Name: ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1
Uploaded: 2015-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1 at JoVE.com

We thank Peter Staeheli for providing B6.A2G-Mx1 mice and Semra &#214;zcelik for technical advice.
This work was supported by the German Research Foundation through SFB829 and KN536/16, and the K&#246;ln Fortune Program/Faculty of Medicine, University of Cologne.

윤리 문. 희생 동물의 표피 시트의 제조는 Landesamt 대 투르, UMWELT 및 Verbraucherschutz, 노스 린 - 웨스트 팔리 아 (독일)의 가이드의 권고 사항을 엄격히 준수하여 수행됩니다. 이 연구는 LANUV 노르 트라 인 베스트 팔렌 (수 8.84-02.05.20.13.018)에 의해 승인되었다. 악기와 문화 미디어 1. 준비 <ol><li> 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) / 고 포도당 글루타민 디 펩티드, 10 % FCS, 100 IU / ㎖ 페니실린을 함유하고 / ㎖ 스트렙토 마이신 100 μg의이 (이하, 「DMEM」이라 함)에서 상피 시트를 배양. </li><li> 상피 시트의 제조를위한, 심하게 가열 PBS (최대 37 ° C)에서 디스 파제 II에게 분말 (5 ㎎ / ㎖)에 녹인다. 0.22 μm의 필터를 통해 솔루션을 필터링 및 치료에 직접 사용합니다. </li><li> 표피 전체의 준비 (13) 마운트를 들어, 광을 차단 준비0.5 % 분유, 냉수 물고기 피부와 TBS에서 0.5 % 트리톤 X-100에서 0.25 % 젤라틴과 어. 물질 회전 믹서에 실온에서 적어도 2 시간 동안 혼합물을 배양하여 용해하도록 허용합니다. 또한 세척 버퍼로 PBS에 트윈 20 0.2 %를 준비합니다. 고정 용, 3.4 %와 PBS에서 4 % 포름 알데히드를 준비합니다. </li><li> 저온부의 면역 염색을 위해, 5 % 정상 염소 혈청과 0.2 % 트윈 20에서 PBS 버퍼로 차단 제조. 고정 용, PBS에 0.​​5 %의 포름 알데히드를 준비합니다. </li></ol> 쥐 피부에서 표피 시트 2. 준비 <ol><li> 감염 연구를위한 신생아 다시 피부 표피의 준비 <ol><li> 해부 접시에 해고 마우스 (1~3일 출생 후) 놓고 사지를 잘라 몸통에 가까운 꼬리는 전체 몸통으로부터 피부를 효율적으로 제거 할 수. 사지 제거하는 동안, 직경이 가능한 한 작은 상처를 유지하려고. </li><li> 곡선 미세 집게와 몸통을 수정부드럽게 몸통으로부터 피부를 분리하기 위해 뒷면을 따라 꼬리 지느러미에 두개골에서 피부 아래에 무딘 끝이 위를 이동 ND. 백을 따라 피부를 슬릿. </li><li> FACS 분석, 각질 세포 또는 RNA의 준비의 격리, 들어 몸통을 밀어 조직과 뭉툭한 팁 가위를 해결하기 위해 집게를 사용하여 몸통에서 완벽한 피부를 벗겨. 저온부 또는 전체 마운트의 준비를 위해 다시 피부의 조각을. </li><li> 약 10 × 10mm의 1-2 조각으로 메스와 함께 다시 피부를 잘라. ~ 1 ml의 멸균 PBS로 6 웰 플레이트 잘 하나에 조각을 넣어. 피부면이 바닥을 향하도록해야합니다. </li><li> 1.5 ml의 디스 파제 II (5 ㎎ / ㎖ PBS)에 의해 PBS를 교체하고 4 ° C에서 / 30 (전체 마운트에 대한) 37 ° C에서 분 또는 O 중 하나는 N 품어. PBS로 3 회 반복한다. 부드럽게 표피를 들어 올릴 기본 진피와 다른 집게를 해결하기 위해 하나의 집게를 사용하여 그대로 시트로 표피를 제거합니다. 이 단계 EAS를 만들기 위해 쌍안경을 사용하여Y. 아래쪽으로는 기초면 DMEM에 표피 시트를 전송합니다. 감염 실험에 즉시 시트를 사용합니다. 주 : 주로 FACS 분석, 각질 세포 또는 RNA의 제조를 위해 절연 신생아 피부 표피의 제제를 사용한다. 때문에 그 취약성의, 저온부 또는 전체 마운트에 대한 감염 시트의 준비는 덜 적합하다. </li></ol></li><li> 감염 연구를위한 성인 꼬리 피부에서 표피의 준비 <ol><li> 자궁 전위에 의해 1~3개월 세의 나이에 쥐를 안락사. 뒷면에 긴 포함 된 모낭이 손상 표피 시트의 분리를 방해하기 때문에 대신 다시 피부의 꼬리를 가져 가라. 희생 생쥐의 꼬리를 잘라 메스와 길이를 슬릿. </li><li> 뼈에서 피부를 벗겨 약 5 × 5mm의 조각으로 메스로 들어온다. 잘 하나에서 4 개까지 넣고 2.1.5에서 설명한대로 디스 파제 II에서 배양 진행 참고 : 사용 성인 타이L 피부 저온부 또는 전체 마운트를 제조 하였다. 또한 즉시 사용에, 꼬리는 저장 또는 중요한 감염 효율을 잃지 않고 4 ℃에서 약 24 시간 동안 전송 될 수있다. 꼬리가 48 시간으로 유지하는 경우, 표피 시트는 거의 HSV-1에 감염되지 않을 수 있습니다. </li></ol></li><li> FACS 분석을위한 표피의 해리 주 : FACS 분석에 의해 표면 단백질의 발현의 검출은 세포 표면 및 관심 단백질을 손상하지 않는 적절한 세포 분리 기술을 필요로한다. <ol><li> RT에서 15 분 동안 1.5 ㎖ / 웰 재조합 트립신 계 세포 해리 용액에 37 ℃에서 15 분 동안 기부 쪽과 6 웰 플레이트에서 태어난 표피 시트를 배양한다. </li><li> 3 ml의 DMEM을 추가하여 부화를 중지합니다. 각질 용해 얻을 수 있도록 부드럽게 6 잘 판에 표피를 이동 곡선 미세 집게를 사용하여 각질을 떼어 놓다. 세포 현탁액을 수집하고이 과정을 3 회 반복항상 신선한 DMEM을 사용. 참고 :이 해리 절차는 각질 세포의 표면에 nectin-1을 감지하는 것이 적절하다. </li><li> 대안 적으로, RT에서 15 분, 37 ° C에서 15 분 동안 효소를 무 세포 해리 용액에 표피 시트 (CDS)를 배양한다. 부드럽게 위아래로 CD를 피펫 팅하여 각질을 플러시 실온에서 또 다른 15 분을 품어. </li><li> 세포 현탁액을 수집하고 신선한 DMEM을 사용하여 세척 단계를 3 회 반복한다. 참고 :이 해리는 HVEM의 표면 발현을 감지하기에 적합합니다. CDS 용액의 단점은 더 적은 세포가 재조합 트립신 계 세포 해리 용액보다 해리된다는 점이다. 또한 재조합 트립신 계 세포 해리 용액 감염된 상피 시트의 해리 후에 발현 등 ICP0 식 핵 또는 세포질 발현을 FACS로 분석 될 수있다 표면. </li></ol></li><li> 표피의 해리는 각질이나 전직을 분리요로 RNA <ol><li> 1.5 ㎖ / 웰 재조합 트립신 계 세포 해리 용액을 포함하는 접시의 바닥쪽으로 기부 쪽과 6 웰 플레이트에서 태어난 표피 시트를 넣는다. 실온에서 30 분 동안 품어. 3 ml의 DMEM을 추가하고 부드럽게 접시에 표피를 이동 곡선 미세 집게를 사용하여 각질을 떼어 놓다. </li><li> 세포 현탁액을 수집하고 신선한 DMEM을 사용하여이 단계를 3 회 반복한다. RNA 또는 문화 차 쥐의 각질 세포에 압축을 풉니이 세포 현탁액을 사용합니다. </li></ol></li></ol> HSV-1과 표피 시트 3. 감염 <ol><li> 500 ㎕의 DMEM 이상에서 HSV-1 중량 균주 17 (11)의 용액을 제조하고 표피 시트 플로팅되는 바이러스 용액으로 교환 매체. 이 시점은 0~12 시간으로 정의한다. 37 ℃에서 24 웰 플레이트의 한 웰에 표피 시트의 감염을 수행한다. 바이러스 역가의 계산은 추정 된 개수에 기초표피 시트 당 기저층에서 세포의 (약 5 × 5mm 시트 당 2 × 10 5 세포). </li><li> HSV-1에서 약 100 플라크 형성 단위 (PFU) / 세포로 감염 1 시간 PI DMEM에 의해 바이러스 함유 배지를 대체 주 : 신생아 피부의 표피 시트의 경우, 시트 배양 동안 해리 시작 있음을 알아 두셔야합니다. </li></ol> 감염된 세포 4. 시각화 <ol><li> 표피 전체 마운트 (13) <ol><li> 3.4 %의 포름 알데히드 중 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 2 시간 동안과 표피 시트를 고정합니다. PBS로 두 번 세척하고 0.5 % 분유, 냉수 물고기 피부와 RT (14)에서 1 시간 동안 TBS에서 0.5 % 트리톤 X-100에서 0.25 % 젤라틴으로 차단합니다. </li><li> 15 실온에서 버퍼를 차단에서 1:60으로 희석 마우스 항 - ICP0 (단클론 항체 11060)와 시트 O / N을 품어. 중간 필라멘트 네트워크 시각화 토끼 폴리 클로 날 항 - 부화 동시에마우스 케라틴 14 (NG 100 / ㎖). </li><li> 실온에서 4 시간 동안 PBS-0.2 % 트윈 20으로 4 ~ 5 회 반복한다. O / N이 함께 AF488 - 공액 안티 - 마우스 IgG (1 μg의 / ㎖), AF555 - 공액 안티 - 토끼 IgG의 (1 μg의 / ㎖) DAPI (4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌) (100 NG 부화 RT에서 블로킹 완충액에서 / ㎖). </li><li> 실온에서 4 시간 동안 PBS-0.2 % 트윈 20 씻으십시오. 표본 슬라이드의 상단에 자신의 기저면 산의 표피 시트, 형광등 설치 매체에 포함 된 커버와 커버. </li></ol></li><li> 표피 저온부 <ol><li> 성인 상피 시트를 실온에서 20 분 동안 PBS 중의 4 % 포름 알데히드로 고정하고 PBS로 2 회 세척 하였다. 조직에 포함 된 고정 시트는 액체 질소 중간 동결 동결. cryomicrotome으로 8 ~ 10 μm의 섹션을 잘라. </li><li> 실온에서 10 분 동안 PBS 0.5 %의 포름 알데히드 다시 부분 수정 PBS, 실온에서 30 분 동안 PBS에 5 % 정상 염소 혈청과 0.2 % 트윈 20 블록을 2 회 반복 한 다음 M 60 분간 얼룩안티 ICP0 (모노클로 날 항체 11,060) (15)가 차단 완충액으로 3 회 세척 한 후, 블로킹 완충액에서 1:60으로 희석을 여러개. </li><li> 이어서 실온에서 45 분 동안 블로킹 완충액에서 AF488 - 공액 안티 - 마우스 IgG (1 μg의 / mL) 및 DAPI (100 NG / ml)로 배양하고 3 회 반복한다. 형광 장착 매체 섹션을 포함하고 커버 슬립 커버. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

When epidermal sheets of adult skin from C57BL/6 are infected with HSV-1 at approximately 100 PFU/cell, we observe infection in nearly all cells of the basal layer in the interfollicular epidermis while lower virus doses correlate with less infected cells and a slower progress of infection. In general, hair follicles show a variable number of infected cells; while most of the rather small keratinocytes lining the developing hair follicles are infected, only the hair germ of the adult hair follicle is completely infected....

단순 포진 바이러스 (HSV)는 생명을 위협하는 감염에 약한 단순한 피부 점막 병변에서 인간의 질병의 범위가 발생할 수 있습니다. HSV 1 형 (HSV-1)이 지배적 가능성 생식기 감염 1 원인 HSV 2 형 (HSV-2), 반면, 구강 안면 뇌염 감염과 관련된다. HSV는, 문화에서 셀을 입력 감염을 시작하고 바이러스 자손을 생산하는 방법의 이해에 상당한 진전이있는 동안, 우리는 세포 수준 2에서 조직에 바이러스 침입 경로 (들)에 대해 거의 알고있다. HSV 피부 또는 점막 감염 마우스의 연구를 들어, 토끼, 기니아 피그 동물 모델로서 사용되어왔다. 피부 감염은 피내 주사 또는 바이러스의 존재에 의해 피부를 긁 확립시키고, 질병 발달은 바이러스 생산과 관련이 있었다. 이러한 방법은 질병 발병의 다양한 측면을 이해하는 데 도움이, 그리고 항 바이러스 약물을 평가하는 데 사용됩니다. tissu에서 HSV 감염을 연구하는E 수준은, 인간의 피부의 Organotypic 모델이 적용되어왔다. 감염률은 이들 뗏목 배양 제한되는 바와 같이, 감염, 바이러스 확산을 조사하는 연구와 항 바이러스 성분의 효과의 제한된 수는 3-6 발표되었다. 그대로 상피에서 HSV-1 감염 기간 동안 역할을 휴대 결정기를 특성화하기 위해, 우리는 뮤린 표피 (7)의 생체 감염 연구를위한 프로토콜을 확립. 신생아 피부 또는 성체 마우스의 꼬리로부터 제조 하였다. HSV-1 바이러스 함유 배지에서 침수 된 완벽한 피부 샘플을, 감염 없었기 때문에, 우리는 디스 파제 II 처리에 의해 진피에서 표피를 분리. 바이러스 - 함유 배지에서 표피 시트 부동 후 감염된 세포를 다양한 시간의 postinfection (PI) (7)에서 기저 표피 층으로 시각화 될 수있다. 바이러스 복제에 앞서 각 셀 감염의 개시를 시각화ND 바이러스 생산, 우리는 HSV-1 감염 기간 동안 발현되는 첫 단백질이다 감염된 세포 단백질 0 (ICP0)에 대한 항체로 염색. ICP0의 세포 현지화는 초기 감염시 가지 단계를 통과한다. ICP0는 바이러스 유전자 발현의 초기 단계에서의 핵 병소에 존재하지만, 세포질로의 ICP0 relocalization 감염 (8)의 후속 단계를 나타낸다. 우리는 감염 동안 다양한 세포 인자의 역할 가능성을 테스트하기 위해 다른 마우스 모델에서 상피 시트의 생체 감염 분석을 사용 하였다. 굴지 역학의 핵심 레귤레이터로 RAC1의 영향을 해결하기 위해, 우리는 RAC1 유전자 (9)의 각질 세포 고유의 삭제와 쥐의 표피를 감염. 이 모델은 표피의 각질 층에서 HSV-1 감염의 효율성에 결함이 RAC1의 결과를 연구하기 위해 우리를 허용했다. 다시 제어 한배 새끼의 감염 표피에 비교RAC1의 부재 (7)의 표피 기저층 감염의 개시에 아무런 영향을 미치지 않았다 나타내는 큰 차이를 vealed 없다. 상기 마우스 모델의 사용은 우리가 세포 수용체는 표피 진입을 중재 할 수있는 해결. HSV-1 nectin -1- HVEM 또는 - 결핍 마우스에서 표피 중 시트 감염은 조직으로 진입 초기 바이러스 강하게 nectin-1 (10)의 존재에 의존한다는 것을 밝혔다. 또한, 우리의 결과는 HVEM 또한 nectin-1 (10)보다 덜 효율적 있지만, 쥐의 표피에있는 수용체 역할을 할 수 있음을 보여줍니다. 표피 층에 감염된 세포의 공간 분포를 해결하기 위해, 우리는 조직 절편, 표피 및 전체 마운트 (도 1)의 발현을 ICP0 시각화. 전체 피부의 저온부에서 더 ICP0 발현 세포는 (그림 1) 검출되지 않습니다. 대조적으로, 상피 시트의 저온부가 세포질을 보여이미 3 시간 PI (그림 1)에서 기저층에서 ICP0 식입니다. 나중에 시간에, 바이러스가 가시화 될 수있다 층을 suprabasal 확산. 기저층에 감염된 세포의 공간 분포를 용이하게 표피 전체 마운트 (도 1)에 따라 될 수있다. HSV-1 100 PFU / 셀에 감염되면, interfollicular 표피의 기저 각질 세포의 약 50 %는 대부분의 감염된 세포 핵 ICP0을 표현하는이 시점에서 1.5 시간 파이에서 ICP0 식을 보여줍니다. 초기 유전자 발현의 후기 단계를 나타내는 세포질 ICP0의 relocalization 3 열연 PI (도 1)의 거의 모든 세포에 존재한다. 생체 HSV-1 감염에 감염된 세포를 시각화의이 모드는 억제제 또는 조직에서 바이러스 성 항목 및 확산에 / 삭제 돌연변이 세포 성분의 효과를 연구 할 수있는 강력한 분석을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/high glucose/GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>31966047</td><td>needed for cultivation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>dispase II powder</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>has to be solved in heated PBS</td></tr><tr><td>enzyme-free cell dissociation solution</td><td>Sigma</td><td>C5914</td><td>needed for very gentle dissociation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>TrypLE select cell dissociation solution</td><td>Life Technologies</td><td>12563-029</td><td>needed for dissociation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>chelex 100 resin</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td>needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum</td></tr><tr><td>gelatin from cold water fish skin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>needed for minimization of non-specific antibody binding</td></tr><tr><td>Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td>used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td>used as secondary antibodies</td></tr><tr><td>Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>A-21429</td><td>used as secondary antibodies</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (conc.: 0.1 mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>36670</td><td>used to counterstain the nucleus</td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1

그 인간 숙주를 입력, 단순 헤르페스 바이러스 1 형 (HSV-1) 점막 표면, 피부 또는 각막의 장벽을 극복해야한다. HSV-1 대상은 초기 진입시 각화 및 신경 세포의 잠재 감염 뒤에 상피에 차 감염을 설정합니다. 재 활성화 한 후, 바이러스는 피부 소포 또는 점막 궤양으로 표시 피부 점막 부위에서 분명하게 할 수 있습니다. HSV-1은 피부 나 점막을 침범하고 도달 방법의 수용체는 제대로 이해된다. 세포 수준에서 표피 조직에 HSV-1의 침입 경로를 조사하기 위해, 우리는 피부의 기본 및 재발 성 감염 부위를 나타내는 쥐의 표피의 생체 감염 모델을 설립했다. 분석은 쥐의 피부의 준비를 포함한다. 표피는 디스 파제 II 처리하여 진피로부터 분리된다. 바이러스 - 함유 배지에서 상피 시트를 플로팅 한 후, 조직은 고정이고 감염에 의해 여러 번 postinfection에서 시각화 될 수있는HSV-1 즉각적인 초기 ICP0 단백질에 대한 항체로 감염된 세포를 염색. ICP0는 발현 세포 것은 1.5 열연 postinfection 이미 기저 각질 세포 층에서 관찰 될 수있다. 더 이상 감염 시간으로, 감염된 세포는 감염이 기초 각질 세포로 제한하지만, 바이러스가 조직에서 다른 층으로 확산되어 있지 않은 것을 나타내는, suprabasal 층에서 발견된다. 다양한 마우스 모델의 표피 시트를 사용하면, 감염 프로토콜은 조직으로 HSV-1 침입에 기여 세포 성분의 참여를 결정하는 허용한다. 또한, 분석은 초기 진입 단계에 지장 조직 억제제, 세포 간 확산 및 바이러스 생산을 테스트하기에 적합하다. 여기, 우리는 세부 사항에 생체 감염 프로토콜을 설명하고 nectin-1 또는 HVEM 결핍 마우스를 사용하여 우리의 결과를 제시한다.

The challenge of the method is to prepare epidermal sheets into which HSV-1 can penetrate from the basal layer. The critical step is the separation of the epidermis from the dermis by dispase II treatment, which, depending on the mouse strain, needs to be adapted. The concentration of dispase II can range from 2.5 to 5 mg/ml, and the time of incubation from 20 to 45 min. The staining of the intermediate filament protein keratin 14 readily allows predicting whether the basal epidermal layer can be infected or whether it w...

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Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

11.1K 조회수.  University of Cologne. The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

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Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

위드 필드와 공촛점 현미경과 Murine 림프절의 조각에서 T 세포의 생체내 이미징 전

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

연구

면역학 및 감염병학

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

마우스의 재발 포진 성 각막염 Stromal, 인간 HSK 유학을위한 모델

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

급성 상피 헤르페스의 예 VIVO Organotypic 각막 모델은 바이러스 종류 나 감염을 단순

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

신경과학

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

siRNA 전기 포진 포진 심플렉스 바이러스 유형 1-감염 단핵구 파생 수지상 세포에서 자가 포식을 조절

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a seroprevalence that ranges from 60-90% worldwide, the Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) commonly causes mucocutaneous lesions of the orofacial region which also manifest as lesions and infection-associated blindness. While current antiviral drugs are effective, emergence of resistance and persistence of toxic side-effects necessitates development of novel antivirals against this ubiquitous pathogen. Although in vitro assessment provides some functional data regarding an emerging antiviral, they do not demonstrate the complexity of ocular tissue in vivo. However, in vivo studies are expensive and require trained personnel, especially when working with viral agents. Hence ex vivo models are efficient yet inexpensive steps for antiviral testing. Here we discuss a protocol to study infection by HSV-1 using porcine corneas ex vivo and a method to treat them topically using existing and novel antiviral drugs. We also demonstrate the method to perform a plaque assay using HSV-1. The methods detailed may be used to conduct similar experiments to study infections that resemble the HSV-1 pathogen.

We describe the use of a porcine cornea to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

포신 각막 조직 은 포진 심플렉스 바이러스-1 항 바이러스의 효능을 연구하기 위해 퇴치

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

단순 포진 바이러스의 플라쿼싱

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

siRNA-Based Inhibition of Autophagy in Herpes Simplex Virus-Infected Immature Dendritic Cells

Source: D&#252;thorn, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60190">siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a small interfering RNA (siRNA)-based technique to interfere with autophagic flux. A siRNA targeting FIP200 mRNA is introduced into monocyte-derived immature dendritic cells (iDCs) using electroporation, causing the knockdown of FIP200 expression and leading to the inhibition of nuclear lamin disruption via autophagy. Upon adding herpes simplex virus (HSV), the nuclear egress of viral progeny is inhibited due to the absence of lamin disruption via autophagic flux.

단순 포진 바이러스에 감염된 미성숙 수지상 세포에서 자가포식의 siRNA 기반 억제

Monocyte-derived DCs were generated from leukapheresis products of healthy donors. For this, a positive vote from the local ethics committee has been ...