우리의 방법은 종 내대신 종 사이의 게놈 전체 규모에 특성 차이의 유전 기지를 해부 할 수있는 첫 번째 중 하나입니다. 이 기술의 주요 장점은 고처리량, 고해상도 및 널리 적용 가능하다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 영하 80도에서 저장에서 JR507 냉동고 재고 변형을 검색하고 YPD 한천 판에 하나의 식민지로 줄입니다.
2일 간 또는 식민지가 나타날 때까지 섭씨 26도에서 배양하십시오. 그런 다음 JR507의 단일 식민지와 250 밀리리터 유리 플라스크에 액체 YPD의 100 밀리리터를 접종하고 200 RPM에서 24 시간 동안 또는 고정 단계에 도달 할 때까지 섭씨 28도에서 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 문화의 od600을 측정합니다.
신선한 액체 YPD로 하룻밤 문화의 일부를 새로운 1 리터 플라스크에 희석하여 0 점 2의 od600과 500 밀리리터의 부피로 새로운 문화를 만듭니다. 이 과정을 세 번 더 반복하여 모든 새로운 문화권에서 동일한 야간 문화를 사용하여 od600의 0포인트 2의 od600을 사용하여 총 4개의 문화를 만듭니다. 200 RPM에서 흔들면서 6 시간 동안 28도에서 모든 문화를 배양하십시오.
그 후 500밀리리터 배양 중 두 가지를 결합하여 1리터 문화를 만듭니다. 나머지 두 500 밀리리터 문화를 결합하여 두 번째 리터 문화를 만듭니다. 첫째, 각 리터 배양을 플라스틱 원뿔 튜브에 각각 20 50 밀리리터 알리쿼트로 분할하여 총 40개의 튜브를 형성합니다.
20개의 튜브를 따로 두십시오. 잔동 세포를 펠릿3 분 동안 1000 회 G에서 나머지 20 개의 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 버리고, 소용돌이에 의해 멸균 물의 25 밀리리터로 각 펠릿을 다시 중단합니다.
3 분 동안 1000 배 G에서 원심 분리기. 상체를 버리고, 1X Tris-EDTA 제로 포인트 1의 5 밀리리터로 각 펠릿을 소용돌이에 의해 1 개의 몰리튬 아세테이트 버퍼로 재차 질한다. 3 분 동안 1000 배 G에서 원심 분리기.
상체를 버리고, 5 밀리리터 1X Tris-EDTA 제로 포인트 1 몰라 리튬 아세테이트 버퍼로 각 펠릿을 다시 다시 재생하여 소용돌이에 의해. 3 분 동안 1000 배 G에서 원심 분리기. 세포가 원심분리되는 동안 폴리에틸렌 글리콜, 리튬 아세테이트 및 Tris-EDTA 버퍼를 포함하는 용액의 적어도 120 밀리리터를 준비하십시오.
이 솔루션을 얼음 위에 저장합니다. 변혁을 위해 혈장 DNA를 준비하기 위하여는, 먼저 5 분 동안 100섭씨에서 연어 정액 DNA의 4밀리리터를 끓입니다. 그 후, 즉시 5 분 동안 얼음에 냉각.
차가운 연어 정자 DNA의 4 밀리리터와 밀리리터 당 538 나노 그램의 농도에서 pJR487의 20 밀리리터를 혼합. 이 혼합물을 사용할 준비가 될 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 각 세포 펠릿 위에 플라즈마 와 정자 DNA 혼합물의 600 마이크로 리터를 추가합니다.
각 펠릿에 PEG 리튬 아세테이트 TE 혼합물 3밀리리터를 추가합니다. 우리는 위아래로 피펫팅한 다음 소용돌이에 의해 중단됩니다. 10 분 동안 실온에서 튜브를 배양.
그런 다음 각 튜브를 수조에서 섭씨 39도에서 26분 동안 가열하여 몇 분마다 각 튜브를 반전시수 있습니다. 3 분 동안 1000 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 버리고, 소용돌이에 의해 YPD의 10 밀리리터에 각 펠릿을 다시 중단합니다.
그 후, 새로운 유리 플라스크에 모든 20 튜브를 결합합니다. 433포인트 4밀리리터의 액체 YPD를 새로운 1리터 유리 플라스크에 넣습니다. 그런 다음 66 점 6 밀리리터의 세포밀리리터를 플라스크로 옮킨다.
변환된 셀의 전체 볼륨을 사용하려면 이 전달 프로세스를 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 각 새로운 500 밀리리터 배양의 od600을 측정합니다. 200 RPM에서 흔들면서 2 시간 동안 섭씨 28도에서 세 문화를 모두 배양하십시오.
이 후 0 점 5 밀리 리터의 300 마이크로 리터 G418 의 각 플라스크에 밀리 리터 당 300 밀리 리터를 추가 밀리 리터 당 300 마이크로 그램. 플라스크를 섭씨 28도, RPM 200도로 흔들리는 인큐베이터에 반환하십시오. 나머지 20개의 원식 튜브를 통해 이 전체 프로세스를 반복합니다.
이 시점에서, G418추가를 가진 세포의 500 밀리리터를 포함하는 각각 6개의 1리터 플라스크가 있어야 합니다. 약 200 RPM에서 약 200 RPM에서 또는 각 플라스크에서 약 2 점 3의 od600에 도달 할 때까지 6 개의 플라스크를 28도에서 모두 배양하십시오. 그런 다음 6개의 플라스크를 모두 결합하여 단일 문화권을 만듭니다.
이 결합 된 문화를 사용하여 YPD와 G418의 500 밀리리터와 함께 두 개의 새로운 1 리터 플라스크를 제로 포인트 2의 od600으로 접종하십시오. 이 새로운 문화를 하룻밤 사이에 28도에서 200 RPM에서 흔들어 서 약 2 점 2의 od600에 도달할 때까지 배양하십시오. 그 후, 두 문화를 하나의 문화로 결합하고 결합된 문화의 od600을 측정한다.
이 문화의 원심분리기 25 밀리리터는 3분 동안 1000배 G로. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 25 밀리리터에 있는 셀의 총 od600 단위수를 계산합니다. 상체를 버리고 충분한 물에 세포를 다시 일시 중지하여 밀리리터 당 1점 85의 od600을 사용하여 세포 현탁액을 만듭니다.
유리 구슬을 사용하여, 5-FOA가있는 12 개의 크고 사각형 완전한 합성 한천 판에 재중단 된 세포의 1 밀리리터를 접시. 각 플레이트를 섭씨 28도에서 1~2일 동안 또는 잔디가 접시에 형성될 때까지 배양합니다. 다음으로, 작은 멸균 스퀴지를 사용하여 접시의 절반에서 세포를 긁어 내고 35 밀리리터의 멸균 물을 포함하는 튜브로 긁습니다.
나머지 6개의 플레이트에 대해 이 과정을 반복하여 두 개의 튜브의 수중 세포를 생성합니다. 셀 서스펜션을 단일 플라스크에 결합하고 물을 빈 플라스크로 사용하여 서스펜션의 od600을 측정합니다. od600이 밀리리터당 44포인트 4에 도달할 때까지 물을 사용하여 세포 농도를 조절합니다.
다음으로, 셀의 냉동고 주식을 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 영하 80도에 저장합니다. 이 연구에서, S.Cerevisiae와 S.역설은 돌연변이 발생에 전염되는 멸균 하이브리드를 형성하기 위하여 짝짓기됩니다. 각 돌연변이 클론은 한 유전자의 한 유전자가 중단되는 디플로이드 하이브리드인 헤미자고테입니다.
hemizygotes는 고온에서 경쟁하고, DNA는 각 문화에서 고립됩니다. DNA는 어댑터에 쉬르고, 트랜스포슨과 게놈 사이의 접합은 트랜스포슨 특이적 프라이머와 어댑터 별 프라이머로 증폭된다. 앰플리콘에서 대량 시퀀싱 읽기 수를 계산, 인구에서 클론의 적합성을보고.
이 시퀀싱의 결과로 주어진 유전자에 대한 hemizygote 풍부는 두 종류의 헤미지고테스 사이의 두 온도에서 비교 될 수 있습니다. S.Cerevisiae allele만 야생 유형과 기능성, 그리고 클론은 S.Paradoxus 본선에만 의존하는 클론. 이 대표적인 구현에서, 강한 신호는 8개의 하우스키핑 유전자에서 검출됩니다.
각각의 경우, 하이브리드의 S.Cerevisiae 알레에 있는 트랜스포슨 삽입, 고온에서 의 성장. 이 저-si는 S.Paradoxus에서 S.Cerevisiae를 구별하는 열편협 특성의 후보 결정자를 나타냈습니다. 이제 이 실험을 완료했기 때문에 감기나 소금 내성과 같은 다른 특성을 해부할 수 있습니다.
