저자는 박사 제임스 (Zhijian)을 감사드립니다 Mavs 등의 필수 시약, 제공 첸 (UT 남서, 분자 생물학) - / - 마우스, 박사 르네 토 (캘리포니아 로스 앤젤레스 대학, 약학 및 분자 의학 )이 유학 γHV68의 세균 인공 염색체를 제공.

1. γHV68와 마우스 감염 <ol><li> 로 6 년 8 주 오래된, 성별 일치 littermate 마우스 (8-12 마우스 / 그룹)은 바이러스 감염에 사용됩니다. 쥐가 선적 후 사 전체 일 (96 시간) 이상 순응 할 수 있습니다. </li><li> 바이러스를 사용하여 프로토콜 단계는 표준 BSL2주의를 사용하여 바이오 안전성 수준 2 (BSL2)의 캐비닛에서 수행해야합니다. </li><li> 단지 실험하기 전에 마우스를 당 멸균 PBS의 30 μl에 γHV68의 (40 1 개 10 5 상패 - 성형 장치 [PFU는]) 바이러스 정지를 준비합니다. 얼음 바이러스 정지세요. </li><li> 마우스 진정 작용을 위해 케타민 / xylazine 솔루션을 (1.5 MG의 케타민과 0.15 MG xylazine/20 g의 체중, 100 μl / 마우스) 준비합니다. 쥐가 발가락 핀치를 수행하여 회복 될했는지 확인합니다. </li><li> 1.5 MG의 케타민 및 내부 - 복막 주입 20 MG의 체중 (100 μl / 마우스) 당 0.15 밀리그램의 xylazine으로 마취 마우스. </li><li> 드롭 현명한에 intranasally 바이러스 정지 (30 μl / 마우스)를 제공진정제를 마우스 중 하나가 콧 구멍에 패션. </li><li> 5 한쪽에 마우스를 놓는다 - 10 분 폐에 바이러스의기도 전달을 촉진 할 수 있습니다. </li><li> 다시 케이지와 모니터 마우스에서 개최 마우스가 완전히 진정 작용에서 복구 할 때까지. </li><li> 다양한 일 후 감염에서 CO 2 질식과 사망 / 깊은 의식의 손실을 보장 후 수확 폐를하여 마우스를 희생. 장소 폐 1.0 mm의 지르코니아 / 실리카 구슬 500 μl를 포함하는 멸균 1.5 ML 나사 덮힌 튜브에. 얼음에 튜브세요. 스토어 샘플 -80 ° C에서 같은 날에 다음 단계로 진행하지 않을 경우. 비장 또는 간 조직은 실험 기간에 따라 바이러스 대기 시간의 분석을 위해이 시간에 수집 될 수 있습니다. </li><li> 관에 추위 혈청이없는 DMEM의 1 ML을 추가하고 구슬 - 심장이 두근 두근 30초하여 폐를 균질화. 최소 1 분 동안 얼음에 튜브를 죽일거야. 한 번이 과정을 반복합니다. </li><li> 원심 분리기의 폐는 1 분에 대해 4 ° C에서 16,000 rcf에 lysates과 supern를 사용하여NIH3T3 또는 BHK21 monolayer를 (자세한 내용은 섹션 5를 참조)를 사용하여 상패 분석​​하여 바이러스 titer를 확인할 수 atant. </li></ol> 2. 마우스 배아 섬유 아세포에서 γHV68 여러 단계 성장 속도론을 결정 <ol><li> 야생 타입 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs) 및 도금 세포하기 전에 하위 합류 (약 80 %) 밀도 호스트 유전자의 결함 사람들을 성장. </li><li> 10000 세포에서 24 잘 판에 MEFs 분할 / 잘 감염 전날에 (나 역시) multipilicity 수준의 감염 낮은하십시오. 실험은 보통 0.001 사이에 triplicates과 - 나에서 수행됩니다 - 0.05은 일반적으로 사용됩니다. </li><li> 바이러스의 원하는 금액 (0.5 ML 당 잘)를 포함 γHV68 정지를 준비합니다. </li><li> 미디어를 제거하고 잘 당 γHV68 정지의 0.5 ML로 MEFs을 다룹니다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터, 바위마다 30 분에 금속판을 배양하고, 배양은 2시에 진행 할 수 있습니다. </li><li> 바이러스 정지를 제거하고, 0.5 ML 신선한 C와 세포를 포함omplete DMEM 매체은 8 % 태아 소 혈청을 포함. </li><li> 다양한 일 후 감염에서 멸균 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 매체와 세포를 수확. 즉시 -80에서 튜브를 고정 ° C. </li><li> -80에서 냉동 MEFs에서 출시 γHV68 ° C, 37 ° C에서 해동 물 욕조, vortexing. 동결 융해의 세 가지 사이클은 보통 샘플에 적용됩니다. </li><li> NIH3T3 또는 BHK21 monolayer를 (자세한 내용은 섹션 5를 참조)를 사용하여 상패 분석​​하여 바이러스 titer를 결정합니다. </li><li> 바이러스 titer 및 MEFs에 플롯 γHV68 여러 단계 성장 곡선을 참조하십시오. </li></ol> 3. 마우스 배아 섬유 아세포에서 γHV68 lytic 복제 분자 해부 <ol><li> 제 2의 2.6 단계 2.1에 설명 된대로 바이러스 감염을 수행합니다. </li><li> 다양한 일 후 감염에서, 표면에 뜨는 폐기하십시오. 차가운 PBS와 trypsinize 세포와 세포를 씻어. 1 분 동안 실온에서 1000 rcf에서 원심 분리기에 의한 펠릿 세포. 표면에 뜨는을 취소하고-80에서 매장 세포 ° C. </li><li> 이전에 다음 ID로 출판 방법 5,6에 따라 총 DNA (호스트 및 바이러스 게놈)과 총 RNA를 추출합니다. </li><li> 총 DNA와 같은 RTA (ORF50), ORF57 및 ORF60 등의 바이러스 lytic 성적에 대한 특정 프리 머를 사용하여 실시간 PCR을 수행합니다. 호스트 하우스 키핑 유전자 (예 : β-고를)에 대한 언급 세포 γHV68 게놈의 상대적인 양을 결정합니다. </li><li> 게놈 DNA 오염을 제거하려면 RNase 무료 DNase 치료는 총 RNA와 oligo (DT) 11-19 프라이머로 cDNA 준비 중요합니다. RNase 무료 DNase 및 RT-PCR 치료를 포함하여 RNA 추출에 대한 자세한 내용은 5 참조를 참조하십시오. 호스트 하우스 키핑 유전자의에 대한 언급 바이러스 성적의 상대적 양을 결정하기 위해 위와 같이 cDNA와 프리 머를 사용 실시간 PCR을 수행합니다. </li></ol> 4. 재조합 γHV68 사용 박테리아 인공 염색체를 생성 method는 호스트 바이러스 상호 작용에 관여하는 유전자에 변이 γHV68을 소개하는 데 사용됩니다 여기에 설명. <ol><li> 야생 형 시퀀스 또는 PCR에 의한 중앙 지역에 원하는 돌연변이를 들고 시퀀스의 DNA 조각을 (1.5 KB) 준비합니다. </li><li> 특히 MIDI 규모의 정화 (OriGene)에 의한 관심의 유전자 유전자를 inactivates 돌연변이 사이트 주위에 transposon 삽입 7이 포함되어 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 준비합니다. 4 번 스토어 BAC DNA ° C (BAC DNA의 해동 / 냉동하지 않도록해야합니다.) </li><li> Transfect BAC DNA와 PCR 제품은 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)로, γHV68 lytic 복제에 매우 허용 아르 세포 (예를 들어, NIH3T3 또는 BHK21)로 관심있는 유전자의 변이를 포함하는 원하는. </li><li> cytopathic 효과 (CPE)은 monolayer에 표시 될 때까지 분할 세포세요. 바이러스가 포함 된 표면에 뜨는를 수집하고, 필요한 경우, NIH3T3 또는 BHK21 세포에 바이러스를 증폭. </li><li> 와 NIH3T3 세포를 감염1800 rpm으로 원심 분리하여 재조합 바이러스, 30 분 30 ° C. </li><li> 수확 γHV68에 감염된 NIH3T3 세포와 Hirt의 프로토콜 8,9을 사용하여 circularized 바이러스 게놈을 준비합니다. </li><li> chloramphenicol에 대한 저항 (CM)하지만, kanamycin (관) (칸 방지 유전자가 transposon에있는 동안 CM 방지 유전자가, BAC 백본에에 민감 식민지에 대한 electroporation과 화면에 전기 MAX DH10B 관할 세포 (Invitrogen)을 변환 삽입). </li><li> 중간 포함 chlorophenicol에 CM R 관 S 식민지를 성장 및 미니 또는 MIDI 규모의 정화 (OriGene)와 BAC DNA를 준비합니다. </li><li> 돌연변이 사이트의 지역 측면을 노릴하고, 순서에 맞는 프리 머를 사용하여 PCR하여 대상 유전자에서 원하는 돌연변이를 확인합니다. </li><li> 선택한 제한 효소 및 펄스 - 필드 겔 전기 영동과 소화의 BAC에 염색체 다시 정리하기를 확인하지 않습니다. </li><li> Lipofectamine와 NIH 3T3 또는 BHK21 세포에 재조합 BAC를 Transfect2000 (Invitrogen)은 재조합 γHV68를 준비합니다. </li><li> CPE는 monolayer에 표시 될 때까지 전지를 passaging하세요. 바이러스가 포함 된 표면에 뜨는를 수집하고 NIH3T3 또는 BHK21 세포에 재조합 γHV68을 증폭. </li><li> 재조합 바이러스의 titer를 결정하고 같은 섹션 1과 2에 설명 된 바이러스의 성장 특성 예를 생체 및 생체 내을 특성화한다. </li></ol> 5. 상패 분석​​하여 바이러스 titer를 결정 <ol><li> 도금 세포하기 전에 하위 합류 (약 80 %) 밀도로 NIH3T3 세포를 성장. </li><li> 20000 세포에서 / 잘 감염 전날에 24 잘 판에 NIH3T3을 분할. </li><li> DMEM 매체는 8 %의 신생아 송아지 혈청 (NCS)를 포함에 10 배 순차적으로 희석 된 바이러스 supernatants를 준비합니다. </li><li> 미디어를 제거하고 γHV68 정지의 0.5 ML로 NIH3T3 세포를 다룹니다. </li><li> , 조직 문화 인큐베이터에서 판을 길러 매 30 분 락, 그리고 부화 진행 할 수 있습니다2시에. </li><li> 0.5 ML DMEM의 2% NCS를 포함하는 매체 및 0.75 %의 methylcellulose (시그마)과 바이러스 성 중지 및 표지 세포를 제거합니다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 판을 품다. 6 일 후 감염에 액자를 계산합니다. 크리스탈 바이올렛과 ​​함께 예를 들어 monolayer,의 얼룩은 플라크 계산을 용이하게 할 수 있습니다. </li><li> undiluted 조직 lysates에서 바이러스 titer를 계산하는 데, 또는 셀에 다음 수식 사용 lysates : Titer (PFU / ML) = D X N X 1000 μl / ML ÷ V를 μl합니다. N, 적절한 희석에서 상패 번호의 평균, D, 희석 V (μl) (예 : 5, 10 등, 100 .....) 배, 직렬 - 희석 표면​​에 뜨는의 볼륨은 당 잘 추가되었습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : / - - 마우스 10, 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF)에서 γHV68 lytic 복제 phenotypes, 그리고 recombin 세 대표 수치는 야생 유형과 Mavs의 폐에 γHV68 lytic 복제를 포함하여 여기에 표시됩니다개미 γHV68는 MAVS에 의존 IKKβ에 의해​​ 조절되는 인산화 사이트 내에서 변이를 들고. 이 세 corroborating 실험 생체 및 예 생체 내 γHV68 lytic 복제에 타고난 면역 구성 요소의 역할을 정의 할 수있는 체계를 구성합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig1.jpg" /> 그림 1 Mavs + / +와 Mavs의 폐의 γHV68로드 -. / - 마우스. A) 두 가지 타고난 신호는 MAVS의 하류 경로. 결과적으로, 염증성 크린 시토 킨과 interferons의 유전자 발현을 조절 NFκB - 인터페론 규제 요인 (IRFs)를 활성화하기 위해 cytosolic 장비-I와 같은 수용체의 신호 MAVS 어댑터 분자 릴레이. B) Mavs + / +와 Mavs - / - 마우스가 억제 된 지정된 시간 지점에서 40 PFU intranasally γHV68과 폐의 바이러스 부하에 감염되었습니다<html> NIH3T3 monolayer를 사용하여 상패 분석​​에 의해 채굴. 각 기호는 마우스를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig2.jpg" /> 그림 2. 마우스 배아 섬유 아세포의 (MEFs)에 γHV68 lytic 복제 속도론. Mavs에 γHV68의 lytic 복제가 + / +와 Mavs - / - MEFs은 여러 단계 성장 곡선 (A) 및 정량 실시간 PCR (B)에 의해 평가되었다. 두 실험 γHV68의 동등한 MEFs의 번호와 금액은 0.01의 다중성 수준의 감염 (나 역시)에서 바이러스 감염에 사용되었다. (A) 세포와 supernatants는 지정된 시간 지점에서 수확 및 바이러스 titers을 결정하는 상패 분석​​의 대상이되었다. (B) 총 RNA는 γHV68에 감염된 MEFs에서 추출되어 선택된 lytic 성적 (RTA, ORF57 및 ORF60)에 대한 특정 프리 머와 정량 실시간 PCR에 의해 분석되었다. ig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. IKKγ에 의해 인산화를 폐지 RTA의 transactivation 도메인 내에서 재조합 γHV68 들고 변이의 lytic 복제 속도론. (A) Mavs의 다중 단계 성장 재조합 야생 형 바이러스의 커브 (γHV68.wt)와 돌연변이 바이러스 (γHV68.mut) + / +와 Mavs - / - MEFs 세포 (- 나 = 0.01). MEFs는 나 역시 0.01의에서 γHV68에 감염되었습니다. 세포와 supernatants는 지정된 시간 지점에서 수확되었고 바이러스 titers는 NIH 3T3 monolayer를 사용하여 상패 분석​​에 의해 결정됩니다. γHV68에 감염된 NIH3T3 세포 (B) γHV68 RTA의 mRNA 수준 (- 나 = 0.01). 30에서 H는 후 감염, 총 RNA는 γHV68에 감염된 NIH 3T3 세포에서 추출 된 및 정량 실시간 PCR에 의해 분석했다.

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response.">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449, 819-826 (2007).</li><li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection:+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis.">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li><li>Speck, S. H., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+latency+and+its+regulation:+lessons+from+the+gamma-herpesviruses.">Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses.</a> Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).</li><li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication.">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).</li><li>Strauss, W. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+mammalian+tissues.">Preparation of genomic DNA from mammalian tissues.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 2-2 (1998).</li><li>Song, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+viral+genes+essential+for+replication+of+murine+gamma-herpesvirus+68+using+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).</li><li>Hirt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+extraction+of+polyoma+DNA+from+infected+mouse+cell+cultures.">Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures.</a> J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).</li><li>Eva-Maria Borst, E., Crnkovic-Mertens, I., Messerle, M., Zhao, S., Stodolsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+&#946;-herpesvirus+genomes+as+bacterial+artificial+chromosomes.">Cloning of &#946;-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. , 256-256 (2004).</li><li>Sun, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses.">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li><li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MAVS,+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3.">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li><li>Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS-1,+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction.">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li><li>Meylan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus.">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li><li>Xu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling.">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

바이러스 감염에 대응 MAVS에 의존 타고난 면역 신호 경로는 바이러스 염증성 크린 시토 킨 10-14의 생산을 촉진하기 활성화됩니다. 인간의 종양 발생 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus과 엡스타인 - 바 바이러스 3,4의 모델 바이러스로 손쥐 γHV68를 사용하여, 우리는 γHV68 usurps MAVS - IKKβ 경로는 전사 활성화 5를 통해 바이러스 lytic 복제를 홍보 할 것을 발견했습니다. 유전자 변형 MEFs?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> 전기 MAX DH10B 능력 세포 </td><td> Invitrogen </td><td> 18290-015 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> 시그마 </td><td> M0512 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP 플라스미드 Miniprep 시스템 </td><td> OriGene </td><td> NP100004 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP 플라스미드 Midiprep 시스템 </td><td> OriGene </td><td> NP100006 </td></tr></tbody></table>

dissecting host-virus interaction in lytic replication of a model herpesvirus

바이러스 감염에 대한 응답으로, 호스트는 바이러스 시토 킨 생산 1,2로 이어질 타고난 면역 신호 경로를 활성화 등 다양한 방어 반응을 개발하고 있습니다. 호스트를 이식하기 위해서는, 바이러스는 호스트 항 바이러스 반응을 회피하고 신호 경로를 조작 할 고맙게 여기게됩니다. 호스트 바이러스 상호 작용을 이루는 물질은 바이러스 감염에 대한 소설 치료 전략의 개발에 빛을 발산합니다. 손쥐 γHV68은 밀접하게 인간의 종양 발생 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus 및 Epsten - 바 바이러스 3,4에 관한 것입니다. 실험실 쥐 γHV68 감염은 인간 herpesviruses를 사용할 수 없습니다 생체에서 호스트 응답 및 바이러스 감염의 전체 과정을 검토 할 수있는 다루기 쉬운 작은 동물 모델을 제공합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 γHV68 lytic replic에 phenotypic 특성에 대한 방법의 패널 및 호스트 신호 구성 요소의 분자 절개를 제시생체 및 예 생체 내 두 ation. 유전자 변형 마우스 종자의 사용 가능 여부는 생체 내 γHV68 급성 감염시 호스트 신호 경로의 역할의 심문을 할 수 있습니다. 또한 이러한 결함 마우스 종자로부터 격리 마우스 배아 섬유 아세포의 (MEFs는) 추가 γHV68 lytic 복제 예를 생체 동안 이러한 분자의 역할을 해부하는 데 사용할 수 있습니다. virological 및 분자 생물학의 assays 사용하여, 우리는 호스트 바이러스 상호 작용의 분자 메커니즘을 정확히하고 바이러스 lytic 복제에 필수적 호스트 및 바이러스 유전자를 식별 할 수 있습니다. 마지막으로, 세균 인공 염색체 (BAC) 시스템은 특별히 호스트 바이러스 상호 작용을 방해 바이러스 요소 (들)에 변이의 도입을 용이하게한다. 이러한 변이를 들고 재조합 γHV68는 구성 요소를 신호 키 호스트의 결함 MEFs의 γHV68 lytic 복제 phenotypes을 요점을 되풀이하는 데 사용할 수 있습니다.이 프로토콜은 생체 및 예 생체 내 개입의 여러 수준에서 호스트 병원체 상호 작용을 심문 할 수있는 훌륭한 전략을 제공합니다. 최근, 우리는 γHV68 usurps 타고난 면역 신호 경로는 바이러스 lytic 복제 5 증진 것을 발견했습니다. 특히, γHV68 드 노보 감염 면역 키나제 IKKβ를 활성화하고 활성화 IKKβ는 바이러스 전사 활성화를 촉진하기 위해 마스터 바이러스 전사 인자, 복제 및 transactivator (RTA)을 phosphorylates. 그렇게함으로써, γHV68 효율적으로 커플 타고난 면역 활성화를 개최하기위한 전사 활성화함으로써 바이러스 트랜 스크립트 등의 lytic 복제를 촉진. 이 연구는 호스트 바이러스 상호 작용을 조사하기 위해 다른 바이러스에 적용 할 수있는 훌륭한 예를 제공합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus at JoVE.com

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

우리는 모델 herpesvirus, 감마 herpesvirus 68 (γHV68)의 lytic 복제에 호스트 신호 분자의 핵심 역할을 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유전자 변형 마우스 긴장과 γHV68 lytic 복제 배아 섬유 아세포를 활용, 프로토콜 phenotypic 특성화 및 바이러스 lytic 복제에서 바이러스 호스트 상호 작용의 분자 심문을 모두 할 수 있습니다.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

dissecting-host-virus-interaction-lytic-replication-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K 조회수.  UT Southwestern Medical Center. 우리는 모델 herpesvirus, 감마 herpesvirus 68 (γHV68)의 lytic 복제에 호스트 신호 분자의 핵심 역할을 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유전자 변형 마우스 긴장과 γHV68 lytic 복제 배아 섬유 아세포를 활용, 프로토콜 phenotypic 특성화 및 바이러스 lytic 복제에서 바이러스 호스트 상호 작용의 분자 심문을 모두 할 수 있습니다.

비디오: Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

연구

면역학 및 감염병학

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

표현형 높은 처리량 분석<em&gt; 살모넬라 엔테</em&gt; 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis. 
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories. 
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

호흡기 유체의 Equid 헤르페스 바이러스-2 진단에 대한 정량적 PCR 방법의 개발 및 검증

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.