이 프로토콜은 두 가지 화학 건조 방법, Hexamethyldisilazane 및 T-butyl 알코올 및 SEM을 사용하여 대핵 및 진핵 생물을 모두 이미징하는 응용 프로그램에 중점을 둡니다. 이 기술의 주요 장점은 분석을 위해 샘플을 준비하기 위해 임계 점 건조기와 같은 특수 건조 장비를 사용할 필요가 없다는 것입니다. 이 프로토콜은 3가지 유형의 유기체에 대한 화학적 탈수 및 SEM 분석을 사용하는 방법을 설명하지만 많은 유기체 및 조직 유형을 검사하는 데 광범위하게 적용 될 것입니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 학부 생인 매디슨 쿤(Madison Koon)이 될 것입니다. 시작하려면, 하룻밤 고정에 의해 시아노 박테리아를 준비합니다. 그런 다음 폴리카보네이트 25mL 필터를 포함하는 10mL 여과 장비로 이송합니다.
여과 장비의 사이드암과 깔때기를 고무 스토퍼로 밀봉하여 깔때기의 문화를 억제합니다. 두 스토퍼를 모두 제거한 후 여과 플라스크에서 부드럽게 진공 청소기를 청소하여 고정을 제거합니다. 단일 세포 조류 유글레노이드를 준비하려면 이전에 10 mL 여과 장비로 옮겨진 배양에 직접 4 % osmium 테트옥사이드 3 방울을 추가하여 수정하십시오.
30 분 인큐베이션 후, 스토퍼를 모두 제거하고 여과 플라스크에 부드러운 진공 청소기를 제거합니다. 플라스크와 깔때기를 스토퍼로 닫고 세척을 유지하면서 실온에서 0.1 M 인산염 버퍼 pH 7.0의 5mL로 고정 된 유글레노이드를 세 번 세척하십시오. 두 스토퍼를 모두 제거한 후 여과 플라스크에서 부드러운 진공으로 각 세척을 제거합니다.
연속 침수를 유지하면서 시료를 탈수하려면 플라스크와 깔때기를 깔때기에 깔때기에서 에탄올을 포함하기 위해 스토퍼로 닫혀 있는 동안 깔때기에서 5mL의 부피로 10분 동안 등급이 매겨진 에탄올 계열을 사용한다. 두 스토퍼를 모두 제거한 후 여과 플라스크에서 부드럽게 진공 청소기를 제거하여 에탄올을 제거합니다. 샘플을 100% 에탄올이 함유한 일회용 알루미늄 계량 접시에 샘플을 전달하여 시료를 덮습니다.
TBA를 사용하여 유글레노이드의 화학적 건조를 수행하기 위해 먼저 알루미늄 접시의 100% 에탄올 용액을 TBA 1~1용액과 100% 에탄올로 20분 간 교체하십시오. 그런 다음 1 대 1 솔루션을 100 % TBA로 20 분 동안 교체하고 프로세스를 두 번 반복합니다. TBA를 제거하고 샘플을 덮을 수 있는 충분한 신선한 100% TBA로 교체하십시오.
TBA를 동결하기 위해 10분 동안 섭씨 4도에 접시를 놓습니다. 샘플을 냉동 젤 팩을 사용하여 진공 건조기로 옮기면 TBA를 동결하십시오. 로터리 펌프를 사용하여 진공을 대피하고 유지하여 냉동 TBA의 진공 승화로 시료를 3시간 이상 건조시 할 수 있습니다.
아페노이드에 시아노박테리아를 장착하려면 25mm 알루미늄 장착 스텁의 바닥에 라벨을 부착하여 위에 놓여있는 것을 나타냅니다. 그런 다음 각 필터를 스텁 상단에 고정된 탄소 접착제 탭에 놓습니다. Drosophila 멜라노가스터를 준비하기 위해, 마취 된 파리를 섭씨 4도에서 2 시간 동안 고정 된 1 mL에 담그고 완전히 물에 잠겼습니다.
유리 파이펫을 사용하여 고정을 제거합니다. 고정 드로소필라 샘플을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 0.1M 인산염 버퍼 1mL, pH 7.2로 10분 동안 실온에서 3회 세척한다. 유리 파이펫을 사용하여 각 세척을 제거하여 샘플을 제거하지 않도록 주의하십시오.
이어서, 각각 10분 동안 등급에 등급이 매겨진 에탄올 계열을 사용하여 1mL의 부피로 마이크로퍼지 튜브내의 샘플을 탈수한다. 유리 파이펫을 사용하여 각 세척을 제거하여 샘플을 제거하지 않도록 주의하십시오. 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 100%에탄올을 장착하여 샘플을 덮습니다.
HMDS를 사용하여 파리의 화학 건조를 수행하기 위해 먼저 100% 에탄올 용액을 HMDS 1~2솔루션과 100% 에탄올로 20분 간 교체합니다. 그런 다음 솔루션을 HMDS 2~1솔루션과 100% 에탄올로 20분 간 교체합니다. 마지막으로 이 솔루션을 100% HMDS로 20분 간 교체한 다음 프로세스를 한 번 반복합니다.
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 및 HMDS에 있는 시료를 일회용 알루미늄 계량 접시에 옮기십시오. 100% HMDS를 시료를 덮을 수 있는 100%HMDS를 충분히 신선한 100% HMDS로 교체하십시오. 알루미늄 접시 내에 직접 샘플을 화학 연기 후드에 놓고 상자와 같은 느슨한 뚜껑으로 건조하여 이물질이 시료에 떨어지는 것을 방지하고 12~24시간 동안 건조시할 수 있도록 합니다.
드로소필라 를 장착하려면 알루미늄 장착 스텁의 바닥에 라벨을 부착하십시오. 정밀 핀셋을 사용하여 말린 파리를 해부 현미경으로 스텁 상단에 고정된 탄소 접착제 탭에 원하는 위치에 배치합니다. 스텁의 바깥쪽 가장자리에 은 전도성 접착제를 적용합니다.
이쑤시개를 사용하여 은페인트를 파리에 연결하여 전도도를 보장하여 페인트가 원하는 이미징 영역에 닿지 않도록 합니다. 스텁 홀더 상자에 스텁을 놓은 다음 열린 스텁 홀더 박스를 데시카이터에 넣고 실버 페인트가 3시간 이상 건조되도록 합니다. 스퍼터 코팅 장치를 준비하려면 아르곤 가스의 4 ~5 플러시를 수행하십시오.
코팅할 샘플에 따라 타이머를 원고에 설명한 대로 다른 설정으로 설정합니다. 스퍼터는 제조업체의 지시에 따라 스텁을 코팅합니다. 마지막으로, 사용된 샘플에 의존하는 설정이 있는 이차 전자 검출기를 포함하는 스캐닝 전자 현미경을 이용한 이미지 샘플.
이 프로토콜을 사용하여 SEM을 위한 시아노박테리아의 성공적인 준비는 세포의 모양과 질감을 포함하여 세포의 세부사항뿐만 아니라 세포에서 점액 및 투영의 칼집을 볼 수 있는 이미지를 산출했습니다. 콜로라도에서 필라멘트 담수 종의 SEM 이미지는 점액의 눈에 보이는 칼집을 보여줍니다. 오하이오에서 담수 박테리아의 SEM 이미지는 때때로 점액의 얇은 층에 의해 함께 개최 식민지를 형성하는 개별 세포를 보여줍니다.
필라멘트와 같은 돌출은 개별 세포에서 확장됩니다. 텍사스 연안 해역의 높은 명분 하구에서 알 수없는 필라멘트 종의 이미지는 개인과 분할 세포를 보여줍니다. SEM은 두 개의 다른 유글레노이드 종의 펠리클 스트립을 시각화하는 데 사용되었다.
모노모르피나와 아닉마티카를 모노모르피나 의사 피럼과 비교할 때, 후방 끝에서 나오는 펠리클 스트립의 눈에 보이는 발등 배열이 꼬리를 형성하여 종결에 대한 필로겐을 돕습니다. 정상적인 drosophila 눈의 SEM 이미지는 강모와 렌즈의 정렬 된 배열을 보여 주지만 알츠하이머 병과 관련된 단백질의 표현은 거친 눈 표현형을 만듭니다. 거친 눈 표현형을 억제하거나 향상시키는 유전자는 질병 진행에 생리적인 역할을 할 수 있습니다.
다음은 이미지 수집 중에 나타나는 부족한 스퍼터 코딩으로부터 부적절한 건조 기술과 전자 충전으로부터 눈의 붕괴 구조의 예를 포함하여 피하기 위해 잠재적 인 구덩이 낙하의 예입니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 존경받는 공모와 매우 크게 생물을 활용하지만, 모든 생물학의 많은 하위 분야에 걸쳐 과학적 발견에 중요한 유용하고 형태학적 정보를 수집하기 위해 SEM 분석에 적합합니다. T-부틸 알코올, Hexamethyldisilazane, 그리고 osmium 테트옥사이드와 함께 일하는 것은 위험할 수 있으며, 적절한 안전 조치는 항상 사용자를 보호하기 위해 관찰되어야한다는 것을 잊지 마세요, 특히 이러한 화학 물질을 취급 할 학생.
