미국 암 협회 (MRSG - 08-108 - 01), 빈센트 J. 스그로 / 미국 뇌종양 협회, 그리고 나카노에 대한 칸 가족 재단.

1. 미디어 준비 <ol><li> 과립은 (1.01614.1000 - EMD, 0.6 %의 아가르 솔루션은 정화와 - DMEM/F-12에서 (1X), 액체 1시 1분 (Invitrogen 10565-042) - 미디어는 10% FBS을 (GIBCO 16140-071)을 사용하여 준비했습니다 ). 무균 조건은 실험을하는 동안 유지되었다. </li><li> FBS의 미디어 5mL의 준비를 위해 (16140-071 - GIBCO) - 50mL의 최종 볼륨을 만드는 액체 1시 1분는 (Invitrogen 10565-042), DMEM/F-12 (1X)의 45mL에 추가되었습니다. 준비 미디어는 37 ° C의 온도에서 물을 욕조에 보관되었다. </li><li> 한천 솔루션은 열 전자렌지 방법을 사용하여 준비되었습니다. 0.3 그램 과립 한천은 전자 레인지를 사용하여 50mL 증류수에 용해되었다. 한천 솔루션은 물 목욕으로 그것을 유지하여 37 ° C의 온도로 냉각되었다. </li><li> 우리는 단계로 1.2와 1.3 준비 재고 솔루션에서 미디어의 동일한 음량을 사용합니다. 0.6 %의 한천 (0.5mL)와 10 %의 FBS-D-MEM/F-12 미디어 (0.5mL)의 비율은 6 잘 접시의 각 잘 1 ML의 전체 볼륨을 만드는 1시 1분했다. </li></ol> 2. 조직 처리 <ol><li> Glioblastoma Multiforme (GBM) 조직은 즉시 병리학학과에서 수술 후 받았습니다. 조직은 병리학학과에서 GBM으로 분류되었다. </li><li> 조직은 신중하게 집게를 사용하여 patri - 판에 전송 3 시간에 얼음처럼 차가운 5mL의 1XPBS로 세탁했다. </li><li> 표본의 시리얼 부분은 수술 블레이드 (깃털 - 2976 # 10)과 forcep (피셔 과학)와 종양 블록 (직경 약 10mm)을 만들기 위해 해부를 샘플에서 절단되었다. </li><li> 블록은 6 잘 접시에 양도했다. 미디어의 각 잘 포함되었다 1mL 단계 1.4에 대한 언급. 조직 조직은 가능한 유지하는 공기 충분한 노출을했다. </li><li> 종양 블록은 다음 DMSO (5 %) 또는 TMZ (2.5 NM) 중 하나와 함께 주입 37 16 시간 동안 incubated되었습니다 ° C 5 % CO2를 포함 humidified 공기 인치 DMSO의 0.1mL (5 %) 또는 TMZ는 지속적인 치료를 위해 다른 장소에서 종양 블록 3 회 주입했다. 약물은 28G1 / 2 0.37X12.7mm 인슐린 주사기 1mL (컴포트 포인트 26,027)를 사용하여 주입했다. </li><li> 16시간 후 블록이 3 회 5 ML 1XPBS로 세탁했다. 블록을 세탁 후 50 ML 튜브 24 시간 동안 V / V 포르말린 10 % (리카 화학 회사) (Basix - 5539802)의 10mL로 고정되었으며 4μm 섹션을 임베디드 파라핀에 대한 처리. </li><li> 포르말린 고정 부분은 &#39;NO 열 &quot;로 저어 접시에 비커에 배치하고 각 솔루션에 30 분 동안 다음과 같은 솔루션을 통해 처리되었습니다. 30 % 에탄올, 50 % 에탄올, 75 % 에탄올, 80 % 에탄올, 95 % 에탄올, 100 % 에탄올, 그리고 크실렌. </li><li> 조직은 종이 타올에 blotted 30 분 (58-60 ° C, 피셔 Paraplast의 파라핀) 용해 파라핀에 배치되었다. </li><li> 조직 Surgipath 블루 리본 파라핀을 사용하여 금형에 박혀 있었어, 임베디드 조직은 상온으로 냉각되었다. </li><li> 파라핀 임베디드 4μm 조직 섹션은 촬영과 피셔 플러스 슬라이드에 배치했다. </li></ol> 3. Immunohistochemistry 앞에서 설명한 것처럼 Immunohistochemistry이 수행되었다 1. <ol><li> Deparaffinization 및 rehydration 플레이스 랙에 슬라이드와 다음 단계를 수행합니다. 3x5 분 (5 분 3 회), 3x5 분 100 % 에탄올, 1x5 분 95 % 에탄올, 1x5 분 70 % 에탄올에 대한 크실렌은 3 분 동안 수돗물을 실행에 린스. </li><li> 유리 비커에 증류수에 희석 1X 구연 산염 버퍼 (온습 과학 - AP9003 - 500)에 열을 유발 에피토프 검색 담가 슬라이드와 항원 검색. 뜨거운 접시 (확인 섹션 돈 &#39;T는 슬라이드를 버린다고 벼르고)에서 15 분 동안 끓여. 상온에서 30 분 쿨 솔루션. 3x5 분 1X PBS로 슬라이드를 씻어. </li><li> 내부 과산화수소의 억제는 15 분 동안 유리 비이커에 0.3 %의 과산화수소 (피셔는 증류수에 언티픽 BP2633 - 500 - 희석)와 메탄올의 슬라이드 (피셔 사이 언티픽 - 452 - 4) 몰두. 3x5 분 1X PBS로 씻어. </li><li> 10% 정상 염소 혈청과 조직을 커버 차단. 습기 상자에 슬라이드를 전송하고 실온에서 1 시간 품어. 3x5 분 1X PBS로 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 인간의 구체적인 Caspase - 3 (1:1,000, R &amp; D 시스템, AF835), Ki67은 (1:1, Dako, 15626) 1X PBS로 희석 : 기본 항체 섹션은 ° C 기본 항체와 함께 다음과 같은 농도에서 4 박 incubated했다. 다음날 1X PBS 3x10 분 안에 슬라이드를 씻어. </li><li> 차 항체 반응은 HRP 분류 이차 항체로부터 2-3 방울 (구상 시스템)와 함께 조직을 커버. 습기 상자에 슬라이드를 넣고 실온에서 1 시간 품어. 3x10 분 1X PBS로 씻으십시오. </li><li> 검색은 제조 업체의 프로토콜을 다음과 주요 항체의 검출을위한 chromogen DAB 키트 (벡터 연구소 - SK - 4100)를 개발할 수 있습니다. </li><li> 카운터 얼룩은 (hematoxylin으로 슬라이드를 담가 10-15 S<html> econds는) 확실히 돈 &quot;T 오버런 DAB 신호를 확인하십시오. 3 분 수돗물을 실행하는 린스. </li><li> 탈수 담가 다음과 같은 순서로 슬라이드, 3x5 분 크실렌 5 분, 5 분 95 % 에탄올, 3x5 분 100 % 에탄올에 대한 70 %의 에탄올. </li><li> permount 설치 시약 (피셔 사이 언티픽 SP - 15-100)으로 슬라이드를 살짝 커버. </li><li> 이미지 올림푸스 형광 현미경 (DP - 72) .3.11)를 사용하여 촬영되었다. 모든 실험에서는 특정 상표는 기본 항체없이 대조군에 의해 확인되었다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 우리는 glioblastoma multiforme의 (GBM)의 수술 표본을 수집했습니다. 환자는 temozolomide (TMZ)를 포함한 사전 c​​hemotherapies없이 첫 번째 수술을 받았습니다. 그림 - 1A의 가돌리늄 강화와 MRI의 T1 - 가중 이미지는 수술 전에 오른쪽 전두엽에있는 향상된 종양을 보여주었다. 수술 이미지 (그림 - 1B)은 수술 후 병변의 제거를 확인 소계. 외과 조직은 임상 진단 목적으로 병리의학과로 전송되었고, 나머지 표본은 승인 기관 심사위원회 (IRB) 오하이오 주립 대학 메디컬 센터에서 프로토콜에서 조직 조달로 처리되었습니다. Hematoxylin과 Eosin (H &amp; E) 염색법은 괴사의 존재, pseudopallisading 세포 및 microvascular 증식 (그림 1 - C)을 보여주었다. 따라서,이 종양은 histopathologically GBM으로 진단되었다. 노트, 최대 48 시간 TMZ없이 부화에 따라 종양 explants은 GBM의 cytoarchitecture를 유지. 대조적으로, 72 시간 또는 그 이상 부화와 함께, 우리는 종양 세포의 일부가 시작 제안, 표본의 응축 핵의 증가 수를 발견 apoptosis을 받다. 그 결과, 더 이상 부화 다음과 종양 조직은 우선적으로 괴사 영역 (데이터가 표시되지 않음)에서 주변 관찰되었다 종양 세포를 분실 곳곳에 지역이 포함되어 있습니다. 이러한 종양 explant 샘플이 안정적으로 약물 효능 검사의 목적으로 활용할 수있다면 조사를 위해, 우리는 TMZ 치료의 효과를 테스트. 그림 2는 본 연구의 실험의 흐름을 나타냅니다. 최근 연구 TMZ의 intratumoral 주입이 약 2 체계 관리의보다 악성 glioma의 성장 제어에 대한 자세한 강력한 효과를내는 것으로 지적했다. 16시간에 대한 부화 후, 이러한 explants은 파라핀 및 시리얼 부분이 얼룩을 위해 준비했던 내장했다. TMZ - 처리 GBM 조직의 Immunohistochemistry은 컨트롤 샘플과 비교 기 - 67 - 긍정적인 종양 세포의 상당한 감소를 보여주었다. 차례로, apoptosis 마커, Caspase - 3와 immunohistochemistry이 TMZ - 대우 glioma의 표본과 컨트롤 샘플 (그림 - 3) 사이에 상당한 차이를 얻을하지 않았다. TMZ 치료 효과는 더욱 체외 문화 또는 유동세포계측법의 하나와 함께이 explant 분석을 결합하여 특징했다. 특히, 우리는 줄기 세포와 같은 종양 세포 (SCLTC)에 미치는 영향을 결정하는 모색. 따라서 TMZ와 치료 intratumoral 다음, 우리는 구체 형성 분석하고 이러한 종양 explants의 유동세포계측법을 수행. TMZ - 처리 표본 개별 단일 세포로 dissociated되었으며 이러한 단일 세포는 bFGF와 EGF와 보충 혈청이없는 배지에서 96 - 웰 플레이트 (1 microliter 당 셀 또는 낮은) 낮은 밀도에서 씨앗을 품고 있었다. 컨트롤 그룹에서 종양 explants에서 종양 분야의 형성은 칠일 보육 후에 관찰되었다. 영역 형성이 SCLTC 3 4의 속성임을 감안할 때, 약물 치료에 의해 ​​종양 분야의 숫자에 변경이 SCLTC에 효과를 나타냅니다. 마찬가지로, 세포 표면 마커, CD133과 dissociated 종양의 explants의 유동세포계측법는 SCLTC에 대한 효과를 확인하기 위해 실시되었다. GBM의 이종 종양 세포에 SCLTC가 선택 약물 치료에 의해 일으킬 수있는 요소들은 미리 제거하는 경우, 하나는 유동세포계측법 치료 (데이터가 표시되지 않음)에 의해 CD133 양성 분획의 감소를 감지해야합니다 예측할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="그림 1"/> 환자 GBM의 Figure.1 자기 공명 영상 (MRI). 사전 작업 그림 - 1A 및 수술 그림 - 1B의 대표 인물. 그림 - 1C 신선한 GBM 조직 샘플의 H &amp; E 염색법이다. 원본 확대, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림. 블록 문화 실험 2 실험 흐름. 그림 - 2A. 신선한 외과 GBM의 이미지는 병리의학과에서 받았다. 그림 - 2B가 도움 수술 칼날로 10mm 작은 조각으로 종양이 블록의 절개를 보여줍니다. 그림 - 2C는 인슐린 주사기를 사용하여 종양 블록의 약물 (TMZ) 치료입니다. E 3 &quot;/&gt; 그림. 활성화 Caspase - 3와 Ki67과 DMSO 또는 TMZ와 함께 주입 GBM 조직 블록 3 Immunohistochemistry. Immunohistochemistry. Hematoxylin은 핵 얼룩을 위해 사용되었다. 원본 확대, 40X.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

현재 사전 임상 실험 모델에서 약물 효능과 환자의 효능 사이에는 큰 차이가있다. 보다 구체적으로, 뇌 종양 연구 분야, 소설 및 신뢰할 수있는 방법은 현재의 방법으로 약물 평가 및 환자의 효능 사이의 기존의 격차를 작성 데 도움이 될 것이 필요합니다. 본 연구에서 설명하는 분석은 영향을받는 환자의 실험 데이터 및 결과의 불일치를 작성 촉진 않을 경우 솔루션 추가 자산입니다. 체외 세포 배양에 우선적에 관계없이 문화 조건의 특정 종양 세포 유형을 확장하고, 또한 전체 종양만을 subpopulation. 5 대표, 인공 세포 확장의 유전자와 phenotypic 변화가 발생하고 장기 세포 배양과 피할 수있다 . 악성 glioma을 치료하는 가장 큰 장애물 중 하나는 단일 종양 이내에 종양 샘플 6, 7 사이에 두 종양 세포의 이질입니다. 따라서,에 관계없이 한 종류 또는 다른 사람의 종양 세포의 특정 인구의 선택적 농축은 이기종 종양 세포에 대한 chemotherapeutic 요원의 효험을 결정하는 적절한 수단하지 않을 수 있습니다.의 subpopulation에서 파생된 뇌 종양의 8 9 모든 동물 모델 종양 세포는 subpopulation에서 약물 효험에 조명을 흘리다가 아니라 전체 종양. 몇 가지 제한이, 다른 한편으로는, 여전히이 종양 explant 방법에 남아 있습니다. 하나는 이러한 제한은 치료의 비교적 짧은 기간입니다. 악성 종양 세포가 전부는 아니 시간이 지남에 따라 치료법이, 단기 종양 세포 성장의 초기 컨트롤이 장기 환자의 예후 (豫 后)에 의해 반영되지 않을 수있다면, 대부분의 저항를 얻기위한 것으로 간주되므로, 같은 최근과 방지 신고 angiogenic 대리인, bevacizumab 10. 따라서, 긴 기간 동안 조직을 유지하기 위해이 explant 분석을위한 프로토콜의 개선은 추가 조사가 필요합니다. 또 다른 질문은 종양의 SCLTC에서 테스트 약물의 구체적인 효과입니다. SCLTC 악성 glioma, potently SCLTC가 보증됩니다 근절 소설 안티 - 암 의약품의 식별에 대한 현재 치료 상대적으로 강한 것을 감안할 때. 이러한 점에서, 우리는 현재와 같은 neurosphere 형성 분석 (데이터가 표시되지 않음)로 체외 실험에서 이후이 explant 분석을 결합을 추구합니다. 우리는이 결합을 통해 assays SCLTC에 약물 후보의 경우, 효과에 대한 자세한 내용을 보려면 기대하고 있습니다. 마지막으로, 종양 샘플을 작은 블록을 사용하면 같은 수술 표본에서 기존의 종양 세포 라인 또는 기본 문화권의 경우는, 전체 종양 세포의 인구를 반영하지 않을 수 있습니다. 별도로 이러한 문제, 혈관 틈새를 포함한 종양의 기질을, 보존하는 것은 종양 세포에 대한 환경 요인을 특성화에 도움이됩니다. 따라서이 분석은 더 생리학 관련 조건에 따른 치료 전략을 평가하는 가능성이있을 수 있습니다. 여기, 우리는 GBM의 수술 표본의 explants과 약물 효능 검사에 대한 분석을 설립했습니다. 사실, 테스트 수술 표본과 함께, 우리는 TMZ의 직접 분사는 GBM 샘플의 확산을 줄일 수있는 것으로 나타났습니다. 이 조직 explant 방법은 다른 고체 암에 이론적으로 적용하고 아마 우리가 암에 대한 임상 실험에서 다른 실패를 피하 도움이 될 것입니다 환자의 종양에 대한 약물 효험을 결정하기 위해 자산을 제공합니다.

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청, 공인, 열 Inactivated </td><td> GIBCO </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 (1X) 액체 1시 1분 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> 한천 - 아가르 정화, 과립 </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> 염색법에 대한 DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14,190 </td></tr><tr><td> Hematoxyllin </td><td> Richalrd 앨런 문화 </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> 10% W / V 포르말린 Caspase - 3 </td><td> 리카 화학 회사 </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Caspase - 3 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15,626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> 시스템 안티 마우스 구상 </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> 구상 시스템 안티 - 토끼 </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB - 키트 </td><td> 벡터 연구실. </td><td> SK - 4100 </td></tr></table> 표 1. 재료. <table border="1"><tr><td> 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 6 웰 플레이트 </td><td> 그라 이너 - 바이오 일 </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> 페트리 접시 </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> Serological 피펫 </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> 필터 팁 </td><td> 미국 과학 </td><td></td></tr><tr><td> 500 μm의 폴리 에스테르 메쉬 Netwe​​ll 삽입 </td><td> 코스타 </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel 매트릭스 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> BD 10 ML 주사기 </td><td> BD biosciences </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> 피하 주사 바늘 알루미늄 허브. </td><td> 타이코 건강 </td><td> 2,000,029 </td></tr><tr><td> 조직 문화 플라스크 </td><td> 코닝 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 분리기 튜브 </td><td> Basix </td><td> 5,539,800 </td></tr><tr><td> 얇은 벽 튜브 </td><td> 이튼 </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> 외과 블레이드 스테인레스 스틸 </td><td> 깃털 </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> 인슐린 주사기 </td><td> 컴포트 포인트 </td><td> 26,027 </td></tr><tr><td> 50mL 플랫 톱 스크류 캡 튜브 </td><td> Basix </td><td> 5,539,802 </td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td> Tritech </td><td></td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> 올림푸스 </td><td> DP - 72 </td></tr><tr><td> Forcep </td><td> 피셔 문화 </td><td></td></tr></table> 표 2. 장비.

method for novel anti-cancer drug development using tumor explants of surgical specimens

악성 glioma에 대한 현재의 치료법은 완화 효과가 있습니다. 치료 개발 들어, 하나의 장애물은 현재 약물 효능 검사와 환자에 대한 효능에 의해 결정 효능의 차이가 있습니다. 따라서, 약물 효능을 평가하기위한 소설과 신뢰할 수있는 방법은 미리 임상 단계에 보증하고 있습니다. 전지 라인을 포함하여 종양 조직,의 체외 문화에서 세포 배양의 인공 환경에 의한 암 세포의 실질적, phenotypic 유전 및 epigenetic 변경을 가지고있는 원위치에 원래 종양의 생물학을 반영하지 않을 수 있습니다. immunodeficient 생쥐와 이종 이식 모델은 즉, 면역 시스템의 부족을 제한하고 microenvironment의 유전 및 epigenetic 불일치를 interspecies. 여기, 우리는 치료 효과를 평가하는 undissociated 종양을 차단 등 악성 glioma의 수술 표본을 사용하여 새로운 방법을 보여줍니다. 이 방법의 유효성을 검사하려면, 현재 첫 라인 chemotherapeutic 에이전트 temozolomide (TMZ)와 데이터가 설명되어 있습니다. 우리는 우리의 실험에 대한 악성 glioma의 갓 제거 수술 표본을 사용. 우리는 수술 표본에 부화 및 분석 다음 TMZ 또는 다른 약물 후보의 intratumoral 주사를 수행했습니다. 여기, 우리는, 적어도 현재 제한의 일부를 극복하고 현재 실험 사이의 기존의 간격을 채울 수있을 수 있도록 소설 안티 - 암 요법의 효능을 결정하는 플랫폼으로 종양 조직 explant 방법을 확립하기 위해 노력해 데이터 및 실제 환자의 종양에 효능. 이 방법은 고체 암 치료를 위해 소설 chemotherapeutic 에이전트를 식별 촉진하는 잠재력을 가지고 있습니다.

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

여기, 우리는 뇌 종양의 수술 표본, 칭했다 &quot;종양 explant 방법&quot;으로 약물 효능 검사를위한 방법을 만들었습니다. 이 방법을 통해, 우리는 고체 종양의 microenvironment을 위반하지 않고 약물 효능을 평가할 수 있습니다. 이 방법의 신뢰성을 검증하기 위해, 우리는 현재 첫 라인 chemotherapeutic 에이전트 temozolomide과 치료의 glioma의 표본과 함께 대표 데이터를 설명합니다.

외과 종양 표본의 Explants를 사용하여 소설 안티 - 암 의약품 개발을위한 방법


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

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16.5K 조회수.  The Ohio State University Medical Center. 여기, 우리는 뇌 종양의 수술 표본, 칭했다 "종양 explant 방법"으로 약물 효능 검사를위한 방법을 만들었습니다. 이 방법을 통해, 우리는 고체 종양의 microenvironment을 위반하지 않고 약물 효능을 평가할 수 있습니다. 이 방법의 신뢰성을 검증하기 위해, 우리는 현재 첫 라인 chemotherapeutic 에이전트 temozolomide과 치료의 glioma의 표본과 함께 대표 데이터를 설명...

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

연구

의학

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

소설 고해상도<em&gt; 생체 내</em종양의 성장과 치료학에 두개 내 구조물의 동적 응답을 공부하기&gt; 이미징 기술

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal function of the light sensitive neurons, the photoreceptors. Detachment of the retina from the RPE creates a physical gap that is filled with extracellular fluid. RD initiates cellular and molecular adverse events that affect both the neurosensory retina and the RPE since the physiological exchange of ions and metabolites is severely perturbed. The consequence for vision is related to the duration of the detachment since a rapid reapposition of the two tissues results in the restoration of vision 1. The treatment of RD is exclusively surgical. Removal of vitreous gel (vitrectomy) is followed by the removal non essential part of the retina around the detached area to favor retinal detachment. The removed retinal specimens are res nullius (nothing) and consequently normally discarded. To recover RNA from these surgical specimens, we developed the procedure jouRNAl that allows RNA conservation during the transfer from the surgical block to the laboratory. We also standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for global gene expression analysis. The quality of the RNA was validated both by RT-PCR and microarray analysis. Analysis of the data shows a simultaneous involvement of inflammation and photoreceptor degeneration during RD.

We used retinal samples from retinectomy for a transcriptomic analysis of retinal detachment. We developed a procedure that allows RNA conservation between the surgical blocks and the laboratory. We standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for microarray analysis.

저널을 사용하여 인간의 망막 수술 표본의 Transcriptomic 분석

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

자원 제한 설정에 대한 경제적 인 HIV-1 약제 내성 모니터링 방법

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

수술 후 면역 억제의 메커니즘을 탐색 소설 수술 전후 면역 요법을 평가하기 위해 수술 스트레스의 마우스 종양 모델

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the exact pathophysiology remains unknown. In order to unravel the pathophysiology a murine model of AVF-failure was developed in which the configuration of the anastomosis resembles the preferred situation in the clinical setting. A model was described in which an AVF is created by connecting the venous end of the branch of the external jugular vein to the side of the common carotid artery using interrupted sutures. At a histological level, we observed progressive stenotic intimal lesions in the venous outflow tract that is also seen in failed human AVFs. Although this procedure can be technically challenging due to the small dimensions of the animal, we were able to achieve a surgical success rate of 97% after sufficient training. The key advantage of a murine model is the availability of transgenic animals. In view of the different proposed mechanisms that are responsible for AVF failure, disabling genes that might play a role in vascular remodeling can help us to unravel the complex pathophysiology of AVF failure.

Here we present a murine model of arteriovenous fistula (AVF) failure in which a clinically relevant anastomotic configuration is incorporated. This model can be used to study the pathophysiology and to test possible therapeutic interventions.

동정맥루 실패의 소설 쥐 모델 : 세부 수술

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.