LRC - V. 박사 Adriel D. 존슨, 그의 최우선 항상 학생들의 교육을했습니다 훌륭한 교수의 기억이 논문을 바치고하고자합니다. 우리는 Adriel 당신이 그리워요. 우리는이 연구에서 설명하는 실험을 수행하는 그녀의 도움을 재클린 모레노에게 감사하고 있습니다. 이 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation), MCB - 0615390에서 CY에 제공하는 보조금에 의해 지원하고, LRC - V로 제공 시작 기금에 의해.했습니다 헌츠빌에 위치한 앨라배마 대학에서.

1. 휴대폰 무료 추출 준비합니다. <ol><li> 펠렛 박테리아 건조 대장균의 두 그램 중순 로그 위상 문화가 버퍼의 절반 리터와 두번 씻어 아르에서 얻은 포함 10 MM 트리스 - 아세테이트, 산도 8.0, 14 MM 마그네슘 아세테이트, 60 MM 칼륨 아세테이트, 50 μg 4 5 분 5,000 X g에서 원심 분리하여 / ML phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) ° C. 세척 후, 세균성 펠렛은 버퍼 A. 40 ML에 resuspended입니다 </li><li> 박테리아 세포는 6,000 PSI 압력을 적용, 프랑스 프레스를 사용하여 방해하고 있습니다. 이 압력은 1 인치 피스톤을 사용하여 600 단위에 해당합니다. 중단 정지 깨끗한 유리관 (50 ML)에서 수집됩니다. </li><li> 중단 정지는 1 ㎜ dithiotreitol (DTT)의 치료 30 분 30,000 XG에 centrifuged입니다. 원심 분리 절차는 결과 뜨는을 사용하여 반복됩니다. 최종 뜨는은 microtubes로 (1 ML) 적절합니다. 마지막으로, aliquots는 드라이 아이스 - 에탄올 혼합물이나 액체 질소를 이용하여 냉동 있으며, -60에 저장됩니다 ° C 또는 -80 ° C. </li></ol> 2. RF2의 열화 휴대폰 무료 추출물 준비. <ol><li> 단백질 렉틴 세파 로스 4B 슬러리 비즈 4.5 ML 한 시간, 상온에서 회전 바퀴를 사용하여 안티 RF2 방지 혈청 5 ML과 혼합됩니다. 혼합물은 항혈청에서 비즈를 분리 XG 2500에서 centrifuged입니다. 폐기시 뜨는은, 안티 - RF2 항체 (안티 RF2 구슬)이있는이 구슬은 나중에 35 밀리미터를 포함하는 버퍼 B 1 ML에 resuspension로 씻어 아르 트리스 - 아세테이트 산도 7.8, 10 MM 마그네슘 아세테이트, 30 MM의 암모늄 아세테이트 60 MM 칼륨 글루 탐 산염 및 5 μg / 류펩틴의 proteinase 억제제의 ML. 안티 RF2 구슬을 같은 조건 위 표시를 사용하여 원심 분리하여 버퍼 B에서 분리됩니다. 세척 절차는 두 번 반복됩니다. </li><li> 셀 - 무료 추출물 중 하나 ML은 4, 회전 바퀴를 사용하여 방지 RF2 구슬 150 μL와 혼합됩니다 ° C, 두 시간. 혼합물은 비즈의 세포없이 추출 분리 10,000 XG에 centrifuged입니다. 뜨는은 안티 RF2 구슬의 또 다른 150 μL로 다시 제거 처리됩니다. 이 절차는 결과 셀 무료 추출 솔루션을 한 번 더 반복됩니다. 마지막 셀 - 무료 추출 솔루션은 microtubes로 (100 μL) 적절합니다. aliquots는 드라이 아이스 - 에탄올 혼합물이나 액체 질소를 이용하여 냉동 있으며, -60에 저장됩니다 ° C 또는 -80 ° C. </li></ol> 3. DNA 템플릿의 준비. <ol><li> 그림 1 각 dNTP의 0.2 micromoles 및 50 U에 표시된 oligodeoxynucleotides 각 0.4 nanomoles와 시퀀스가​​ 번역을 포함하는 플라스미드 템플릿 (그림 1)의 혼합 600 femtomoles에 의해 1 ML PCR 반응을 준비 DNA 형성 촉매 - Stratagene 회사가 제공하는 버퍼에의 DNA 중합 효소는 다음과 조건에서 증폭 반응을 수행 : 94 ° 2 분에 대한 C, (94 ° 30 S에 대한 C, 55 ° 30 S에 대한 C, 72 ° 1 분에 대한 C, 30 주기) 72 ° C 12 분. </li><li> 10분의 1 3 M의 아세트산 나트륨의 볼륨, 산도 5.2 얼음처럼 차가운 에탄올 2 볼륨을 추가하여 DNA를 precipitating하여 PCR - 제품을 정화. 한 번 더 석출 절차를 반복합니다. 디에틸 - pyrocarbonate (DEPC) 처리 - 물 100 μL의 DNA를 Resuspend. 일반적으로이 절차는 600 BP의 DNA 제품의 100 μg을 산출. </li><li> 아가로 오스의 젤에 전기 영동하여 PCR 제품의 무결성을 확인합니다. </li></ol> 4. 비오틴 라벨 mRNA의 준비. <ol><li> ATP, CTP, GTP, UTP의 0.3 micromoles, 비오틴 - 16 - UTP 50 nanomoles, 10 μL의 0.5 micromoles와 PCR - 생성된 DNA 조각의 5 μg을 혼합하여 DEPC 처리된 물에 시험 관내 전사 반응에 100 μL 준비 Promega (주)가 제공하는 버퍼에 T7 효소 믹스 37에서 반응 혼합물을 품어 ° C를 3 시간 동안. 얻은 mRNA의 양을 계량하려면 DNA 템플릿은 RNase 무료 DNase를 추가하여 제거하여야한다. 37 반응 ° C 10 분 품어. </li><li> 3 M의 아세트산 나트륨, 산도 5.2 차가운 에탄올 2 볼륨 10분의 1 볼륨을 추가하여 RNA를 precipitating하여 mRNA 제품을 정화. 한 번 더 석출 절차를 반복합니다. DEPC 처리 - 물 100 μL의 mRNA를 Resuspend. 보통 600 NT 비오틴 1-2 MG 사이에이 절차의 수확량은 mRNA 제품을 분류. </li><li> 아가로 오스 젤에 전기 영동하여 비오틴 표시 mRNA 제품의 무결성을 확인합니다. </li></ol> 5. Peptidyl - tRNA를 포함 번역 리보솜의 분리. <ol><li> 열아홉 아미노산 각각의 지방산 - 모든 아미노산을 제외한 방사성 아미노산으로 대체됩니다 75 nanomoles와 비오틴 - 레이블 mRNA의 10-15 μg을 혼합하여 DEPC 처리된 물에 체외 번역 반응 혼합물에 500 μL 준비 50 방사성 아미노산 (37MBq)의 μCi, 그리고 20-5<html> 40 MM 트리스 - 아세테이트, 산도 8.0, 10 MM 마그네슘 아세테이트, 175 MM 칼륨 아세테이트, 10 MM의 암모늄 아세테이트, 2 MM DTT, 2 MM ATP, 0.5를 포함하는 버퍼 반응 혼합물에 RF2 - 고갈 셀 - 무료 추출물, 0 μL MM GTP, 30 MM의 phosphoenolpyruvate (응원), 0.3 U / ML pyruvate의 키나제 (PK), 폴리에틸렌 글리콜 3.5 % 8000 1 ㎜의 spermidine, 20 μg / ML folinic 산성, 250 μg / E.에서 ML tRNA 대장균. 37 반응 혼합물을 품어 ° C를 10 분. 반응 구성 요소 이외의 순서는 매우 중요합니다. 셀 - 무료 추출물은 아미노산과 변이의 활성화를 허용하도록 실온에서 5 분 incubated 최종 혼합물을 포함하는 버퍼 솔루션 첫번째 혼합해야합니다. 나중에 비오틴 - 표시 mRNAs이 추가됩니다. 화학 수정 절차를 사용하여 구조 분석을 위해, 방사성 아미노산의 추가가 필요하지 않습니다. </li><li> 35 MM 트리스 - 아세테이트, 산도 8.0, 10 MM 마그네슘 아세테이트, 175 MM 칼륨 아세테이트, 10 MM의 암모늄 아세테이트와 1 ㎜의 DTT를 포함하는 버퍼 C에서 정지 streptavidin의 상자 성체의 비즈 (SMB) 3 ML - 번역 반응 혼합물에 추가합니다. 10 분 상온에서 새로운 현탁액을 품어. </li><li> 자기 분리 스탠드를 사용하여 자기장 (MF)를 적용하여 혼합물에서 SMB를 구분한다. </li><li> 버퍼 C에서 SMB를 Resuspend와 MF를 사용하여 다시 비즈를 구분한다. 두번 세척 절차를 반복합니다. 버퍼 C 500 μL에 비즈를 Resuspend, 얼음에 정지를 저장하고, 즉시 다음 절차를 수행합니다. </li></ol> 6. Peptidyl - tRNA를 포함하는 절연 변이 분석. peptidyl - tRNA에 대한 <ol><li> 50 MM 트리스 - HCL, pH를 6.8, 2.5 % (V / V) 글리세롤, 4 %의 나트륨 dodecyl 황산염, 2 MM DTT와 0.2 MG를 포함하는 로딩 버퍼 10 μL와 SMB 10 μL를 (버퍼 C에서 정지) 믹스 / ML bromophenol 파란색. 10% 트리스 - tricine의 polyacrylamide의 젤의 샘플을 실행하여 구슬에 연결된 구성 요소를 해결합니다. </li><li> 진공 젤 - 건조기를 사용하여 젤을 건조. </li><li> X - 선 필름에 건조 겔을 노출하여 peptidyl - tRNA의 무결성과 정화를 확인합니다. </li></ol> ribosomal RNA에 대한 <ol start="4"><li> DEPC - 처리된 물을 준비이 당연 ethylenediaminetetraacetate (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 솔루션을 190 μL, 그리고 비드 정지 10 μL로 물을 equilibrated 페놀 200 μL를 추가합니다. 활발한 vortexing하여 현탁액을 혼합하여 실온에서 3 분 10,000 XG에서 원심 분리하여 유기적인 단계에서 무기 단계를 구분한다. 새로운 microtube 최고의 물 레이어를 수집합니다. </li><li> 3 M의 아세트산 나트륨의 10분의 1 볼륨, 산도 5.2, 20 MG / 글리코겐 솔루션, 그리고 얼음처럼 차가운 에탄올 2 볼륨 ML 1 μL를 추가하여 물 계층에서 RNA를 침전. DEPC - 처리된 물 10 μL의 RNA를 Resuspend. </li><li> 아가로 오스의 젤에 전기 영동하여 ribosomal RNAS의 무결성을 확인합니다. 보통 비즈 정지 50 μL는 ribosomal RNA 1μg의 산출. </li></ol> 7. 대표 결과 : 그림 2에 설명된 절차를 사용하여 격리 번역 리보솜의 품질과 기능을 평가 분석의 일련의 결과를 보여줍니다. polyacrylamide의 젤에서 해결된 독특한 밴드의 관찰은 SMB (그림 2A)에 연결된 비오틴 - 표시 mRNAs에 바운드 polypeptides의 존재를 나타냅니다. 이 프로 시저를 사용하여 ribosomal RNAS의 정화는 물론, 이러한 비오틴 - 표시 mRNAs에 바운드 (그림 2B) 변이의 존재를 설정합니다. puromycin의 추가, ribosome의 peptidyl - transferase 활동을 유도 항생제, 초기 peptidyl - tRNAs 1 절단을 초래합니다. 이것은 (그림 2C) polyacrylamide의 젤에 분리된 polypeptide의 마이 그 레이션 패턴의 변화로 관찰됩니다. 함께, 이러한 데이터는 SMB에 연결된 비오틴 - 표시 mRNAs은 peptidyl - tRNAs와 기능 변이를 포함하는 것으로 나타났습니다. 특정 peptidyl - tRNAs를 포함하는 번역 리보솜의 고립은 ribosome 기능 (그림 3A)에 peptidyl - tRNAs, 항생제 및 기타 분자의 효과 연구를 허용하고, ribosome 구조 (그림 3B). 예제에서 여기 항생제 sparsomycin을 제시하고 아미노산 트립토판 (TRP)는 격리 리보솜 (그림 3A)에 RF2하여 초기 tnaC - tRNA peptidyl - tRNA 유도의 가수 분해 절단을 억제. ribosome과 sparsomycin 또는 TRP의 상호 작용은 또한 번역 ribosome (그림 3B)의 23S rRNA를 구성 일부 세포핵의 구조적 변화를 유도. 요약에서 프로 시저를 사용하여 얻은 생물 학적 물질은 다양한 분자 요소와의 상호 작용에 따라 ribosome 기능의 억제에 관련된 구조적 연락처 추가 지식을 얻기에 유용하다 여기에서 설명한. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. peptidyl - tRNAs를 포함하는 번역 리보솜을 생산하고 정화하는 데 사용되는 절차. DNA는 CA를 파편. 그림에 표시된 tnaC 유전자와 그 인접 지역을 포함한 길이 650 BP는, 비오틴을 [(바이오) 지금 뭐] mRNA가 포함된 mRNAs 준비에 템플릿으로 사용됩니다. 이러한 DNA 조각은 그림의 맨 위에 표시된 oligodeoxynucleotides를 사용하여 PCR 절차에 의해 생산됩니다. 밑줄 문자는 뉴클레오 티드 뇌관으로 인코딩된 T7 프로 모터의 위치를​​ 표시합니다. 볼드 문자 tnaC mRNA 시퀀스의 번역에 사용되는 샤인 - 달가노 순서를 나타냅니다. 의 DNA 조각의 T7 프로 모터는 (화살표) tnaC 시퀀스와 비 코딩 시퀀스의 하류를 녹음하는 데 사용됩니다 T7 RNA 효소에 의해 인정되고 있습니다. RNA 효소는 rpoBC 터미네이터 시퀀스 (rpoBC &quot;T&quot;) 후, DNA 조각의 3&#39; - 끝에 도달하면 전사가 종료됩니다. rpoBC 터미네이터의 줄기 루프 구조가 체외 번역 반응에 사용되는 셀없는 추출물의 3&#39; - 5 &#39;exoribonuclease 활동 현재의 mRNA를 보호합니다. 격리 [(바이오) 지금 뭐] mRNAs는 체외 번역 assays 사용하여, 지연, 번역 변이를 생성하는 데 사용됩니다. 의 tnaC 순서 [(바이오) 지금 뭐] mRNA는 반응 혼합물에서 릴리스 팩터의 부재 (RF2)에 의한 마지막 아미노산이 통합되었을 때 노점 ribosome에 의해 번역합니다. ribosome - [(바이오) 지금 뭐] mRNA의 단지가 mRNA에 통합 비오틴 - 라벨 세포핵을 바인딩 streptavidin - 자석 - 구슬 (SMB)를 사용하여 총 반응 혼합물로부터 격리됩니다. SMBs는 바운드 ribosome - [(바이오) 지금 뭐] mRNA의 단지가 자기장 (MF)를 사용하여 총 반응 혼합물에서 추출됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 절연 단지의 구조 및 기능 분석합니다. A) 시험 관내의 변환 반응이 함께 수행했다 [(바이오) 지금 뭐] tnaC 유전자의 시작 코돈이 정지 코돈으로 대체어진 mRNAs. 최종 제품으로 그림 1에 표시됩니다, streptavidin 비즈를 사용하여 격리되었습니다. 반응 제품 및 절연 분자는 다음의 polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 분석되었다. tnaC - tRNA와 tnaC 펩타이드 밴드가 표시됩니다. B) 총 RNA는 페놀 추출 절차를 사용하여 지연 단지에서 고립되었다. 각각의 분리된 RNA는 아가로 오스 젤에 전기 영동에 의해 해결되었습니다. Ribosomal RNAS (rRNAs)가 표시됩니다. C) tnaC - tRNAs을 포함한 절연 단지가와 (+)없이 incubated했다 (-) 10 분 상온에서 0.02 MM puromycin (Puro). tnaC의 펩타이드는 [35S] - 메티오닌 (A) 또는 [3H] - 프롤린 (B)를 사용하여 번역하는 동안 표시되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 항생제 sparsomycin 또는 아미노산 트립토판에 바인딩된 tnaC - tRNA를 포함하는 리보솜의 구조 및 기능 분석합니다. A) tnaC - tRNAs을 포함한 절연 단지가와 (+) 또는 (없이 incubated 있었다 -) sparsomycin (스파) 또는 5 분 실온에서 트립토판 (TRP). 나중에 혼합은 RF2와 혼합하여 37 ° C 20 분 incubated되었습니다. B) 23S rRNA의 methylation의 변화 분석 ribosome 내에서 바인딩 분자에 의해 유도. 절연 단지가와 (+)없이 사전 incubated했다 (-) 37시 5 분 2 MM TRP 또는 스파 ° C. 그런 다음, 알킬화 대리인, 디메틸 황산은 추가되고 혼합물은 추가 20 분 실온에서 incubated했다. 총 RNA가 추출되었고 뇌관 확장 assays은 [32P] 수정된 뉴클레오 티드에서 하류 100 세포핵을 간격 아르 23S rRNA의 세포핵을 보완 - 표시 oligodeoxynucleotide 함께 수행했다. 확장 assays의 최종 제품은 polyacrylamide의 젤에 전기 영동에 의해 해결되었다. TRP이나 스파의 존재에 의해 영향을 23S rRNA의 세포핵이 표시됩니다.

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F. l. u. o. r. e. s. c. e. n. c. e. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=isotope-+or+biotin-labeling+of+the+5+'-end+of+single-stranded+DNA/RNA+using+T4+RNA+ligase.">isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).</li><li>Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-ligation:+an+efficient+method+for+ligating+single-stranded+DNAs+and+RNAs+with+T4+RNA+ligase.">Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase.</a> Mol Divers. 4, 187-190 (1998).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 보고서에 설명되어있는이 격리 절차는 매우 재현할 수 있습니다. 불행하게도, 같은 번역된 시퀀스에서 생산되는 짧은 peptidyl - tRNAs의 존재는 편리하게 피할 수없는, 그러한 peptidyl - tRNAs는 총 절연 재료 (그림 2C)의 15~20%에 해당 있습니다. 비오틴 - 분류 mRNA의 높은 농도를 사용되었거나 사용되는 셀 무료 추출이 된 경우 또는 여러 번 다시 사용되었을 때 이러한 오염 물질은 농도가 증가 수 있습니다. 따라서 체외 번역 반응의 구성 요소의 품질과 농도를 제어하는 것은 매우 중요하다. 또는, 상업 높은 효율 셀 무료 추출이 동일한 목적 (퓨어 시스템) 18 사용할 수 있습니다 재구성. 이 방법을 사용, 비오틴 - 16 - 지금 뭐은 무작위로 대상 mRNA의 길이를 따라 통합됩니다. 유리딘의 책자를 포함한 일부 ORFs이 자신의 번역에 영향을 미치는 그들의 시퀀스에서 염기 수정 포함 할 수도있는 가능성이있다. biotin-16-UTP/UTP의 가변 상대적 농도가 가장 효율적인 번역을 얻기 위해서는 mRNA의 합성하는 동안 테스트해야합니다. 비오틴 라벨의 대체 방법은 mRNAs의 5&#39; 엔드, 가장 안정적인 종료를 대상으로, 사용할 수 있습니다. (I) 비오틴은 3&#39; - NH2ATP (3&#39; - 아미노, 3&#39; - deoxyadenosine 삼인산) 및 T4 RNA ligase 19을 사용하여 mRNA의 5&#39; 엔드에 첨부하실 수 있습니다. (2) 5&#39; 엔드 비오틴 - 표시 oligonucleotide는뿐만 아니라 20 T4 RNA ligase의를 사용하여 mRNA의 5&#39; 엔드에 첨부하실 수 있습니다. (3) mRNA의 5&#39; - 끝에있는 상호 보완적인 순서에 해당하는 3&#39; 엔드 비오틴 - 표시 oligodeoxynucleotides도 번역 단지를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 비오틴 표시 oligodeoxynucleotides는 격리하기 전에 SMB에 연결된 수 있습니다. 나중에 SMB들은 상호 보완적인 mRNA 시퀀스와 상호 작용을 허용하도록 번역 반응 혼합물과 혼합 수 비오틴 - 표시 oligodeoxynucleotides에 첨부. 분리 후, 하이브리드 RNA - DNA 영역 -과 지역 비오틴 - 표시 oligodeoxynucleotide와 mRNA 순서 사이 hybridizing - RNAse H를 사용하여 저하 될 수 streptavidin 비즈에서 지연 단지 분리. 이 대체 방법은 단지 더 높은 해상도의 방법을 사용 향후 구조적 분석에 사용된 수 있도록 수 있습니다.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>252859</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium glutamate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>09688</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A sepharose 4B slurry beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L9783</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taq-DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>201223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 Maxiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>P1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin-16-UTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1388908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylenglycol 8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>81268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Folinic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>47612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>85558</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tRNA from E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5816</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>LAA21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>magnetic separation stands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5342</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses

최근 구조적 및 생화 학적 연구는 항생제에 의해 단백질 합성을 억제하는 동안과 초기 polypeptide 합성하는 동안 ribosome에서 발생하는 분자 이벤트의 많은 자세한 있습니다. 이러한 항생제, 그리고 대부분 peptidyl - tRNAs의 형태로 규제 초기 polypeptides의 일부는, 펩티드 결합 형성 또는 번역 종료 1-7 중 하나를 억제. 이러한 억제 이벤트는 ribosome의 움직임을 막을 수 현상 &quot;translational 체포&quot;를 칭했다. 항생제 또는 초기 polypeptide에 의해 유도 번역 체포 등 세포 성장, 항생제 저항, 단백질 translocation과 세포 신진 대사를 8-13와 같은 다양한 세포 기능에 관련된 유전자의 표현을 규제하기 위해 표시되었습니다. 우리가 모든 생물의 번역에 ribosome의 완전한 역할을 이해할 수있다면 항생제와 규제 초기 polypeptides가 ribosome 기능을 변경하는 방법에 대한 지식이 필수적입니다. 여기, 우리는 독점적으로, 정화 분석, 이러한 변이는 특정 mRNA를 번역하고 특정 peptidyl - tRNA 14 포함하는 데 사용할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 이 절차는 비오틴 - 표시 mRNA에 리보솜의 번역 바운드 선택적 분리에 따라 달라집니다. 이러한 translational 단지는 streptavidin 상자 성체의 비즈 (SMB)과 자기장 (MF)를 사용하여 같은 혼합물의 다른 변이에서 구분됩니다. 비오틴 - 표시 mRNAs는 T7 transcriptional 발기인을 포함 템플릿 PCR 생성된 DNA 조각으로 사용하는 실행에서 전사 assays에 의해 합성됩니다. T7 RNA 효소는 비오틴 - UTP에서 비오틴 - 16 - 지금 뭐를 통합, 우리의 조건 하에서 약 10 비오틴 - 16 - 지금 뭐 분자는 25 % 지금 뭐 내용과 600 NT의 mRNA에 통합됩니다. 이러한 비오틴 - 표시 mRNAs은 다음 고립, 그리고 릴리스 계수 2 (RF2)로 수행 체외 번역 assays에 사용됩니다 - 고갈 야생 입력하거나 돌연변이 변이를 포함하는 대장균의 변종에서 얻은 세포없이 추출합니다. 비오틴 - 표시 mRNA 시퀀스를 번역 변이로 인해 정상적으로 종료 번역을 수행 RF2 단백질의 부재로, 정지 코돈 지역에서 지연됩니다. 새로 합성 peptidyl - tRNA를 포함하는 지연 변이는 고립과 SMB 및 MF를 사용하여 번역 반응에서 제거됩니다. 이 구슬은 비오틴 함유 메시지를 바인딩합니다. 절연, translational 단지는 야생 입력하거나 돌연변이 ribosomal 구성 요소 또는 peptidyl - tRNA 시퀀스뿐만 아니라, 항생제 또는 다른 분자 요인 1,14-16와 ribosome 상호 작용을 결정의 구조와 기능 기능을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 격리 ribosome 단지의 기능을 확인하려면, peptidyl - transferase assays은 항생제 puromycin 1의 면전에서 수행할 수 있습니다. translational 단지의 구조적 변화를 연구하기 위해, 잘 설립 절차는 특정 아미노산 14 및 / 또는 II) 알킬화 보호 assays 1,14,17 일) 등 전 같은 crosslinking을 사용할 수 있습니다.

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Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

isolation-translating-ribosomes-containing-peptidyl-trnas-for

Research

JoVE Journal

Biology

19.7K 조회수.  University of Alabama Huntsville. 어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

비디오: Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

연구

생물학

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

높은 활성 효모 변이의 색층 정화

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.