 두 단계 프로토콜 (그림 2A)를 사용합니다 : <ol><li> 1 단계에서, 형광 표지 (RFP) 종양 세포를 관찰 440 내지 460 nm 인, (4)의 여기 필터를 사용하여 5 개의 이미지를 수집하는 멀티 스펙트럼 획득을 실행할80 내지 520 nm의 파장이 540 nm, 600 nm 인 발광 필터. 15 초 표준 노출, 2 × 2 비닝 (binning), 160mm의 FOV, 1.1 F 정지 다음 인수 매개 변수를 사용합니다. </li><li> 2 단계에서, 전체 동물을 관찰 오픈 여기 필터 (흰색 빛), 오픈 방출 필터, 2 × 2 비닝 (binning) 0.2 초 표준 노출과 16cm의 FOV를 사용하여 반사 이미지를 획득한다. 참고 : 실제 촬상 시간 ~ 1 분이다. </li></ol></li></ol> 3. 마우스 해부 및 이미지 인식 <ol><li> 실시간 이미징 (복부 팽만에 의해 입증되는 바와 같이) 복수의 광범위한 복강 질환 동물 전시 축적 감소 또는 체중 20 % 이상, 혼수 또는 고통의 다른 징후의 이득의 존재를 표시하면, CO (2)를 이용하여 각각의 마우스를 안락사 마취 경추 탈구시켰다. </li><li> 뾰족한 dissectio를 사용하여 마우스의 복부 정중선을 따라 전방으로 피부를 잘라n 개의 가위, 흉곽의 바닥에 허벅지의 상단에서. 전용 스킨 층 (그림 2Bi)을 극복하기 위해 세심한주의를 기울입니다. 조심스럽게 복막 벽을 뚫지해야되고, 복막 조직으로부터 피부를 구분합니다. </li><li> 피부의 두 플랩을 만들 수 흉곽의 바닥과 허벅지의 상단 양쪽 옆으로 잘라 날카로운 해부 가위를 사용하여 (그림 2B II, III). </li><li> 오픈 피부 플랩과의 복부 측면에 각 마우스 (복강이 아래로 향하도록) 뽑아 놓고 작은 동물 광학 이미징 시스템 사용 현장에서의 장기와 각 마우스를 스캔 (그림 3A를, B). <ol><li> 2.4.1.-2.4.2에 설명 된 것과 같은 이미지 획득 파라미터를 사용한다. </li></ol></li><li> 간, 복막 / 췌장, 위, 다이어프램, 소장, 대장, 좌우 복막 난소 kidne 포함한 개별 복강 장기를 추출하여 마우스를 해부 계속YS, 장간막 지방 패드. <ol><li> 관찰 열거하고, 각 기관에 보이는 종양을 기록한다. 각 종양의 직경을 측정하는 캘리퍼스를 사용한다. </li><li> 매체로 2 5mm와 같은 대형보다 5mm 사이에 작은으로 직경이 2mm보다 종양이 덜 지정합니다. </li></ol></li><li> 장기 스캔 템플릿 각 기관에 대해 소정의 위치를 식별합니다 (그림 4)에서 장기를 놓습니다. 촉촉한 기관을 유지하기 위해 PBS를 사용합니다. </li><li> 작은 동물 광학 이미징 시스템 (그림 3C, D)를 사용하여 기관의 각 시트를 스캔합니다. <ol><li> 단계 2.4에 기재된 것과 같은 화상 획득 파라미터를 사용한다. </li></ol></li><li> 스캔 한 후, 10 % 포름 알데히드의 장소 기관은 조직학에 대한 후속 처리를 가능하게합니다. </li></ol> 제 종양 부담 4. 정량전자 형광 이미지 <ol><li> 각 멀티 스펙트럼 스캔 자동 형광의 양을 감소시키기 위해, 먼저 작은 동물 촬상 시스템에 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 파일을 unmix. <ol><li> 생체 스펙트럼 파일에서, Autofluor 다음 : 먼저 RFP로드 혼합하지 않은 이미지 창에서 생체 레드 파일에서와 Unmix을 선택합니다. </li></ol></li><li> 16 비트 티파니 (눈금) 형식으로 .bip 파일을 내 보냅니다. </li><li> (현장에서 장기와 생체 장기 다음 전체 마우스 본체) ImageJ에 소프트웨어를 사용합니다. <ol><li> ImageJ에있는 기관 스캔 템플릿 파일의 16 비트 .TIFF 파일을 열&gt; 파일 열기를 사용합니다. </li><li> 이미지&gt; 조정에서&gt; 밝기 / 대비, 최소 0으로 값을 표시하고, 최대 35,353에 값을 표시 한 후 아래 설정을 선택이미지&gt; 조회 테이블, 레드 핫을 선택합니다. 참고 : 다양한 동물 모델은 서로 다른 휘도 레벨을 필요로하지만, 소정의 연구에 걸쳐 일관된 휘도를 유지하는 것이 중요하다. </li><li> 자유형 선택 도구를 사용하여 각 장기 주변의 관심 선택 (ROI)의 자유 형태의 영역을 그리 각 장기의 면적을 계산하기 위해 측정 도구 (CTRL + M)를 사용한다; 스프레드 시트의 각 장기의 면적을 기록한다. </li><li> 각 기관 주위에 그려진 ROI으로, 오른쪽 ROI 내에서 클릭 만 기관을 포함하는 복제를 선택합니다. </li><li> 임계 값&gt; 조정&gt; 이미지에서 개별 기관 보면서, ONL 선택 + 1200의 낮은 임계 값 레벨과 + 1700의 상위 임계 값 레벨에 이미지의 임계 값을 설정하는 선택y를 가장 밝은 형광 영역과 어두운 배경을 선택 확인; 확인을 선택합니다. 참고 : 이전에 밝은 영역이 분석 단계 선택되도록 위 그림과 같이 이미지가 ImageJ에있는 임계 값 슬라이더의 수동 조작이 필요할 수 있습니다. 다른 질병 모델 다른 임계 제한을 필요로하지만, 소정의 연구에 걸쳐 일관되는​​ 임계 레벨을 유지하는 것이 중요하다. </li><li> 분석에서&gt; 크기 변경, 입자 분석 (픽셀 ^ 2) 10 무한대에가보기로 선택합니다 개요 만 &quot;결과 표시&quot;를 선택하고 지역과이 밝은 지역의 원시 통합 밀도를 모두 측정 할 확인을 클릭하여 확인 간주 종양. </li><li> 표면적의 값과 표시 각 종양 선택 원시 집적 밀도를 녹음 <strong&gt; 장기 표면 영역을 포함하는 동일한 스프레드의 결과 표. </li><li> 분석에서&gt; 도구&gt; 교정 바, 기관의 이미지에 교정 규모 줄을 추가합니다. 참고 :이 예에서, 이것은 위 오른쪽, 검은 색으로 채우기 색, 흰색의 라벨 색상, 5 레이블의 수, 0으로 소수 자릿수, 12 글꼴 크기 및 확대로 위치를 변경하여 이루어졌다 4.0 인자와 굵은 텍스트를 가능하게한다. </li><li> 파일에서&gt; 다른 이름으로 저장 ...하는 .TIFF 및 .JPEG로 몽타주를 저장합니다. </li><li> .JPEG 기관의 파일 다음 삽입 아래&gt; 텍스트 상자를 엽니 다&gt; 파일 열기를 사용하여 </strong&gt;, 장기의 세 각 행 아래의 텍스트 상자를 만들어 장기 라벨을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 마우스 번호의 순서로 ImageJ에의 전신 스캔의 16 비트 티파니 각 파일을 엽니 다&gt; 파일 열기를 사용합니다. </li><li> 0 값을 표시하고, 최대 + 35,353에 값을 표시 한 다음 이미지에서&gt; 조회 테이블, 레드 핫을 선택 이미지에서&gt;,&gt; 밝기 / 대비를 조정 최소를 설정하는 선택합니다. </li><li> 파일에서&gt; 다른 이름으로 저장 ...,가. 티파니와 .JPEG로 몽타주를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 각 마우스의 각 장기에 대한 각각 종양 선택 영역 원시 집적 밀도를 추가하고 각 마우스의 총 장기 종양 영역을 기록한다. </li><li> 기록 된 영역과 원시 integrat을 정상화해당 기관 표면적 (표 1)에 의해 총 종양 면적 총 원료의 통합 밀도 값을 나눔으로써, 각 장기의 크기에 대한 ED 밀도 값. </li><li> 계산하고 정규화 종양 표면 영역과 상기 정규화 된 원시 집적 밀도 값 모두의 평균 플롯 (도 5a를, B). </li><li> 시각적으로 전이 병변에 대한 각 기관의 검사시 육안으로 볼 수 있던 종양을 계산하여 얻은 이들의 평균 값을 비교합니다. </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+and+antivascular+effects+of+AVE8062+in+ovarian+carcinoma.">Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma.</a> Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).</li><li>Picchio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+ovarian+carcinoma:+usefulness+of+[(18)F]FDG-PET+in+combination+with+CT+for+lesion+detection+after+primary+treatment.">Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment.</a> Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).</li></ol>

이 문서는 브루 커 BIOSPIN 후원 모드의 전 임상 영상에 특별한 문제의 일부입니다.

면역 된 마우스에서 수행되어야 인간 난소 암 세포를 사용하는 연구와 대조적으로,이 프로토콜은 상술 한 면역 C57 / BL6 마우스와 뮤린 동계 난소 암 세포를 이용한다. 이 종양 진행 및 전이 면역 침윤의 잠재적 역할에 대한 평가를 가능하게하지만, 복부의 표면에 검은 머리카락의 존재는 이미징 덜 민감 렌더링한다. 탈모의 사용은 촬상 전에 모발 화상 취득 향상을 제거하지만, 시간 소모적 특히 ?...

상피 난소 암 (EOC)는 2015 년 미국에서 추정 된 21,290 새로운 진단 및 약 14,180 사망자 1 부인과 악성 종양으로 인한 사망의 가장 흔한 원인이다. 여성의 대부분 (&gt; 75 %) 말기 질환으로 진단 (단계 III 또는 IV) 확산 - 내 복막 전이와 예후을 특징으로한다. 첫 번째 라인 화학 요법 다음 복강 질병의 재발은 일반적이며 사망률 2,3의 주요 원인을 나타냅니다. EOC는 직접 이웃 복막 기관에 기본 종양에서뿐만 아니라 해리로 확장 또는 단일 세포 또는 다세포 집계로 기본 종양 표면에서 세포의 발산을 모두 포함하는 독특한 메커니즘에 의해 전이를. 그들은 분리 - 유도 아폽토시스 4 레지스트 상기 세포를 복강 내로 흘려된다. 창고 종양 세포가 복막 림프 배수와 t을 차단으로 복막 복수의 축적은, 일반적이다umors는 혈관 투과성을 변경 성장 인자 생산. 이들은 앵커 복수 널리 보급 보조 병변 3,5- 생산 증식 그러자 흘렸다 종양 세포의 일부는, 소장, 간, 복막 및 장간막 포함한 복막 기관 및 구조물의 표면에 부착. 혈행 성 전이는 드물다. 따라서, 임상 관리는 일반적으로 (아무리 작은) 모든 눈에 보이는 종양의 절제로 정의 &quot;최적의 용적 축소&quot;를 포함하는 종양 감축 수술, 구성하지 않습니다. 전체 cytoreduction 전반적인 생존 -6,7- 상당한 증가와 연관된 식별 병변 제거 &lt;0.5 cm의 과제와 관련된다. 작은 동물 모델은 예후 바이오 마커 및 신규 화학 요법 또는 병용 요법 방식의 테스트의 식별에서뿐만 아니라 질병의 진행에 대한 우리의 이해를 개선 난소 암 연구의 유틸리티를 입증했다. 기본으로난소 암 발생과 전이의 사이트는 복강가, EOC 전이의 동 소성 모델은 복강 질환의 분석 및 특성을 포함한다. 화상 종양 세포의 능력이 최근 개선되었지만, 심지어 단일 세포 수준에서 여전히 EOC의 전이성 종양 부담을 정량화에 상당한 어려움이 존재한다. 이러한 문제로 인해 수, 크기 및 전이성 병변의 해부학 적 위치로 발생한다. 또한, 정상 숙주 세포를 구별하는 라벨 암세포에 대한 필요성이 존재한다. 이전의 연구는 항체 기반 프로토콜 라벨 또는 루시페라아제 8,9 종양 세포의 형질 전환을 이용했다. 암세포를 직접 형광 표식은 제 1997 10 Chishima 동료에 의해보고되었다. 형광 라벨 암전 (11, 12)를 추적하기 위해 외인성 기질의 첨가를 필요로 정교한 종양 세포 특이성을 제공하는 더 효율적인 수단을 제공하지 않는다 </suP&gt;. 여기서 우리는 뮤린 ID8 난소 암 세포 (13)와 면역 능력 C57 / BL6 마우스를 적색 형광 단백질 (RFP)로 이루어지는 동계 동 소성 이종 이식 모델을 사용 전이성 질환의 정량 분석 용 광학 이미징 방법 -tagged 설명한다. 우리는 상대 종양 부담 정량화하는 새로운 방법은 조직의 자동 형광의 제거로 생체 내 및 생체 이미징의 결합을 보여줍니다. 이 접근법은 난소 암 기관 특이 전이 특정 유전자, 성적인 또는 미세 환경 변형 및 / 또는 치료 방법의 효과를 평가하기위한 연구에 활용 가능성이있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:117px;">10-014-CM</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bruker Xtreme small animal imaging system</td>
			<td>Bruker Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bruker Multispectral software</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lentiviral particles with Red fluorescent protein</td>
			<td>GenTarget, Inc.</td>
			<td>LVP023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin for cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)</td>
			<td>purchases from drugstore&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/&#160;</td>
			<td></td>
			<td>free download</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dissecting tools (forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>&#160;RS 5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dissecting tools (Scissors)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS 5910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of intra-peritoneal ovarian cancer metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

난소 암의 전이 메커니즘은 다수의 작은 (&lt;2mm) 병변을 포함한 다양한 크기의 수많은 병변 이루어진 고도로 확산 복강 내 전이를 특징으로한다. 따라서, RFP 표지 된 종양 세포의 경우 (도 1) 및 광학 이미징 수동 계산 병변의 크기를 측정하는 다른 방법을 제공한다. 시간에 따른 종양 부담의 개발은 매주 복수의 존재 가능성을 측정하는 마우스 복부 둘레의 측?...

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Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

복강 내 난소 암 전이의 정량

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K 조회수.  University of Notre Dame. Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

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Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

실험 전이 분석

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

연구

의학

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex process that can involve many tissue types, span variable time periods, and often occur deep within organs, making it difficult to investigate and quantify. In addition, the efficacy of the metastatic process is influenced by multiple steps in the metastatic cascade making it difficult to evaluate the contribution of a single aspect of tumor cell behavior. As a consequence, metastasis assays are frequently performed in experimental animals to provide a necessarily realistic context in which to study metastasis. Unfortunately, these models are further complicated by their complex physiology. The chick embryo is a unique in vivo model that overcomes many limitations to studying metastasis, due to the accessibility of the chorioallantoic membrane (CAM), a well-vascularized extra-embryonic tissue located underneath the eggshell that is receptive to the xenografting of tumor cells (figure 1). Moreover, since the chick embryo is naturally immunodeficient, the CAM readily supports the engraftment of both normal and tumor tissues. Most importantly, the avian CAM successfully supports most cancer cell characteristics including growth, invasion, angiogenesis, and remodeling of the microenvironment. This makes the model exceptionally useful for the investigation of the pathways that lead to cancer metastasis and to predict the response of metastatic cancer to new potential therapeutics. The detection of disseminated cells by species-specific Alu PCR makes it possible to quantitatively assess metastasis in organs that are colonized by as few as 25 cells. Using the Human Epidermoid Carcinoma cell line (HEp3) we use this model to analyze spontaneous metastasis of cancer cells to distant organs, including the chick liver and lung. Furthermore, using the Alu-PCR protocol we demonstrate the sensitivity and reproducibility of the assay as a tool to analyze and quantitate intravasation, arrest, extravasation, and colonization as individual elements of metastasis.

Using quantitative PCR, we demonstrate how the well-established chick CAM model can be used to quantitatively analyze the metastasis of human tumor cells to distant organs.

조류 엠브료 모델을 사용하여 암 전이의 정량 분석

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

뼈 전이의 모델

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

비 침습적 영상에 대한 생쥐 모델 검색 및 모니터 난소 암 재발

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

인간 세포주에서 Chemoresistant 난소 암 줄기 세포에 대한 심화 학습

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.