The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. 플라이 라인 세대 <ol><li> 두 개의 서로 다른 구조를 생성합니다. 첫 번째 구조에서, RpL10A의 cDNA (리보솜 단백질 서브 유닛 L10A)는 pUASP-PL-GFP - Nter 플라스미드에 GFP의 다운 스트림 복제됩니다 (32에서 수정 된 버전). 생식선 촉진제의 사용은 형질 전환 라인의 더 다가 사용을 허용한다. 참고 : pPTGAL4 플라스미드를 사용 GAL4 (TF)의 상류 능력있는 유전자의 조직 특이 적 발현을 구동 조절 서열을 복제하여 두 번째 구조를 얻습니다. </li><li> 1118 파리 승에 별도로 플라스미드를 주입하고 33 (표준 절차에 따라) P-요소의 삽입에 의해 파리의 게놈에 구조를 삽입합니다. </li><li> 순서대로 선택 형질 전환은 두 개의 서로 다른 염색체에 구조 플라이 라인을 복구 할 수 있습니다. 마지막 트랩 라인은 한 두 번 형질 전환 안정적인 라인을 얻기 위해이 두 라인 (유전 십자가)를 결합하여 생성됩니다. F0 : W-; CYO, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6BX W-; CYO / SCU; 슬러 GAL4 / TM6B. F1 : W-; CYO, UAS EGFP :: RpL10A; 능력있는 GAL4 / TM6B. 대규모이 줄을 증폭하고 원하는 스테이지 배아를 수집합니다. </li></ol> 2. 배아 컬렉션 <ol><li> 케이지 당 젊은 파리의 약 40 g의 8 큰 원통형 인구 케이지를 준비 (180,000 파리 / 케이지 정도). </li><li> 파리가 난관에서 개발 배아를 취소 할 수 있도록 소위 사전 낳는다 진행합니다. 이를 위해, 응고 한천 포도 주스의 혼합물을 포함하는 두 11cm 직경 페트리 접시에 1 시간 동안 파리를 놓고 갓 만든 효모 페이스트 표면의 ⅓을 커버합니다. 포도의 3 교환 후 주스 판은 유사한 갓 만든 접시에 실제 배아를 수집합니다. 참고 : 배양 시간은 연구 개발 시간 창에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 케이지에서 플레이트를 제거하고 되어온 (예, 알을 낳는 3 시간 + 10 시간 정확한 발달 단계를 얻기 위해 필요한 시간 동안 동일 온도에서이를두고하는 ional 배양은 10 ~ 13 시간 계란 부설 (AEL)) 후 단계에서 배아를 제공합니다. 브러시를 사용하여 물 50 ㎖와 함께 접시 콘텐츠 (배아, 효모 붙여 넣기, 죽은 파리를) 재현 탁. </li><li> 죽은 파리에서 배아와 나머지 신체 부위를 분리하고 작은 직경의 체에 보유 배아를 수집 한 후 탈 이온수에 간단히 씻어 체 (700 μm의, 355 μm의 112 μm의)의 시리즈를 통해 이동합니다. 그것 자체를 방해 할 수있는 컬렉션 당 18 개 이상의 플레이트를 사용하지 마십시오. </li><li> 탈 이온수에서 4.5 % 표백제에 Dechorionate 배아 2 분 동안 30 ~ 60 초 동안 탈 이온수로 철저히 씻어. 교반하면서 실온에서 5 ~ 10 분 동안, PBS 0.01 % 트윈 20, 100 μg의 / ㎖ 사이클로 헥시 미드의 배아를 품어. </li><li> 셀룰로오스 흡수 시트에 건조 배아 및 마이크로 원심 튜브로 전송. 튜브를 달아 액체 질소에 침지하여 배아를 플래시 동결. 이 단계에서 건조 된 배아는 -80 ° C에서 수개월 동안 저장 될 수있다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. GFP 항체에 결합 자석 구슬의 준비 <ol><li> 철저하게 부드러운 교반에 의해 원래의 병에 단백질 G에게 자기 구슬을 재현 탁. </li><li> 전송 (90)의 RNase없는 튜브에 구슬의 μL 및 자석 (30 ~ 60 초)에 그들을 수집합니다. 비드의 90 μL 60-80 ㎎ / ㎖의 단백질을 함유하는 1 ml의 용 해물로 면역 침전 (IP)을 수행 할 필요가있다. 비드 포화를 방지하기 위해 비를 존중한다. 단백질의 양에 따라 여러 개의 튜브를 사용합니다. </li><li> 자석에 씻어 1 × PBS 0.01 % 트윈 20 (500 μL)와 구슬과 수집 비즈 상층 액을 버린다합니다. 구슬에 PBS 0.01 % 트윈 20의 350 μL에 GFP 항체의 30 μg의를 추가하고 실온에서 30 분 동안 혼합 끝 이상 느린 끝으로 품어. </li><li> 자석 (30 ~ 60 초)에 구슬을 수집 상층 액을 버리고 polysome 추출 버퍼 500 μL에 씻어 (헤 페스 10 밀리미터, KCl을 150 밀리미터,의 MgCl 2 5 밀리미터, DTT 0.5 mm의 트리톤 1 %, 사이클로 헥시 미드 100 ㎍ / ㎖의 홍보otease 1 × 억제제의 RNase 억제제 100 U). </li><li> 자석 구슬을 수집하고 버퍼를 차단의 500 μL 추가 (BSA 0.1 μg의 / μL, 효모 tRNA는 0.1 μg의 / μL를 polysom​​e 추출 버퍼에서 0.1 μg의 / μL를 글리코겐). </li><li> 실온에서 30 분 동안 품어 신선한 차단 버퍼에 한 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 다음 구슬을 회상하고 immunopurification 단계 (제 6 조)에 즉시 진행, 자석 구슬을 수집하고 polysom​​e 추출 버퍼 500 μL에 헹군다. </li></ol> 4. 해​​물 준비 <ol><li> 시작하기 전에, 다 방향 빠른 속도 비즈 분쇄기에 프로그램을 설정 : 2 × 10 초 RPM 5000에서, 15 초 일시 정지를. 15 ㎖의 튜브에 전사 건조 배아 (1.5 g)을 polysom​​e 추출 완충액을 함유하는 얼음에 예냉, 즉시 균질화. polysom​​e 추출 완충액 4 mL에 1.5 g의 배아 균질화. </li><li> 이 확산 균질화 배아는 2 mL의 튜브를 미리 냉각 및 엠브리 갈기균질 프로그램을 실행하여 OS. 얼음에 신선한 미리 냉각의 microcentrifuge 튜브에 해물을 전송하고 2,000g에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하여 postnuclear 상층 액을 준비합니다. </li><li> 얼음에 신선한 미리 냉각 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송 상층 액 (최종 농도 = 0.1 %)로 10 % Nonidet P-40의 1/100 샘플 볼륨을 추가하고 튜브를 반전 가볍게 섞는다. </li><li> 펄스 원심 minifuge의 샘플은 튜브의 바닥에서 액체를 수집하는 300 mM의 1,2- Diheptanoyl-SN 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DHPC) (최종 농도의 1/9 샘플 량 = 30 mm로 추가 )), 튜브를 반전시켜 부드럽게 혼합, 배양하는 동안 여러 번 반전 (5 분 동안 혼합 얼음 혼합물을 품어. </li><li> 20,000g에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심 분리 후 미토콘드리아 상층 액을 준비합니다. 브래드 포드 (Bradford) 방법에 의해 단백질 농도를 측정한다 : 파쇄물의 농도가 60 ~ 80 ㎎ / ㎖ 사이 여야한다. 티신선한 새로운 미리 냉각 microcentrifuge 관에 뜨는을 AKE 및 예비 흡수 단계 (5 장)에 바로 진행합니다. </li></ol> 5. 사전 흡수 <ol><li> 철저하게 부드러운 교반 자석 구슬을 재현 탁하고 실온에서 microcentrifuge 관에 (비즈 / 1 ml의 배아 해물 30 μl를) 구슬의 30 μl를 전송합니다. </li><li> 뜨는 오프, 자석에 피펫을 구슬을 수집하고 polysom​​e 추출 버퍼 (500 μL)에 구슬을 재현 탁. 자석에 구슬을 수집 배아 해물을 추가하고, 회 전자에 4 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. <ol><li> 구슬을 제거하고 immunopurification 단계 얼음에 뜨는을 유지. immunopurification 전에, 예를 들어 RT-qPCR에 의해 수집 된 후 immunopurification RNA 샘플과 글로벌 RNA 샘플을 비교하는 상등액 100 ㎕ (입력)을 유지한다. </li></ol></li></ol> 6. Immunopurification <ol><li> 의 (60 ~ 80 ㎎ / ㎖ 단백질에 해당) 1 ML을 추가GFP 항체에 결합 차단 된 비드의 90 μl를 함유 된 RNase가없는 튜브로 파쇄물을 미리 흡수. 튜브 회전에서 부드러운 말을 통해 엔드 혼합 2 시간 동안 4 ° C에서 샘플을 품어. 또한, 4 ° C에서 배양 O / N을 수행합니다. </li><li> 배양 후, 자석 구슬을 수집합니다. 0.5 mm의 사이클로 헥시 미드 100 μg의 / ㎖,의 RNase 억제제 (100) U 세척 버퍼 500 μL (헤 페스 10 mM이, KCl을 350 ㎜,의 MgCl 2 5mM의, Nonidet P-40 1 %, DTT에서 그들을 재현 탁, 구슬을 스핀 다운 minifuge를 사용하여 ) 및 자석에 그들을 수집합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. </li><li> 새로운 미리 냉각 된 RNase없는 관에 구슬을 변경하고 두 번 씻는다. 자석 구슬을 수집하고 구슬 트리 졸 직접 1 ml에 첨가하여 RNA 추출을 진행하고 제조업체의 지침을 따릅니다. </li></ol> 7. RNA 정리 및 품질 평가 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라하고, RNeasy 마이크로 키트를 사용합니다. 완료시, 엘 루트(X) μL의 RNase없는 물과 전자 RNA. 2 60 ° C에서 분 및 저장을위한 따뜻한 스냅 냉동 샘플을 -80 ° C에서. bioanalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 확인 (제조업체의 지침에 따라). </li><li> TRAPed RNA의 특이성을 테스트하려면, 제조업체의 지침 (첨자 III)에 따라 정제 RNA (입력 및 IP)의 3 NG에 역전사를 수행합니다. 유전자 특이 프라이머 세트를 사용하여 qPCR에 얻은 cDNA를 사용합니다. </li></ol>

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이 논문은 초파리 배아에서 희귀 세포 집단의 연구에 전념 수정 번역 리보솜 선호도 정화 프로토콜 (별명 &#39;TRAP-RC&#39;)를 설명합니다. 정보는 마이크로 어레이 또는 RNA-서열 분석, 배아 용해 및 polysome 추출을위한 즉, 1) 필요한 생물학적 물질의 수량 및 최적화 과정에 적합한 수율 특정 RNA의 성공적인 분리를위한 주요 단계에 제공된다; 2) 비즈 / 항체 - 투 - 해물 최적의 면역에 대한 비율; 높은 특이성과 민감도와 TRAP-RC 실험을 실행하기 위해 3) 세척 버퍼 조성물을 포함하는 배경의 감소를 허용하는 단계를 반복합니다. 이 프로토콜은 쉽게 임의의 다른 세포 유형에 적용하게 재현 데이터를 산출한다. 이 기술은 활발-mRNA의 번역 수준에서 차등 유전자 발현을 분석하고, 따라서 사양의 단백질 발현을 이해하는 방법을 포장하는 것을 가능하게<html> 특정 시간 윈도우에서 IFIC 셀형. 단백질 풍부 번역 및 분해 과정의 속도에 따라 달라집니다하지만 있습니다. TRAP 방법의 중요한 한계는 정확한 정량적 인 방법으로 단백질 함량을 측정 또는 번역 후 변형을 감지하는 없다는 것이다. 세포 - 유형 특이 적 방식으로, 그렇게함으로써, mRNA의 리보솜 본체 따라 밀도를 측정하여 정량을 개선하여 리보솜이 매우 강력한 도구 TRAP footprinting에 결합을 할 수있다. 최근의 논문 (34)에,이 조합은 인간 배아 신장 293 세포에서 수행 하였다. 저자는 스트렙 타비 딘 비즈를 사용하여 RpL10A의 유도 비오틴 형태의 친 화성 정제 다음에 뉴 클레아 배출량 측정을 달렸다. 이는 제한이 목적에 필요한 생체 물질의 양이 되, 특정 세포 유형에 타겟팅하는 동안 전체 유기체 리보솜 배출량 측정을 수행 할 수 있다는 원칙의 증명이다. &quot;&gt; 글로벌 transcriptomic 분석과 병행하여 트랩 실험을 수행하는 것은 가능 새로 전사와 RNA를 번역 actively-.이 특정 발달 상황 또는 특정 세포 집단에서 발생하는 잠재적 인 전사 후 메커니즘의 깊이 정보가 될 것입니다 사이의 비율을 추적 할 것 예를 들어 의하여 - 마이크로 RNA. 결론적으로, 트랩은 셀 특정 방식으로 적극적으로-번역 리보솜에 바인딩의 RNA를 식별하기위한 매우 효율적인 특정 민감한 방법이다. 이 방법은 미생물 및 조직 유형의 광범위하게 사용될 수있다. 여기에 설명 된 새로운 TRAP-RC 프로토콜은 희귀 세포 집단 (총 세포 수의 1 % 미만)과 전체 게놈 수준에서의 후속 분석을위한 충분한 최종 재료의 양에 대해 최적화되었다. 이러한 방법의 한계는 COMP 가능하기에 충분한 양으로 리보솜 태그를 생성하는 강한 운전자의 요구 인대상 세포 유형에 내생 태그가없는 사람과 죽어 야지. 최근의 연구 (25)에서, 저자 10-30 %로 태그가 지정되지 않은 리보솜 대 태그의 비율을 추정했다. 상당히이 균형을 개선해야 UAS-RpL10A-EGFP 복사 수를 늘려이 문제를 해결하려면. 대안 적으로, 설명 된 유전 배경 UAS-GAL4 트랜스 추가 GAL4 단백질의 생산을 증폭하며 간접적 RpL10A-EGFP의 발현을 증가시킨다. 이 mRNA의에 태그 리보솜의 더 나은 점유를 선호한다. 이 이미 효율적인 접근법은 훨씬 더 강력한 양적 측면을 가지고 또는 발견 및 유전자 발현 조절에 필수적인 분자 메커니즘을 해명하기 위해 보완적인 방법을 채택하여 제조 될 수 있습니다.

세포가 개발 과정에서 특정 속성을 취득하는 방법을 이해하는 것은 기관의 복잡성과 병리학 적 조건에 대한 그들의 잠재적 인 진화를 감사하기 위해 매우 중요하다. unrevealing 글로벌 유전자 발현 프로파일에 의해 세포 사양과 차별화를 underly 유전자 조절 네트워크를 해독 할 수있는 큰 연구 푸시가있다, 폴 II 결합 상태, 조절 서열 또는 히스톤의 번역 후 변형에 전사 인자의 점유. 글로벌 수준의 마이크로 어레이에서 유전자 발현을 평가하고 RNA-서열 방식이 사용된다. 마이크로 어레이는 RNA-서열이 코딩을 포함하고 마이크로 RNA, lncRNAs 또는 snRNAs 등의 RNA를 비 암호화 RNA를 다른 유형에 알리는에 더 기어드 반면, mRNA의 풍요 로움을 감지 할 수 있습니다. 그러나, 이들 기술이 활발히-전사 구별 할 수, 정상 상태의 mRNA는 mRNA의 번역을 적극적-하고는 mRNA를 분해 공정에 진입. 정상 성을 측정mRNA 수준을 먹은 것은 프로테옴 구성 1-3의 가난한 추정 것으로 알려져있다. 반대로에서의 mRNA를 적극적으로-번역 식별하는 단백질 생산의보다 정확한 사진을 제공합니다. 그러나, 연구는 주로 transcriptomic 야생형 조건 4-7 또는 해부 조직에 이득 또는 특정 인자의 기능의 상실을 비교 해석 유전자 발현 프로파일을 어렵게하여 전체 유기체 레벨 주도되어왔다. 세포 표적 도구, 친화력 정화 및 감도 향상의 최근 발전은 이제 게놈 전체의 살아있는 유기체의 작은 세포 집단 또는 단일 세포 분석을 수행 할 수 있습니다. 초파리에서 유전자 변형 라인의 큰 컬렉션은 세포의 기능에 필요한 분자 메커니즘의보다 정확한 정량을 산출 GAL4 / UAS 시스템 8-10를 통해 다른 조직과 세포 개체군의 특정 시간과 공간 타겟팅을 할 수 있습니다. (11) 적극적으로-번역 캡처하는 방법으로 기술되었다 polysome. 자당 기울기 원심 분리에 따라이 방법은 마이크로 어레이 또는 깊은 시퀀싱 분석 할 때 polysom​​e 분율의 mRNA의 결정의 선택이 게놈 전체의 번역 할 수 있습니다. Polysome 격리 번역 프로세스 (12) 동안 보호 리보솜 RNA 단편에 대응 리보솜 발자국을 식별하는 뉴 클레아 제 소화에 결합 될 수있다. 배출량 측정은 리보솜 RNA의 번역 및 RNA 서열 수준의 해상도와 정량화의 리보솜 위치의 정밀도가, 번역 속도를 측정하는 것을 가능하게 증가한다. 그러나, 주로 리보솜 배출량 측정 프로세스의 끝에서 얻은 RNA 수율 강한 감소로, translatomes 셀 고유의 분리에 적용되지 않은 날짜. RNA의 크기 선택은 잠재적 인 거짓 페이지를 생성 할 수 있음을 감안할 때또한 유사한 방식으로 RNA를 보호 할 수있는 다른 RNP들로부터 ositives는, 상기 발전은 리보좀 배출량 측정을 개선하고 셀 특정 접근법에 적응하기 위해 필요하다. 이러한 방법 중 하나는 번역 리보솜 선호도 그래피 (TRAP)이 Heiman 등에 의해 2008 년에 설명 된 호출. 및 마우스에서 뉴런의 서브셋으로부터 translatome을 분리하기 위해 적용. 으로 세포 유형 특정 방식으로 리보솜 단백질을 항원 - 태그, polysom​​es 선택적으로 세포 분리 및 분류의 힘든 단계없이 정제 할 수있다. 이 경우, 리보솜의 표면에서의 60S 리보솜 단백질 L10A은 eGFP는 13로 태그되었습니다. 2008 년부터 여러 연구는 X와 14-19 쥐에서, 다른 종에이 방법을 사용했다 24 장대 20, 21, 22, 23 제브라 피쉬와 애기 장대를 laevis의. TRAP 방법은 또한 초파리 모델 적응 및 푸리에 사용되고회계 연도 세포 유형 특정 신경 세포 (25)와 성상 세포 (26)에서의 mRNA. 다목적 진 GAL4 / UAS 시스템은 조직 - 특이 적 방식으로 태그 된 RpL10A GFP를 발현하기 위해 사용되었다. 성인 파리의 머리는 서열되었다 (팬 신경 Elav-GAL4 드라이버 대상) 신경 세포 고립의 RNA에서 polysom​​e 선택을 수행하기 위해 해부했다. 상향 조절 된 유전자의 상당수 초파리 배아 개발 (이하 1 세포의 %) 본를 접근 좋은 특이성을 갖는 것을 나타내는 희귀 세포 집단에 적응하도록 우리를 자극하는 신경 조직에서 발현되는 것으로 알려진 것에 대응 . 분자 배우와 형태 형성 운동이 진화 적으로 보존되는 것과 초파리 모델 내에서 배아 단계는 발달 과정의 연구를위한 선택의 모델입니다. 이 모델에서 지금까지 수행 만 조직 - 특이 적 접근법 transcriptomic 정도로 세포 핵을 사용하여 수행되어왔다rting 만 플라이 배아에서 조직 / 세포 특이 translatome 프로파일에 전념 방법에 대한 필요성을 생성, 정상 상태의 사체 27-31을 연구 할 수 있었다. 여기에서 우리는 초파리 배아에 전념 최초의 트랩 프로토콜을보고합니다. 이 방법으로, 결합-mRNA의 번역에 배아 당 약 100 근육 세포의 매우 한정된 세포 집단에서 성공적 고품질와 특이 단리 하였다. 이진 GAL4 / UAS 시스템은 어떤 독성없이 근육의 모집단에서 GFP - 태그 RpL10A의 발현을 구동하는 데 사용됩니다, 명백한 표현형 또는 발달 지연은 이전에 보여주지로 (25). 초파리 배아 근육을 야기 할 것이다 hemisegment 30 근육을 가지고 유충의. 아이디로 처지 유전자의 주변에서 발견 조절 영역을 이용하여, 30 멀티 유핵 근육 중 6 타겟팅. 이 분석에서, 리보솜들은 번역을 사용하여 신장에서 mRNA를 고정화사이클로 헥시 미드를 억제제. 세포질 추출물을 GFP 항체 - 코팅 된 자성 비드와의 친 화성 정제를 위해 사용된다. 정제 RNA의 품질 bioanalyzer를 사용하여 검증 하였다. 정량 역전사 PCR (RT-qPCR에)는 특이 mRNA의 분리의 감도를 결정하는 데 사용하고 최적화 된 프로토콜은 매우 효율적인 것으로 입증되었다.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Purified BSA 100X&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Antibody GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td><td>75-132&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis homogenisation&amp;nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM96406</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM95306</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose waddin unbleached&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sieves 112, 355, 710 um&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&amp;nbsp;</td><td>28948964</td><td></td></tr><tr><td>Low binding filter tips&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase free tube 1.5 ml&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Fischer Bioreagent&amp;nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

초파리 배아 체세포 근육 시스템은 hemisegment 30 근육으로 구성되어, 각각의 근육은 속성의 특정 세트가 있습니다 : 신원 유전자, 위치, 융합 이벤트, 부착 사이트와 신경 분포의 수의 코드입니다. 특정 근육 mRNA의 서브 세트의 번역을 식별하는 것은 이들 특정 근육의 특징을 형성하기 위해 필요한 단백질에 대한 정보를 제공 할 것이다. 아이디로 처지 유전자를 발현하는 근육의 모집단에서 TRAP 기반 방법을 이용하여 RNA는 (도 1A-B)로 정제 하였다. 이 접근법의 주요 관심사는 절연 RNA의 품질 및 특이성이다. 여기에보고 최적화 프로토콜은 bioanalyzer 분석으로 평가 고품질 RNA의 체계적인 복구 할 수 있었다. 프로필을 얻을 쇼 RNA의 저하없이 (그림 1C). 트랩 방법 주위에 개발 된 다른 연구에서, 질문은 데이터의 특이성을 통해 제기되었다. 여기에 우리 전비드 또는 튜브 RNA의 비특이적 결합 및 세척 완충액의 최적화에 의해 연결된 배경을 억제하는 방법을 mProve는. 배경 수준과 처지 발현 세포를 분리의 효율을 평가하기 위해, 우리는 같은 배아 단계의 3 복제에 RT-qPCR에 시험을했다. 4 가지 유전자의-부화를 접어 (mef2, 능력있는, 프로스페로, soxNeuro)가 RpL32 유전자 (그림 1D)에 대한 입력 및 표준화에 비해 계산 하였다. 이러한 결과는 범 근육 유전자 mef2하고 능력있는 유전자의 5.6 배 농축의 2.3 배 농축을 보였다. 대조적으로, 신경계에서 발현 유전자는 두 입력 고갈 비교 하​​였다. 매우 유사한 배 변화 값은 프로토콜이 강력임을 보여주는 3 생물학적 복제에 관찰되었다. 150 × 10 ^ 6 개의 긍정적 인의 (총 100 GFP 세포 / 배아를 포함 얻었다 1.5 × ^ 6 배아 주위에, 1.5 g을 시작 슬러-GAL4 드라이버와세포). 트랩 실험을 실행 한 후, 수율은 무대의 이익에 따라 특정 RNA의 약 25 ~ 45 NG입니다. 이 물질을 마이크로 어레이 분석 또는 RNA-SEQ 라이브러리를 구축하는 증폭 프로토콜을 이용하여 RNA-SEQ을 실행하기에 충분하다. 효율 RpL10A-EGFP를 표현하기 위해 사용 드라이버의 강도에 크게 의존 할 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> 그림 1. 품질과 슬러-GAL4&gt; UASRpL10A-EGFP 배아에서 트랩 절연 RNA의 특이성 평가. (AB) hemisegment (A) 당 여섯 슬러 근육 세포에 특이 RpL10A-EGFP 발현을 나타내는 단계 16 배아 공 촛점 이미지. 일반적으로 근육 마커 Beta3tubulin와 RpL10A-EGFP의 공동 현지화 병합 사진 (B)에서 관찰된다. (C) TRAPed RNA 라의 품질 관리N bioanalyzer에 rRNA의 18S와 28S의 완벽한 무결성을 표시합니다. (D) RT-qPCR에 분석 단계-16 배아의 3 생물 복제 함정 절연 mRNA의 실험의 높은 특이성을 보여주는. 접어 변화는 입력과 RpL32 유전자에 대한 표준화에 비해 계산됩니다. 모든 근육 계통에 존재하는 Mef2 성적은 더 제한된 능력있는 성적이 5.6 배 풍부한 반면 입력에 비해 2.3 배 강화된다. 신경 프로스페로를 발현하는 세포와 soxN 유전자는 2.2 배 각각 5.5 배 고갈된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다 (N = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.8K 조회수.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

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Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

연구

유전학

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

생화학

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

중간 규모의<em&gt; Drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

발생학

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

생물학

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

단백질 - 단백질 상호 작용을 확인<em&gt; 초파리</em탠덤 선호도 정화로&gt; 성인 머리 (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

생체</em에서 단백질 복합체를 분리> 가교 접근 초파리 태아

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

중간 규모의

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

전체 마운트 RNA 형광

단백질 - 단백질 상호 작용을 확인

생체 가교 접근 초파리* 태아*

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생체 가교 접근 초파리 태아

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