JDRF, NIH (R01 - DK081469), 펜실베니아의 연방 (재생 의료 부여 4100043362에있는 우수를위한 센터), 천의 월 (바실 오코너 초보 학술 연구 수상), 그리고 펜실베니아 DERC 조종사의 대학 지원 및 타당성 부여 (DK19525).

1. CldU과 이두와 라벨링 조직 <ol><li> 물에 thymidine의 analogues을 (CldU 또는 이두) 디졸브. 각 화학 / 1mg ML을 무게와 증류수의 유리병을 별도로 추가할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 한 번에 하나씩 각 1 리터 준비합니다. </li><li> 저어 접시 또는 교반기의 다른 형태에있는 화학 물질을 디졸브. CldU 10 분 지나면 분해될 것이다. 실온에서 교반의. 이두는 37 선동의 시간 ° 통에 C 이상이 필요합니다. 워터 소스 이두의 용해도에 영향을 미칠 수있다. 이두가 밤새 떨고 후 일시 중지가 해제 남아있을 경우, 물 청소기 소스를보십시오. 솔루션은 4 어둠 속에서 ° C에 저장됩니다. </li><li> 원하는 라벨 기간 동안 쥐를 가장 먼저 thymidine이 포함된 솔루션을 (CldU 또는 이두)를 관리할 수 있습니다. 마우스가 레이블의 레이블이 지정되지 않은 기간 동안 물에 대한 액세스 권한을 허용하지 않습니다. 지정된 라벨 시대가 완료되면 (thymidine이 포함된 analogues 몇 시간의 혈청 하프 생활을) 적어도 24 시간 동안 레이블이 지정되지 않은 물로 막가는을 시작합니다. 원하는 라벨 기간 동안 생쥐에 두 번째 thymidine이 포함된 솔루션을 (CldU 또는 이두)를 관리할 수 있습니다. 리필 물 병은 정기적으로 탈수 방지! </li><li> 또는, 마우스는 CdlU 그리고 이두의 연속 intraperitoneal 주사로 분류하실 수 있습니다. 10mg / ML 농도에서 CldU이나 이두를 준비합니다. 이두는 정학에 가고 적극적으로 흔들어 다음 집중 수산화 나트륨 솔루션의 드롭 현명한 또한 필요할 수 있습니다. 초과 수산화 나트륨을 추가하지 마십시오. 이두의 10 ML 솔루션에 수산화 나트륨 한 방울 37 교반의 시간 다음 ° 통에 C를 추가합니다. 안 솔루션에 경우, 수산화 나트륨의 추가 반복합니다. intraperitoneal 우주로 g의 체중 당 100mcg를 주사. </li><li> 제어 슬라이드는이 프로토콜에 대한 필수적입니다. 결과적으로, 우리는 강력하게 조사가 감도와 특이성을 보장하기 위해 thymidine의 아날로그 라벨의 여러 변형을 수행하는 것이 좋습니다. 이들은 1 포함되어야합니다. 단 CldU와 라벨이 붙지만 마우스 2. 단 이두와 라벨이 붙지만 마우스 3. 순차적으로 CldU 그리고 이두와 라벨이 붙지만 마우스 4. 순차적으로 이두 그리고 CldU 처음에 역순으로 표시되었습니다 쥐, 물만으로 표시 모의 아르 5 쥐. CldU과 이두와 라벨 학습 때, 조사는 항상 관심의 조직에서 제어 슬라이드의 모든 5 위의 세트와 함께 전체 프로토콜을 수행한다. </li></ol> 2. 조직 하베스트, 고정 및 슬라이드 준비 <ol><li> 적절한 마취를 사용하여 치명적인 과다 복용을 수행하고 과다를 통해 마우스를 희생. 신선한 조직을 제거하고 24 시간 동안 4 4 % paraformalehyde ° C로 수정. 퍼가기 4에서 1시 4분 포르말린 버퍼와 저장 ° C로 조직을 전송합니다. </li><li> 또는 치명적인 과다 복용을 수행하고 혈액이 신체에서 해결이 될 때까지 생리 식염수로 왼쪽 심장 심실을 통해 마우스를 perfuse; 후 즉시 4 % paraformaldehyde의 30-50 CC와 perfuse. 퍼가기 4 ° C에서 1시 4분 포르말린 버퍼에 대한 관심과 저장소의 조직을 제거합니다. </li><li> 조직 탈수 및 파라핀의 포함 후, 5 미크론 조직 섹션 및 청구 슬라이드로 장소를 잘라. ° C 16시간에 대한 (아래 항원 검색 단계를 통해 필수) 슬라이드에 조직의 접착력을 보장하기 위해 65 슬라이드를 구워. </li></ol> 3. 탈수, Permeabilization 및 항원 불러오기 <ol><li> 5 분 두 크실렌 욕탕에서 슬라이드를 immersing하여 여분의 파라핀을 제거합니다. 각. </li><li> 100, 95, 90, 80 70 50 % 물로 희석 에탄올에 슬라이드를 immersing하여 조직을 Rehydrate. 3 분위한 슬라이드를 만끽해보세요. 각 농도에서 100 %로 시작하고 마지막 침수 50 %을 향해갑니다. </li><li> 5 분 슬라이드를 씻으십시오. 1X PBS 인치 </li><li> 5 분 (신선한 때마다 만들어진)에 대한 0.2 % 트리톤 - X 솔루션에 슬라이드를 immersing하여 세포를 Permeabilize. </li><li> 마이크 로파 조직 항원 검색을위한 슬라이드를 준비합니다. 솔루션 증발 손실 계정에 슬라이드의 맨 위에 5cm를 다루고 있도록 충분한 볼륨 0.01M 산도 6.0 나트륨 구연 산염 버퍼와 유리 비커에 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 솔루션 끓는 때까지 전자 레인지는 슬라이드 (30-10 분. 최대 전력으로). 솔루션은 서서히 끓는까지 전력을 절감 (10-80%)과 추가 20 분 동안 계속. 솔루션은 속도가 느린 종기로 유지하기 위해 정기적으로 전자 레인지를 확인합니다. </li><li> 플레이스 비커는 벤치 위에 슬라이드가 포함된 부드럽게 실온 (약 2 시간)로 냉각 수 있습니다. </li><li> 슬라이드가 온도계를 사용하여 실온에서 있는지 확인합니다. </li><li> 40 분 대한 1.5N HCL에 몰두 슬라이드. 상온에서. </li><li> 워시는 1X PBS, 5 분, 두 번 슬라이드. 세척 당. </li></ol> 4. 차 및 차 항체 <ol><li> 슬라이드가 전체 프로토콜을 통해 매우 촉촉한 유지하는 것이 중요합니다. 드라이 조직 훨씬 더 자동 것입니다- 형광, 결과 이​​미지가 사용할 수 없게 만드는. 한 번에, 프로세스 슬라이드 죽어 방지하기 위해. </li><li> (즉, 왁스) 펜을 차단 액체로 슬라이드에 서클 각 섹션을 참조하십시오. 1X PBS의 용기에 다시 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 서부 유럽 표준시 종이 타올을 배치하여 습기가 배양 챔버를 확인하는 것은 밀폐 플라스틱 용기의 바닥에 평평하게 하였다. </li><li> 1X PBS에 희석 10 % 당나귀 혈청 차단 솔루션을 확인하십시오. 완전히 솔루션의 각 부분을 커버하는 것이 중요합니다. 1 X 1.5 cm 아르 조직 섹션, 섹션마다 솔루션의 50 마이크로 리터 부피 충분합니다. </li><li> 슬라이드에 차단 솔루션을 추가합니다. 1X PBS에서 슬라이드를 제거하고 부드럽게 마른 종이 수건의 스택에있는 슬라이드 가장자리를 도청하여 여분 액체를 제거합니다. 플레이스 배양 챔버에서 슬라이드 각 섹션을 10 % 차단 솔루션을 50 마이크로 리터를 추가합니다. 모든 슬라이드는 1 시간 동안 실온에서 가까운 컨테이너와 부화를 완료하는 경우. </li><li> 이두를 감지 차 항체 희석을 준비합니다. 1X PBS에서 만든 5% 당나귀 혈청에서 1:250 농도에서 마우스 방지 BrdU를 희석. 슬라이드에서 차단 솔루션을 누르과 배양 챔버에 다시 넣으십시오. 각 섹션에 위의 기본 항체를 추가하고 4 박 품어 ° C. </li><li> 높은 엄중 세척을 (CldU 마우스 방지 BrdU의 antisera하여 바인딩을 최소화)을 준비합니다. (; 산도 8.0 36mM 트리스, 50mM NaCl, 0.5 % 트윈 - 20) 신선한 낮은 소금 TBST 버퍼를 확인합니다. 당신은 슬라이드의 쌍 당 버퍼 40 ML이 필요합니다. 각 50 ML 원뿔 관에 버퍼 40 ML을 추가합니다. 슬라이드를 추가하기 전에, 37에 앞서 열을 가하다 솔루션 ° C. </li><li> 한 번에 두, 배양 챔버에서 슬라이드를 제거 (조직 샘플은 서로 떨어져 얼굴 있도록) 다시 - 투 - 다시 그들을 장소와 여분의 기본 항체를 누릅니다. 낮은 소금 TBST와 커버로 가득한 튜브에 슬라이드를 삽입합니다. 20 분위한 튜브를 선동. 37 온도와 박테리아 문화 배양기를 흔들어 ° C 및 225 RPM으로 설정 속도 인치 </li><li> 슬라이드에게 신선한 1X PBS로 두 번 씻으십시오. 5 분. 세척 당. </li><li> 원하는 경우 CldU 및 조직 항원의 검출을 위해 다음 주 항체 솔루션을 준비합니다. 1X PBS에서 만든 5% 당나귀 혈청에서 1:250 농도에 쥐를 방지 BrdU를 희석. 기본 항체 용액으로 농도를 작업에 조직 항원에 대한 기본 antisera를 희석. </li><li> 슬라이드 초과 1X PBS를 탭 및 배양 챔버에서 그들을 놓으십시오. 각 섹션에 기본 항체를 추가하고 4 박 품어 ° C. </li><li> 슬라이드에게 신선한 1X PBS로 두 번 씻으십시오. 5 분. 세척 당. </li><li> 보조 항체 솔루션을 준비합니다. Cy2 당나귀 방지 밀고 1:250와 Cy5 당나귀 방지 마우스 5 % 당나귀 혈청을 포함하는 1X PBS 솔루션 1:500로 희석. 조직 항원 antisera의 기본 종을 감지하기 위해 Cy3 보조 추가합니다. 또한, 보조 항체 용액에 1:150에 DAPI의 ML / 0.4mg 재고 솔루션을 희석. </li><li> 배양 챔버에서 초과 1X PBS의에서 슬라이드와 장소를 누릅니다. 각 섹션 차 항체 솔루션을 추가하고 실온에서 1 시간 품어. </li><li> 슬라이드에게 신선한 1X PBS로 두 번 씻으십시오. 5 분. 세척 당. </li><li> 슬라이드 초과 1X PBS에서 탭과 골드 방지 페이드 설치 미디어 (dyanine 염료와 Vectashield를 사용하지 마십시오!) 연장과 커버 유리를 준수합니다. 공기 방울을 제거하기 위해 커버 전표를 누르십시오. 4 스토어 ° C. </li></ol> 5. 이미징 및 분석 <ol><li> 높은 에너지 광원, 계획 - apochromatic 목표, 그리고 고효율 현미경 카메라 (예 : 하마 마츠 오르카 ER)이 장착된 형광 현미경으로 이미지의 관심 조직을. AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (조직 항원)와 Cy5 (이두) 채널의 이미지를 캡처합니다. 단일 멀티 레이어 이미지 파일을 만들 이미지를 병합합니다. </li><li> 올바르게 수행할 경우, DAPI 스테인드 핵은 homogeneously 밝은 것입니다. 조직 항원 (예 : 인슐린)의 관심 세포를 공개해야합니다. DAPI이나 조직 항원과 얼룩 제거 커버 슬립과 보조 antisera의 응용 프로그램을 반복 숙박 1X PBS에 약하거나 일관성, 슬라이드 젖어있다면. </li><li> Cy3의 조직 항원에 중점을두고 있습니다. CldU와 채널 사이의 토글 Cy2와 Cy5 채널 이두의 얼룩을 확인합니다. 로 과도한 이두와 CldU 공동 양성로 표시 마커 사이에 잠재적인 상호 반응을 찾습니다. 단 CldU이나 이두를 포함하는 조직을 찾아보십시오. CldU 또는 이두 긍정적인 핵 부족 상표 또는 얼룩이있는 기술적인 문제를 나타낼 수 있습니다. 이 경우에는 매우 replicative 조직 (예 : 림프 노드)를 찾습니다. </li><li> 이미지를 분석. DAPI 및 조직 항원을 포함하는 레이어를 표시합니다. 지배적인 손에 화이트 보드 마커와 비 지배적인 손으로 셀 카운터를 사용하여 건조 삭제 표시 (일명 화이트 보드 마커)과 대조 마르크 각 핵을 표시합니다. 관심 조직 내에서 DAPI 긍정적인 세포를 계산합니다. 전체 셀 개수를 기록합니다. 흔적을 제거하는 건조 지우개를 사용합니다. 표시 계층S 포함 DAPI, 조직 항원 및 CldU. 관심 조직 내에서 CldU 긍정적인 세포를 계산합니다. 기록 CldU 셀 카운트하지만 마르크를 삭제하지 않습니다. 변경 조직 항원, CldU과 이두를 포함하는 레이어를 시각화하는 표시됩니다. 카운트 CldU 이두 두 긍정적인 세포. 기록의 가치, 모든 흔적을 삭제하고, DAPI, 조직 항원과 이두를 포함하는 레이어를 표시합니다. 관심의 조직 내에서 이두 긍정적인 세포의 총 수를 계산합니다. 기록 이두 셀 개수. </li></ol> 6. 대표 결과 우리는 순차적으로 즉각적인 희생 뒤에 2 주 1 주일 후 이두에 대한 CldU와 6주 오래된 여성 생쥐를 표시. Pancreata는 CldU, 이두, 그리고 인슐린 (조직 항원)뿐만 아니라 DAPI를 감지할 수 스테인드했다. 아일 레츠는 균일하게 인슐린 물들일되었습니다. CldU 스테인드 핵은 이두 스테인드 핵 (그림 2)에서 뚜렷한되었습니다. 아일릿 이외의 많은 핵이 CldU 이두 공동 긍정적인 (그림 2, 오른쪽 아래, 흰색 화살표)되었습니다. 하나의 인슐린 양성 세포는 CldU 및 이두 (그림 2, 오른쪽 아래, 마젠타 화살표) 모두에 대한 핵 얼룩했다. 쥐. 마우스로 모든 실험은 필라델피아의 어린이 병원의 IACUC위원회의 지침에 따라 수행되었다. 여성 B6.129 F1 야생 형 생쥐는 필라델피아의 어린이 병원에서 실험 동물 시설에서 지내게 타코닉 (제르 뉴욕), 그리고 PMI 영양 국제 (Richmond. 인디애나)에서 공급 마우스 국회 5,015에서 구입한했다. 전략을 레이블. 이두 (이 계획에 빨간색으로 표시)와 CldU와 함께 첫 번째 세포 분열 이벤트 (이 계획에 녹색 표시)와 두 번째 세포 분열을 라벨로, CldU 및 이두 (녹색 / 적색) 모두 공동으로 표시된 전지 순차 세포 분열 결과 . 마우스 내에서 췌장 세포 회전율의 thymidine 라벨링 대표 발생합니다. 중앙에 langerhans의 아일릿와 마우스의 췌장 Immunofluorescent 이미지. 마우스는 즉각적인 희생하기 전에 식수 2 주 동안 일주 그리고 이두에 대한 CldU로 주입했다. 프로토콜에서 설명한대로 췌장 샘플 처리되었습니다. 층이와 40x 객관적인 이미지, 계산에 적합한 표시됩니다. 병합된 이미지 DAPI (흰색) CldU (녹색), 이두 (적색), 인슐린 (노란색)이 포함되어 있습니다. (상단, 왼쪽)과 인슐린 DAPI. (상단, 오른쪽) CldU과 인슐린. (하단, 왼쪽) 이두와 인슐린. (하단, 오른쪽) CldU, 이두, 그리고 인슐린. 스케일 바 : 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 라벨링 전략. 이두 (이 계획에 빨간색으로 표시)와 CldU와 함께 첫 번째 세포 분열 이벤트 (이 계획에 녹색 표시)와 두 번째 세포 분열을 라벨로, CldU 및 이두 (녹색 / 적색) 모두 공동으로 표시된 전지 순차 세포 분열 결과 . <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 마우스 이내 췌장 세포 회전율의 thymidine 라벨의 대표 발생합니다. 중앙에 langerhans의 아일릿와 마우스의 췌장 Immunofluorescent 이미지. 마우스는 즉각적인 희생하기 전에 식수 2 주 동안 일주 그리고 이두에 대한 CldU로 주입했다. 프로토콜에서 설명한대로 췌장 샘플 처리되었습니다. 층이와 40x 객관적인 이미지, 계산에 적합한 표시됩니다. 병합된 이미지 DAPI (흰색) CldU (녹색), 이두 (적색), 인슐린 (노란색)이 포함되어 있습니다. (상단, 왼쪽)과 인슐린 DAPI. (상단, 오른쪽) CldU과 인슐린. (하단, 왼쪽) 이두와 인슐린. (하단, 오른쪽) CldU, 이두, 그리고 인슐린. 스케일 바 : 100μm.

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ordered+architecture+of+murine+ear+epidermis+is+maintained+by+progenitor+cells+with+random+fate.">The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate.</a> Dev Cell. 18 (2), 317-317 (2010).</li></ol>

마우스로 모든 실험은 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 지침에 따라 필라델피아의 어린이 병원에서 동물 시설에서 수행되었다.

세포 회전율을 라벨에 thymidine 기반의 접근 방식에 대한 우리의 접근 방식은 생명 의학 연구에 많은 잠재적인 응용 프로그램을하고 있습니다. 지금까지 우리는 췌장에 집중해야하지만, 우리는 세포 피부의 매출, 뱃속, 간, 부신, 신장, testis, 난소, 갑상선, 림프절, 조혈 및 뇌 1 조사이 전략을 적용했습니다. 세포 회전율은 조직에서 조직 다양하기 때문에, 상표 전략은 이익의 기관에서 가장 뛰어난 정보를 얻을 정의해야합니다. 모리슨과 동료 일일 각각 조혈 2 라벨 위해 CldU과 이두를 사용합니다. 쿤과 동료 재생 myocardium 3 세포 분열을 감지하는 사일 각 CldU과 이두를 사용합니다. 반대로, 우리가 동물의 세 1,4-6과 같은 최소한의 세포 회전율과 췌장 아일 레츠 이내에 기저 세포 회전율, 조직을 라벨 총 9개월하는 CldU과 이두를 사용했습니다. 연구 조직의 항상성 내에서 세포 회전율을 정의하기위한 상표 전략의 가장 확실한 잠재적인 응용 프로그램입니다. 하지만 우리의 기술은 여러 가지 다른 가능성이 응용 프로그램을하고 있습니다. 예를 들어, 우리는 최근 증가 복제 초점 영역이 쉽게 CldU 또는 이두 5 증가 결합하여 식별할 수 조직 내에 종양 발생 변환을 식별하기 위해이 기술을 적용. 모리슨과 동료 일일 각각의 조혈 줄기 세포의 라벨 유지 행동 2 테스트하기위한 CldU과 이두를 사용합니다. 우리는 또한 대중 교통 - 확장의 세포가 조직 하나의 성장 또는 갱신에 기여하는지 확인하기 위해 순차 thymidine의 아날로그 라벨을 적용합니다. thymidine의 analogues이 응용 프로그램을 연속적인 행정 조직 항상성에 관련된 세포의 기원과 생존을 공부에 대한 새로운 접근 방식을 나타냅니다. Thymidine의 analogues은주의없이 사용할 수 없습니다. 합성 thymidine의 analogues은 나누어 세포 잠재 toxicities을 가지고, 그들의 사용은 이론적으로 성장하는 동물 세포 회전율을 손상 수 있습니다. Thymidine의 analogues는 암 환자를위한 에이전트를 radiosensitizing로 사용되고 있고, 세포 회전율을 느리게 수 있습니다. 따라서 우리는 조심스럽게 관심을 자신의 조직에 잠재 toxicities에 대한 조사를 위해 조사를 촉구합니다. 예를 들어, Trumpp와 동료들은 체계적 BrdU는 조혈 줄기 세포는 세포주기 7 입력할 수 있으리란 걸 발견. 예를 들어, 러터와 동료 높은 선량의 thymidine analogues은 췌장 8 개발에 독성이있는 것으로 보여집니다. 최근 KineMed에서 Hellerstein와 동료, 병원은 BrdU 행정부가 독점적인 중수 라벨 기술 9를 사용 16~25%하여 내부 아일릿 확산을 느리게 것으로 나타났습니다. Hellerstein 및 동료에 의해 사용되는 전체 아일릿 준비 총 아일릿 준비 정도로 50 %를 구성하는 수 많은 다른 내분비 및 비 내분비 세포 유형을 포함. 그러나, 우리는 BrdU의 장기간 주입은 ki67 표현을 사 의한 측정으로, 젊은 성인 마우스의 베타 세포 증식에 영향을 미치지 않습니다 찾습니다. 마찬가지로, CldU 및 이두의 장기적인 관리는 베타 세포 대량 확장 1 손상하지 않는 것. 또한, 베타 세포 증식 속도는 시간과 단 몇 시간 (속도가 상당 기간에 정규화)을 표시 아르 생쥐의 오랜 기간 동안 BrdU으로 표시 생쥐 사이에 같습니다. 함께, 이러한 결과는 생쥐 안전하게 thymidine의 analogues의 장기 낮은 선량 관리를 용인할 수있는 것이 좋습니다. 아직도, 우리는 췌장 베타 세포의 성장에 thymidine analogues하여 잠재적인 독성을 배제할 수 없습니다. 결과적으로, 우리는 thymidine의 analogues와 마우스를 라벨링 때 컨트롤을 수행하고, 그러니 잘 다른 수사를 촉구하기 위해 계속합니다. 순차 thymidine의 아날로그 라벨 우리의 기술은 함정과 기술 도전없이는되지 않습니다. 결과적으로, 컨트롤 슬라이드 특히 중요합니다. 우리는 1 다양한 조직으로 이루어져 제어 슬라이드를 생성) 만 CldU와 라벨이 붙지만 마우스,.. 2)에만 이두와 라벨이 붙지만 마우스,. 3) 순차적으로 CldU 그리고 이두와 라벨이 붙지만 마우스,. 4) 순차적으로 이두 그리고 CldU 처음에 역순으로 표시되었습니다 쥐,. 물만으로 표시 모의 아르 5) 쥐. CldU과 이두와 라벨 학습 때, 조사는 항상 관심의 조직에서 슬라이드의 모든 5 위의 세트와 함께 전체 프로토콜을 수행한다. CldU과 이두 사이에 약간의 교차 반응 모두의 thymidine analogues와 라벨에 불행하지만, 부득 이한 단점입니다. CldU과 이두 기술은 원래 종 (마우스 및 쥐)에 BrdU에 대한 파생되었다 antisera 사이에 동질성의 차이에 따라 달라집니다. 우리 프로토콜은 복잡하면서, 이러한 교차 반응을 최소화하도록 설계되었습니다. 따라서, 우리는 프로토콜의 단계 (들)을 빼먹는 고려 조사 중에주의를 촉구합니다. 특히, 우리는있다마우스 및 쥐 사이에 교차 반응 아르 보조 antisera 문제가 발생했습니다. 이것은 완전히 마우스와 쥐 사이에 상호 adsorbed 아르 잭슨 antisera의 사용으로 최소화하실 수 있습니다. 우리는 때때로 적절하게 thymidine 결합을 감지하기 위해 실패합니다. 이러한 경우에 그것은 시약 또는 단계가 작동되지 않은 결정하기 위해 긍정적인 제어 슬라이드를 사용하는 매우 중요합니다. 문제는 일반적으로 antisera, 드라이 슬라이드, 또는 불충 분한 핵 permeabilization의 나쁜 aliquots 예정이다. 우리는 성공적으로 이두와 태아를 개발 라벨에 실패했습니다. 따라서, 모든 조직은 이두로 투과 수 있습니다. 이중 thymidine의 아날로그 라벨에 대한 CldU와 이두에 대한 대안이 수평선에있다. 이두 (5 - ethinyl - 2 deoxyuridine) 구리 촉매를 클릭 화학 감지 10,11위한 기판 수 있습니다. 에듀 검출 방법의 DNA 가닥이 분리를 요구하고, 유동세포계측법의 12 분석하므로 매우 의무가 없습니다 않습니다. 이두는 BrdU 10과 반응을 교차 호환되지만되지 않습니다. 이두는 췌장 베타 세포 13 장 L 세포 14 표피 15 등 다양한 마우스 조직의 세포 회전율을 계량하는 데 사용되었습니다. 에듀 순간 (500mg 당 천달러 미국)에 매우 비싼입니다. 하지만, 에듀 감지 훨씬 더 민감한 BrdU 검출 10 개 것 같습니다. 그러므로, 그것은 대신 CldU 및 이두의 이두와 BrdU을 결합하기 위해 경제적으로 가능 수 있습니다. 이 방법은 또한 triply 에듀, CldU, 그리고 이두에 대한 표시 마우스에서 세포 분열의 세 가지 다른 라운드의 감지를 허용 있습니다. 요약, 순차 thymidine의 아날로그 라벨 우리의 기술은 세포 회전율을 검출하는 새로운 접근 방식입니다. 우리는 우리의 접근 방식이 더 정확하게 세포 분열을 계량 다른 과학자들을 수 있도록 희망하고 조직 항상성의 새로운 패러다임을 열 것으로 기대합니다.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210547891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210035701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>19943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>23-427-098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYLENES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>EM-XX0060-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A405P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS, 10X Powder Concentrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton &#x2013;X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP151-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>BDH3028-2.5LG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>347580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat mab anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>OBT0030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy2 donkey anti-rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>712-225-153</td>
<td>Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy5 donkey anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson immuno</td>
<td>715-175-151</td>
<td>See above</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Cover Slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C9056-1CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YFP Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49003 ET EYFP</td>
<td>Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy3 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49004 ET Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49006 ET Cy5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ORCA ER Microscope Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>C4742-95-12ER</td>
<td>Excellent detection of fluorophores</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue

세포 분열의 정확한 측정이 서서히 나누어 세포가 분석되면 점점 더 복잡해지는되어 실험 생물학의 근본적인 도전입니다. 세포 분열을 감지하기 위해 설립 방법은 세포 배양 등 carboxyfluorescein DI - aetate succinimidyl 에스테르 (CFSE) 같은 ki67 또는 PCNA와 같은 mitogenic 항원의 단백질 검출과 같은 중요한 염료의 희석하고, thymidine의 analogues 지속 현미경에 의해 직접적인 시각화를 포함합니다. Thymidine의 analogues는 tritiated thymidine, 브로모 - deoxyuridine (BrdU), 클로로 - deoxyuridine (CldU)와 iodo - deoxyuridine (이두)을위한 단백질 감지 및 ethinyl - deoxyuridine에 대한 화학 검출을위한 무선 감지를 포함한 다양한 방법에 의해 감지 수 있습니다 (이두). 우리는 성인 생쥐의 조직으로 다른 thymidine의 analogues의 연속 결합 (CldU과 이두)을 감지하는 전략을 파생합니다. 우리의 방법은 조사가 정확하게 세포 분열의 두 연속 라운드를 정할 수 있습니다. 최적화 immunostaining 프로토콜로 접근 시간이 연장 기간에 대한 마우스로 관리하는 안전한 식수를 통해 관리 매우 낮은 선량의 thymidine analogues를 검색할 수 있습니다. 따라서, 우리의 기술은 매우 긴 조직에서 세포 회전율을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 최적 immunofluoresent 얼룩 결과는 췌장, 피부, 뱃속, 간, 부신, testis, 난소, 갑상선, 림프절, 뇌를 포함한 여러 조직 유형에 형성될 수 있습니다. 우리는 또한 조직 내에 종양 발생 변환을 확인하려면이 기술을 적용했습니다. 우리는 더 이상 중계 - 확장의 세포 조직의 성장이나 갱신에 기여하는지 확인하기 위해이 기술을 적용했습니다. 이러한 의미에서, thymidine의 analogues의 연속 행정 조직 항상성에 관련된 세포의 기원과 생존을 공부에 대한 새로운 접근 방식을 나타냅니다.

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Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

우리는 세포 분열의 두 연속 라운드를 정할 성인 생쥐의 조직에 thymidine의 analogues의 연속 결합 (CldU과 이두)을 감지하는 전략을 파생합니다. 이 전략은 세포 수명이 긴 조직의 매상, 종양 발생 변형, 또는 교통 - 확장 세포를 감지하는 데 유용합니다.

기본 조직의 두 Thymidine의 Analogues의 Immunofluorescent 검색 (CldU 및 이두)

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

immunofluorescent-detection-two-thymidine-analogues-cldu-idu-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

30.4K 조회수.  University of Pennsylvania-School of Medicine. 우리는 세포 분열의 두 연속 라운드를 정할 성인 생쥐의 조직에 thymidine의 analogues의 연속 결합 (CldU과 이두)을 감지하는 전략을 파생합니다. 이 전략은 세포 수명이 긴 조직의 매상, 종양 발생 변형, 또는 교통 - 확장 세포를 감지하는 데 유용합니다.

비디오: Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

연구

생물학

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

근육 줄기 세포에서 Autophagy의 원위치 Immunofluorescent 얼룩

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

-Omics 분석 및 1 차 적인 세포 배양을 위한 박쥐의 조직 수집

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

해삼 장 세포의 1 차적인 배양에 있는 세포자멸 유도 그리고 탐지

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

면역 형광에 의한 1 차 적인 섬모의 간단한 검출

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

인간 뇌 조직에서 단백질의 다중 반응 모니터링 기반 검출을 이용한 정량적 프로테오믹스 워크플로우

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...