저자는 우리가 림프 노드 조각을 수행하는 것이 좋습니다 박사 알랭 Trautmann 감사하고 싶습니다. 이 작품은 리그 Nationale Contre 르 암, Fondation 부어 라 레쳐치 Médicale 엉 프랑스와 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 림프절에서 준비 조각 <ol><li> 삽입을위한 4% 낮은 용융 점 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. PBS 및 마이크 로파이 솔루션의 아가로 오스를 희석. 아가로 오스가 완전히 해소되면 ° C까지 사용을위한 준비 37 솔루션을 유지합니다. </li><li> 6 잘 조직 문화 플레이트를 준비합니다. 물론 당 1.1 ML RPMI 전체 문화 매체를 추가하고 각 우물에 organotypic 필터를 삽입합니다. 4 6 - 그럼 플레이트 플레이스 ° C 조각을 전송할 준비까지. </li><li> RPMI 완벽한 매체로 가득 플라스틱 그릇에 4 mm의 내부 직경과 함께 스테인리스 스틸 와셔를 놓습니다. 와셔는 더욱 vibratome 컷 슬라이스에있는 세포를 집중하는 데 사용됩니다. </li><li> 현지 동물 복지 규정에 따라 마우스를 희생. 조심스럽게 주위 조직에서 주변 림프절을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 플라스틱 접시에 놓으십시오. 이들 장기는 매우 부드럽고로 치료는 림프 노드 구조를 손상하지 않도록해야합니다. </li><li> 35 mm 플라스틱 그릇에 4 % 아가로 오스 겔 -를 붓고하고 정교한 젤로 노드를 전송합니다. 하든 5 분 얼음 아가로 오스 겔를 남겨주세요. </li><li> 접시에서 블록을 제거하고 각 림프절 주위 젤의 3~5mm를 떠나하기 위해 한천을 잘라. </li><li> 무독성 조직 접착제와 vibratome의 표본 디스크에 포함된 노드를 연결합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 가득한 사진첩의 표본 디스크를 설치합니다. </li><li> 섹션 한천 - 임베디드 중간 범위 (1.5 ㎜)에 설정된 속도 범위에 설정된 vibratome 속도 (0.3 mm / s)로하고 진동 주파수와 320 μm의 두께로 조직을. </li><li> 그들이 좋은 집게를 사용하여 organotypic 문화 삽입에 절단되는 등 신중하게 림프절의 조각 전송할 수 있습니다. 각 삽입 3 조각 플레이스. 조각이 쉽게 손상될 수있는 큰주의를 기울이시기 바랍니다. 320 μm의에서자를 때 전형적인 주변 림프절은 5 섹션을 얻을 것입니다. 그들은 단지 피상적인 조직을 포함하는 등, 처음이자 마지막 조각 폐기하십시오. </li><li> 각 슬라이스에 스테인레스 스틸 와셔를 놓습니다. 와셔가 잘 조직을 둘러싸고있는 아가로 오스에 위치하고 있는지 확인하십시오. </li><li> 37 문화 판을 품어 ° 5 % CO 2 배양기에서 C humidified 플레이트 T 세포 준비까지. </li></ol> 2. 마우스 림프절에서 T 세포를 분리 <ol><li> 이전에 게시된 조브의 제 3에 따라 T 세포를 분리. </li><li> 바로 T 세포를 사용하여 다음 섹션을 참조하십시오. 그렇지 않으면, lymphocytes 10 NG / ML IL - 7과 함께 보충 RPMI - 미디어 전체에 야간 교양 수 있습니다. </li></ol> 3. 절연 T 세포의 라벨링 <ol><li> HBSS에 세포를 씻으십시오. ML 당 10 × 10 6 동일한 버퍼에서 그들을 Resuspend. </li><li> 0.5 μm의의 최종 농도를주는 1 μm의 세포 커 녹색 CMFDA이 포함된 HBSS 같은 볼륨을 추가합니다. </li><li> ° C 5 분 동안 37 세포 현탁액을 품어. RPMI - 중간 완료와 함께 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> RPMI - 매체 전체에서 ML 당 10 × 10 6 최종 농도에서 세포 Resuspend. 이러한 레이블 세포 조각에 도금 것입니다. </li></ol> CMFDA 이외 형광 염료도 사용하지만, 이러한 분자가 특정 농도 이상의 잠재적인 독성이있다 명심 수 있습니다. 4. 림프절의 조각에 도금 분류 T 세포 <ol><li> 피펫으로 세탁기의 내부 부분에 포함된 초과하는 매체를 제거합니다. 조직이 건조되는 것을 허용하지 않습니다,이 단계에서 신속하게 작동합니다. </li><li> 부드럽게 세탁기의 내부 부분을 1로 2 X 10 5 세포에 해당하는 10-20 μl 표시 T 세포를 분배. 케어는 피펫의 끝에있는 조직을 접촉하지 않도록해야합니다. 세포 현탁액의 드롭이 자리에 유지 있는지 확인하십시오. </li><li> 37 인큐베이터에있는 세포와 조각 플레이스 ° C와 5% lymphocytes는 조직으로 마이 그 레이션 수 있도록 최소 30 분 CO 2. </li></ol> 5. 림프절의 슬라이스 내에 이미징 T 세포 이 비디오 문서에서는, 우리는 위드 거꾸로 현미경과 공촛점 직립 현미경으로 림프절 슬라이스의 이미지 형광 T 세포. <ol><li> 37 온도를 설정 ° C. 우리의 현미경은 온도 제어 챔버를 갖추고 있습니다. </li><li> 산소 (5 % CO 2 95 % O 2) 페놀 레드 무료 RPMI 매체와 림프절 슬라이스의 지속적인 재관류를 지원 재관류 체제를 설치하십시오. Google 시스템에서, perfused 미디어는 중력에 의해 한쪽에서 이미징 챔버에 들어갑니다. 매체는 폐기물 수집 플라스크에 연결된 펌프 aspirated입니다. 미디어 유량 1 ML / 분으로 설정합니다. </li><li> 고급 집게로 정교한 6 잘 판에서 슬라이스를 가지고 조직에 침투하지 형광 세포를 제거하는 몇 초 동안 예열 산소 RPMI 매체의 준비를 찍어. </li></ol> IMA넓은 필드가 바뀌 현미경으로 T 세포를 ging <ol start="4"><li> 유리 바닥 요리의 내부 부분에 접착 나일론 스레드로 구성된 사용자 정의 만든 영상 챔버에 거꾸로 슬라이스를 놓습니다. 이 챔버에서 나일론 스레드는 유리에서 슬라이스를 제고하고 조직으로 확산하는 산소 솔루션을 가능하게합니다. 림프절의 T 세포의 마이 그 레이션 산소에 강하게 의존이므로이 필요합니다. 그 위에 스테인리스 스틸 와셔를 추가하여 슬라이스를 확보. 이러한 조건에서 슬라이스는 재관류 솔루션의 갱신을 용이하게 요리의 바닥 위에 몇 미크론을 자리잡고 있습니다. </li><li> 보기의 넓은 분야 (800 × 800 μm의, 노드의 슬라이스 표면의 약 3 분의 1을) 캡처하려면, 10X 건조 목적 렌즈를 사용하여 이미지를 수집합니다. 우리는 10X 니콘 S 플루어 0.5 NA 우리 분석에 가장 적합한 것으로 나타났습니다. </li></ol> 전형적인 시간 저속 영상 실험은 축 (Z) 차원에서 50 μm의 총 깊이를 스팬 5 광 비행기를 캡처합니다. 형광 T 세포는 일반적으로 10-20 분 동안 10-30초을 이르는 간격으로 몇 군데 있습니다. 공촛점 직립 현미경으로 이미징 T 세포 이 프로토콜에서 사용 공촛점 현미경 20x 물 침지 목표 (올림푸스, 20x/0.95 NA)이 장착된 Leica SP5입니다. <ol start="6"><li> 현미경의 이미징 단계에 슬라이스를 고정합니다. 참고 : 우리는 보통 그것을 고정하기 위해 준비에 세탁기를 놓으십시오. </li><li> Z 축 따라 이미지의 시리즈를 수집하여 이미지 세션을 설정합니다. 손상 조직 구조의 이미지 T 세포하려면 시작 위치는 일반적으로 첫 번째 레이블이 붙은 T 세포 아래의 5-10 μm의에서 설정됩니다. </li></ol> 6. 대표 결과 이 비디오 프로토콜에 따라 당신은 노드의 T ​​존, 정상적으로 생체내 (그림 1)에서이 특정 환경에서 발생하는 현상에 축적 형광 T 세포의 큰 숫자를 시각화하는 기대한다. 특히, T 세포는 단지 캡슐 밑에 일반적으로 B 세포 영역에서 제외되어야합니다. 성공적인 실험은 그대로 림프절 4 얻은 결과를 출판과 일치 높은 운동성이있는 행동 (그림 3)를 표시하는 조직 (그림 2)에 들어갔다 T 세포가 발생합니다. 평균, 조각 내의 개별 T 세포의 평균 속도 가까운 10 μm의 / 분 (그림 4)되어야합니다. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. T 세포는 림프절의 슬라이스에 축적. 찬란 - 표시 T 세포는 (CMFDA, 녹색) 이미지 수집하기 전에 림프절 슬라이스 30 분 (위 사진)에 추가되었습니다. 이미지는 Z 방향으로 50 μm의를 스팬 5 이미지의 최대 투영이다. 명시야 이미지는 하단에 표시됩니다. 이미지는 위드의 현미경으로 캡처했다. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. T 세포는 림프절의 슬라이스에 들어갔다 있습니다. 찬란 - 표시 T 세포는 (CMFDA, 녹색) 공촛점 현미경을 사용하여 이미지 수집하기 전에 림프절 슬라이스 30 분 추가되었습니다. 이미지가 절단 표면 (상단 사진) 아래 40 μm의 (아래 사진)에서 캡처했습니다. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. T 세포는 림프절의 슬라이스 내에 높은 운동성이있는 수 있습니다. 찬란 - 분류 T 세포 위드 현미경을 사용하여 12 분 동안 몇 군데 있었다. 개별 T 세포의 궤도는 파란색 (낮은 운동성이있는 세포) 레드 (높은 운동성이있는 세포)로부터 증가 변위를 나타내는 색으로 트랙으로 표시됩니다. 트랙 Imaris 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 점선 타원은 putative B 세포 영역을 delimits 반면 &#39;화이트 라인은 노드의 가장자리를 따릅니다. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 림프절의 슬라이스 내에 T 세포 속도는 10 μm의 / 분 가까운 거리에 있습니다. 속도는 그림 3에 나타나 트랙에서 Imaris 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.

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	<li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li><li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL21+mediates+CD4++T-cell+costimulation+via+a+DOCK2/Rac-dependent+pathway.">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 도입 T 세포의 동작을 조사하는 데 사용되는 림프절의 조각을 생성하는 간단한, 빠르고 강력한 기술을 설명합니다. 최근에는이 방법이 성공적으로 T 세포의 위치와 운동성 1.5을 제어하는 세포 요소를 식별 thymic 및 림프절의 조각을 사용하여 적용되었습니다. 또한 긍정적인 선택을하는 동안 및 항원 인식 2,6에 따라 T 세포 thymocytes에서 칼슘 2 + 반응을 측정하는 데 사용되었습니다. 오버레이 슬라이스 분석은 장점과 논의가 될 자격 제한을 선물한다. 한 요구가 셀 마이 그 레이션의 분자 제어 방해하기 위해 pharmacologically 조각을 조작하는 경우의,이 시스템은 유용 조직에 액세스할 수 있습니다. 이미징 이후에, 조각이 몇 군데있다 구조에 대한 자세한 정보를 수집 immunohistochemistry에 대해 처리할 수 있습니다. 또한, 관찰은 전통적인 위드의 형광 현미경으로 만들 수 있습니다. 해상도 공촛점 또는 두 광자 현미경으로만큼 좋지 않아 그 phototoxicity은 원칙적으로 두 개의 광자 현미경보다 한 광자 더욱 심각한 있지만, 그것은 단순의 이점, 낮은 비용, 더 큰 선택의 여지가 여기 파장의. 손상 림프절의 T 세포의 이미지가 표시 lymphocytes의 정맥 주사가 필요 림프 기관으로 연속적으로 가정되는. 우리가 이전에 1 보여준 바와 같이, 슬라이스 분석은 입양 전달 실험과 완벽하게 호환됩니다. 그러나, 림프절에 집에 T 세포에 필요한 시간의 길이는 시간이지나면서 세포 밖으로 누설하는 경향을 형광 염료의 사용을 복잡하게하실 수 있습니다. 이것은 칼슘 2 + 염색 fura - 2의 경우입니다. 조직에 T 세포의 빠른 채용 (&lt;30 분)으로 슬라이스 분석은 염료를 사용하는 기회를 제공합니다. 마지막으로,이 방법은 여러 사람이 조직에서 T 세포의 기능을 분석할 수있는 큰 장점 살려두고있다. 이 실험 시스템은 또한 염두에 보관해야합니다 한계를 제공합니다. 깔끔히과 관련된 손상이 특히 상처 표면 근처의 조직의 표면 영역에서 T 세포의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 슬라이스 내에서 세포 죽음을 평가하기 위해, 우리는 타협 플라즈마 막과 세포를 관통하는 형광 염료 SYTOX 녹색을 사용했습니다. 우리의 실험은 주로 조직의 표면 지역화된 총 결절 세포의 약 20 %가 찬란이 핵 염색으로 표시라고 밝히지. 분석과 함께 또 다른 잠재적인 우려 chemokines 포함하여 중요한 가용성 요소를 유지하는 조각의 능력입니다. 우리는 T 세포가 슬라이스 내에 좋은 운동성를 표시 이후의 데이터는 이러한 문제에 의해 영향을 받았다고한다는 표시도없고,하지만, 우리는 상처 표면에서 마이크론의 여러 수십에 위치하고 건강한 지역 이미징 T 세포의 중요성을 강조하고 싶습니다. 이것이이 프로토콜에 같은 전통적인 현미경 (위드 필드 또는 공촛점)와 함께 할 수, 반면에, 그것은 림프절 슬라이스 준비가 두 광자 영상은 깊이에 공간적 해상도를 향상시키고 phototoxicity을 줄일 수와 결합 가능성이 높습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> 파인 집게 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 14,142 </td><td></td></tr><tr><td> 30mm 문화 삽입 </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> 완전한 RPMI - 매체 10% 열 inactivated 소태아 혈청 및 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가하여 만든 </td></tr><tr><td> 행크스 &#39;밸런스드 소금 솔루션 (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 겔화 온도 아가로 오스를 입력 VII - A </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> 부틸 Cyanoacrylate 접착제, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> 스테인레스 스틸 와셔, 내부 직경 4mm </td><td> DIY 매장 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 셀 트래커 그린 CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo imaging of t cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes

드문 표현 항원을 감지 주변 림프절을 포함하여 이차 림프​​ 기관에 나이브 T 세포는 지속적으로 트래픽이. 림프절에 T 세포의 마이 그 레이션 chemokines 포함한 세포 화학 두 요소를 포함 복잡한 과정이다. 최근 두 광자 현미경의 사용은 그대로 림프절의 T 세포를 추적하고 다른 세포들과 그들의 행동과 상호 작용을 몇 가지 양적 정보를 추출하는 것은 허용하고 있습니다. 생체내 시스템에 명백한 이점이 있지만,이 방법은 복잡하고 비싼 장비가 필요하며 조직에 제한적으로 액세스할 수 있습니다. murine 림프절 내에서 T 세포의 동작을 분석하기 위해, 우리는 슬라이스 분석 1, 원래 neurobiologists로 설정하고 murine thymus 2 최근 바뀜을 개발했습니다. 이 기법에서는 찬란 라벨이 T 세포는 심하게 준비 림프절 슬라이스 위에 도금입니다. 이 비디오 문서에서는 조직에 T 세포의 현지화 및 마이 그 레이션은 위드 필드와 공촛점 현미경으로 실시간으로 분석됩니다. 생체내에서 두 광자 현미경은 그들의 자연 환경에서 이미지를 T 세포에 대한 효과적인 접근 방식을 제공하며, T 세포의 마이 그 레이션을 기본 메커니즘을 명료하게하다 보완하는 기술.

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Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

이 프로토콜은 림프절의 조각에 소개 이미지 형광 T 세포 수있는 방법을 설명합니다. 이 기술은 전통적인 위드 형광 또는 공촛점 현미경과 T 세포의 마이 그 레이션의 실시간 분석을 수 있습니다.

위드 필드와 공촛점 현미경과 Murine 림프절의 조각에서 T 세포의 생체내 이미징 전

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

ex-vivo-imaging-t-cells-murine-lymph-node-slices-with-widefield

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

16.7K 조회수.  Université Paris Descartes, CNRS (UMR 8104). 이 프로토콜은 림프절의 조각에 소개 이미지 형광 T 세포 수있는 방법을 설명합니다. 이 기술은 전통적인 위드 형광 또는 공촛점 현미경과 T 세포의 마이 그 레이션의 실시간 분석을 수 있습니다.

비디오: Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine 외면적인 림프절 외과

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.