이 연구는 일부 국립 보건원, 그랜트 R01 EB007594, 국방 유방암 연구 프로그램의학과 제안 BCO74699P7, 그리고 수잔 G. 코멘 재단 교부금에 의해 투자 98,188,972분의 26,152되었습니다.

1. Microendoscope 어셈블리 (그림 1A) 여기에 설명된 고해상도 microendoscope은 어셈블리 및 응용 프로그램의 가능한 여러 형태를 기본 구성으로 간주되어야합니다. 우리는 여기서 자세히 형광등 대비 에이전트로 proflavine와 함께 사용하도록 설계되었습니다 플랫폼의 구현에 대해 설명합니다. Proflavine는 각각 445 nm의와 515 nm의 흡수 피크의 및 방출 파장과 얼룩 밝은 핵입니다. 다른 대비 요원의 사용은 사용자가 적절하게 여기, 배출하고, 이색성 필터를 선택할 수 있어야합니다. 고해상도 microendoscope 몇 가지 요소는 일반적이며, 여러 공급 업체에서 구할 수 있습니다. 예를 들어, optomechanical 위치 구성 요소는 다른 사람들과 Thorlabs, 뉴 포트, Linos에서 사용할 수 있습니다. 소형 CCD 카메라는 포인트 그레이 리서치, Prosilica 및 Retiga를 포함하여 기업에서 사용할 수있는, 카메라 감도는 사용할 형광단의 밝기뿐만 아니라 원하는 프레임 속도의 고려와 함께 선택한다. 하이 파워 발광 다이오드 (LED가) 다른 사람 사이에 Luxeon, 크리어하고, Nichia에서 구할 수 있습니다. 광섬유 번들 스미토모, 후지 쿠라, 그리고 쇼트에서 사용할 수 있습니다. 특정 응용 프로그램에 대한 구성 요소를 선택하는 사용자는, 조도, 카메라 감도, 이득 및 노출 시간을 photobleaching, 형광단 농도 사이의 형광 현미경에 관련된 고유한 관계를 고려해야한다. <ol><li> 7.5의 한 쌍의 형태로, 케이지 막대 &quot;1.5 케이지 막대&quot;6 연결 &quot;긴 막대합니다. 접어 미러 장치 중 하나가 얼굴에 다음 봉을 보자. 0.5 나사&quot;반대로 얼굴로 막대합니다. 구멍을 통해 낮은 두 통해 케이지 막대에 케이지 큐브 슬라이드. 케이지 큐브 (그림 1B)의 측면 얼굴에 2 &quot;봉을 나사. </li><li> SM1 어댑터 C - 마운트를 사용하여 케이지 접시에 카메라를 연결합니다. 0.5 &quot;케이지 막대에있는 새장 판을 확보, 접이식 미러 유닛의 얼굴을 잔뜩. </li><li> 3 &quot;긴 렌즈 튜브로&quot;튜브 &quot;렌즈를 삽입하고 유지 반지와 렌즈를 안전하게. 투영 때 렌즈의 초점 거리는 광섬유 번들의 코어가 적어도 두 개의 픽셀 샘플되는 등 선택해야합니다 카메라에. 필터 제조 업체로 표시. 측면에 렌즈 튜브를 스크류 첫 유지 반지의 상단에있는 튜브에 방출 필터를 드롭하고, 장소에 필터를 보호하는 또 다른 반지를 추가합니다. 필터 방향 대회를 관찰 케이지 큐브 CCD 카메라에 가까운. 그림 1C,이 렌즈와 필터의 지혜로움에 대해 3 &quot;렌즈 튜브없이 표시됩니다. </li><li> 컴퓨터에 카메라를 연결하고 화면에 이미지를 볼 수 있습니다. 먼 물체에서 케이지 어셈블리를 직접하고 이미지가 초점이 나타날 때까지 레일 따라 케이지 큐브를 슬라이드. 이 위치에있는 케이지 큐브를 닫으세요. (이것은 무한 - 정정 목적 렌즈와 결합되면 튜브 렌즈가 초점을 맞춘 이미지를 형성 있도록 한 간단한 방법입니다.) </li><li> 케이지 큐브에서 45 °에있는 홀더와 장소에 이색성 거울을 넣습니다. </li><li> 튜브 렌즈 홀더 반대 케이지 큐브의 얼​​굴에, SM1 스레드 어댑터에 RMS 및 조정 렌즈 튜브를 통해 객관적인 렌즈를 나사. Z - 번역자가 쉽게 초점을위한 조정 렌즈 튜브 대신에 사용할 수 있습니다. 케이지 접시에 SMA 커넥터 나사 약 목적 렌즈의 작동 거리에서 막대에 이것을 탑재합니다. </li><li> 마운트 2의 끝 부분에 케이지 플레이트와 슬라이드에 LED &#39;봉. 0.5 렌즈 추가 &quot;이 튜브는 케이지 큐브의 측면에 실수를하면 그것이 LED의 이미지를 형성 이러한 렌즈 튜브 그 목적 렌즈의 조리개를 다시 채웁니다. 이 (콜러 조명) 구성은 광섬유 번들의 근위 얼굴이 균일하게 조명 있는지 확인합니다. 0.5 &quot;렌즈 관으로 여기 필터를 추가하고 유지 반지 (그림 1C)와 장소에서 보안. </li><li> 광섬유 번들에 SMA 커넥터를 연결합니다. 케이지 막대에 장착된 SMA의 콘센트에 SMA connectorized 번들 보자. 광대역 광원 (형광등 조명이 충분)으로 번들의 말초 끝을 직접 CCD 카메라에 번들 근위 얼굴의 이미지를 관찰합니다. 섬유 번들 이미지가 초점이 나타날 때까지 케이지 큐브의에서 떨어지거나 밖으로 목적 렌즈의 위치를​​ 조정합니다. 개별 코어 (그림 2) 명확하게 표시해야합니다. </li></ol> 2. 미소 렌즈 조립 microendoscope의 공간적 해상도는 섬유 번들의 말초 팁로 마이크로 렌즈 또는 렌즈 어셈블리를 부착 증가 수 있습니다. 이러한 광학되므로 빛을 - GUID에 의해 부과된 공간적 샘플링 주파수를 증가하는 대신 직접 조직에 번들 팁을 배치의 팁이 demagnification로 조직 표면에 몇 군데는 그러한 구성섬유 번들의 주입 코어. demagnification의 정도 뷰 필드에 비례 감소에 공간적 해상도에서 동시에 증가에 해당합니다. 그라데이션 지수 (미소) 렌즈 구성 요소는 섬유 - 광학과 호환되며 다른 사람들과 GrinTech, NSG, 쇼트에서 사용할 수 있으며, 직접 섬유 번들의 말초 팁에 접착 수 있습니다. <ol><li> 응용 프로그램의 원하는 배율과 작동 거리와 함께 미소 렌즈를 선택합니다. 렌즈의 직경은 당신이 작업 계획 광섬유 번들의를 초과되었는지 확인합니다. 우리는 섬유 번들과 미소 렌즈가 결합 이전에 정확하게 정렬을위한 저전력 현미경이나 입체경에 따라 별도의 3 축 수동 위치 단계에 장착하는 것이 좋습니다. </li><li> 렌즈 또는 번들 얼굴 하나에 광학 접착제 (예 : 노르 랜드 자외선 경화 접착제)의 한 방울을 넣으십시오. 매뉴얼 positioners를 사용하여 연락처에 두 구성 요소를 가져와. 제조 업체에서 권장 복용량을 위해 자외선에 인터페이스를 노출. </li><li> 미소 렌즈와 보세 인터페이스, 알루미늄 모세관 튜브 (소형 부품 주식 회사)의 짧은 길이를 보호하기 위해 공동을 묶으하는 데 사용할 수 있습니다. 에폭시와 함께 장소에 공동 및 보안을 통해 튜브 슬라이드. 열 수축 튜브는 조립을 완료하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. Microendoscope 이미징 <ol><li> 몇 군데있을 수있는 세포 또는 조직에 대비 에이전트를 적용합니다. proflavine (0.01 % PBS에 W / V)로, 문화에 세포의 체외 이미징에서 간단한 부화 (&lt;1 분) 및 rinsing 철저히하여 수행할 수 있습니다. 예 생체내 조직 표본이나 생체내 조직의 이미징은 염색 가능한 다음과 같은 국소 응용 프로그램입니다. 이러한 조건 하에서 proflavine의 이해는 몇 초 몇 분 동안 지속 내에서 가능한 이미지와 거의 즉각적인 것으로 발견되었습니다. </li><li> 몇 군데있을 수있는 샘플과 빛의 접촉 광섬유 번들 놓습니다. 문화 또는 전직 생체내 조직 표본의 경우 이미징 세포, 우리는 영상 중 안정성 XYZ 도끼에 수동 위치 단계와 보안 고정물에 섬유 번들의 말초 끝에 장착하는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 제대로 조립하면 microendoscope는 일관된 광섬유 다발을 통해 릴레이 에피 형광 현미경로 작동합니다. 최적의 이미징 결과를 얻으려면,주의는 세 가지 핵심 조건이 충족되는 보장에 지불되어야합니다 <ol><li> 섬유 번들의 근위 얼굴은 시스템의 전체 해상도를 달성하기 위해, defocus없이 CCD 카메라에 몇 군데해야합니다. 그림 2A, B, C는 각각, 가난한 중심으로 몇 군데 섬유 번들의 일부 약간 defocus, 좋은 초점을 보여줍니다. 최적의 초점은 번들 얼굴에 상대적인 목적 렌즈의 축 위치를 조정하여 발견된다. </li><li> 섬유 번들의 근위 얼굴이 균일의 전체 직경 (뷰 필드)을 통해 조명되어야합니다. 프로토콜 텍스트 (1.7)에 설명한 바와 같이, 이것은 콜러 조명을위한 조명 광학을 구성하여 이루어진다. 그림 2D는 균일한 형광 샘플이 중요한 조명 아래에 해당하는 결과를 보여주는 그림 2E로이 선호하는 구성에서 조명 때 얻은 이미지를 보여줍니다. 후자의 경우, LED의 구조는 실제 샘플의 구조에 따라 겹쳐이 원치 않는 패턴의 모양에 결과 섬유 번들 얼굴에 몇 군데 있습니다. </li><li> 섬유 번들의 근위 및 말초 얼굴 모두 깨끗하고 긁힌 자국과 칩을 무료로해야합니다. 그림 2 층 섬유 경계 5 시에는 작은 칩 형태의 손상과 함께 번들 얼굴에 연결된 파편의 존재를 보여줍니다. 데브리는 렌즈 종이와 이소프로판올, 또는 표준 광섬유 청소 도구, 기존의 광섬유 커넥터와 같은 방식으로 청소하여 얼굴 번들에서 제거할 수 있습니다. 섬유 번들 중 하나 끝 긁힌이나 빠졌거나 번들의 길이를 따라 나면 얼굴 표준 수동 또는 기계적 연마 기술에 의해 평면 광택 수있다면. 우리는 0.5-1.0 μm의 용지에 최종 폴란드어와 초기 거친 폴란드어에 대한 논문을 래핑 12-15 μm의를 권장합니다. </li></ol> 그림 3A는 샘플에 베어 섬유 번들의 proflavine 가벼운 위치와 라벨 다음, 체외에서 세포의 1,483 이미징을 보여줍니다. 그림 3B는 공간 해상도 및 번들 팁에 보세 2.5x 미소 렌즈가 제공하는 뷰 필드에있는 감소에있는 개선을 보여줍니다. 영화 1은 마우스 모델에서 내유 지방 패드의 생체내 이미징에서 보여줍니다. 여기, 0.5 mm 외경 (330 μm의 뷰 필드)와 섬유 묶음은 21 게이지 바늘을 통과하여 조직으로 고급되었습니다. 지방세포는 15에서이 인수의 명백한 심장주기에 의한 움직임과 함께, 명확하게 볼 수 있습니다초당 프레임. 그림 3C는 건강한 인간 자원 봉사자의 구강 점막의 이미징, 1.5 mm 외경 (1.4 mm 뷰 필드)과 큰 광섬유 번들을 사용하여이 시간을 보여줍니다. 표시된 모든 예제에서는 proflavine은 핵 라벨 형광등 대비 에이전트로 사용되었다. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 고해상도 microendoscope (HRME)를 조립. HRME 시스템 (A) 도식 다이어그램. 주요 optomechanical 지원 구조 (B) 조립. (C) 광학 요소의 추가는, 조명 LED 및 CCD 카메라. 10 &quot;X 8&quot;X 2.5 &quot;인클로저에 패키지 HRME 시스템 (D) 사진. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. HRME을 설정합니다. (A) 불쌍한 초점 광섬유 번들과 영상의 예, (B) 좋은 초점 가까이 (C) 이상 중점을두고 있습니다. 년 (D), 번들의 말초 팁에서 균일한 형광 대상은 콜러 (교복) 조명 아래에 몇 군데 있습니다. (E) 균일한 형광 목표는 개체에 대한 명백한 소스 구조, 중요 조명 아래에 몇 군데. (F) 느슨한 조직과 세포는 또한 주변에 약간의 손상하는 경향이있는 섬유 번들 얼굴에 붙어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. HRME와 이미징. (A) 체외에서 1,483 세포는 proflavine 0.01 % (W / V)와 레이블 아래 노출된 광섬유 번들 (IGN-08/30)와 몇 군데. (B)와 같이 동일한 1,483 세포 배양은 (A), 2.5x 미소 렌즈가 붙어있는 섬유 번들로 몇 군데. proflavine 0.01 %의 국소 응용 프로그램 (W / V) 다음과 같은 생체내 정상적인 인간의 구강 점막 (C) 이미지. 영화 1. 이미징 조직으로 전달 21 게이지 바늘의 루멘 이내에 450 μm의 외경 섬유 번들의 삽입을 통해 마우스의 내유 지방 패드. Proflavine 0.01 % (W / V)은 이전 이미지 섬유의 삽입에 같은 주사 바늘을 ​​통해 이미징 사이트에 전달했다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1 2306_Pierce_movie1.avi">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a>

<ol>
	<li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer.">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy.">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li><li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+in+Barrett's+esophagus:+a+novel,+low-cost+endoscopic+microscope.">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett's+esophagus.">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li><li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring.">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li><li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope.">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li><li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., L&#233;v&#234;que, J. -. L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle.">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li><li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li><li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li><li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope.">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li><li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost,+high+performance,+self-aligning+miniature+optical+systems.">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li></ol>

MP와 DY가 공개 없어요. RRK는 microendoscopic 영상 플랫폼에 관련된 특허를 보유하고 있습니다.

고해상도 microendoscopy 기술은 현재 현장에서 휴대 세부 시각화를위한 유연하고 강력하며 비용 효율적인 방법으로 기본적인 생물 의학 및 임상 연구 분야의 연구자를 제공합니다 설명했다. 우리는 이미징 시스템을 조립을위한 프로토콜을 설명하고 체외에서 세포 배양에의 사용을 시연하고, 생체내의 동물에서 인간 조직했습니다. 여기에 제시된 이미징 결과 형광등 대비 에이전트로 proflavine를 사용하는 동안, 다른 단체는 5-7 다른 염료의 여기 / 방출 스펙트럼과 일치하는 선택한 LED 조명 파장 및 필터 시스템의 버전을 증명하고있다. 해상도와 뷰 필드는 처음 코어로 코어 간격 및 광섬유 번들의 이미징 직경에 따라 결정됩니다. 우리는 약 4 μm의 코어 코어 간격, 그리고 330 μm의 (영화 1), 720 μm의 (그림 2, 그림 3A, B), 그리고 1400 μm의 (그림 3C)의 이미지 직경과 번들을 사용했습니다. 작은 번들은 좁아 게이지 바늘 통과하고 큰 섬유보다 훨씬 더 유연하실 수 있습니다. 우리와 다른 8, 어떤 경우에는, 섬유에서 배출 autofluorescence의 모양 자체가 번들 언급했습니다. UV 파장에 fluorophores을 자극하거나, 빨간 스펙트럼 범위에서 방사를 수집하려고하면, 관심은 전체 측정 신호에 기여 섬유 번들 autofluorescence의 수준으로 지급해야합니다. 고해상도 microendoscopy 작업 대부분의 최신은 노출된 광섬유 번들을 사용했다고 보도되지만, 추가적인 확대가 말초 팁에 보세 미소 렌즈의 사용에 의해 제공될 수 있습니다. 미소 렌즈는 광학 aberrations과 제한된 NA 그들의 자화율이 잘 인식에도 불구하고, 공간 해상도를 높이기 위해 간단한 경제적 방법을 제공합니다. 미소 렌즈 성능은 특정 응용 프로그램, 하이브리드 미소 / 구면 렌즈의 목표 9 미니어처 객관적인 렌즈 어셈블리에 대한 불충 분한 경우에는 10-11을 고용 수 있습니다. 고해상도 microendoscope은 넓은 분야 에피 형광 현미경으로 운영 근본적으로 여기서 설명하므로 더 광학 sectioning (그런 공촛점 또는 비선형 현미경)을 기대하는 것입니다 않습니다. 우리의 경험에서 455 나노미터 여기 가볍고 대비 요원으로 국소 proflavine를 사용하여 조명은 주로 몇 셀 레이어에 해당하는 깊이에서 수집됩니다. 이 프로토콜은 독자가 10의 소형 풋프린트 함께 benchtop에서 &quot;X 8&quot;고해상도 microendoscope 조립 수 있도록 해야지. 원하는 경우, 시스템은 상자에 동봉된 및 전기 부품 (LED와 카메라) 배터리 팩 (그림 1D)에 의해 구동 수 있습니다. 대부분의 컴팩트 카메라는 IEEE - 1394 (파이어 와이어)와 호스트 컴퓨터의 USB 포트에 의해 구동 수 있습니다.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Point Grey Research</td>
<td>GRAS-14S5M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>M455L2</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Excitation filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>452/45</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Emission filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>550/88</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>485 DCLP</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Objective lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs (Olympus)</td>
<td>RMS 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tube lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>AC-254-150-A1</td>
<td>Select focal length to achieve required magnification to CCD</td>
</tr>
<tr>
<td>Condenser lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ACL2520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage cube unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage rods and plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fold mirror unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>KCB1, PF10-03-G01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lens tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adapters / couplers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMA connectors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1SMA, 11040A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED driver</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>LEDD1B TPS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fiber optic bundle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sumitomo</td>
<td>IGN-08/30</td>
<td>Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

high-resolution fiber-optic microendoscopy for in situ cellular imaging

많은 생물 학적 및 임상 연구는 세포 수준의 해상도와 형태와 기능의 종단 연구와 분석을 필요로합니다. 전통적으로 여러 실험은 빛의 현미경에 의해 평가를위한 연속적인 시간 지점에서 연구에서 제거 각각의 샘플과 함께 병렬로 실행됩니다. 여러 intravital 기술은 공촛점, multiphoton와 함께 개발하고, 둘째 고조파 현미경은 모든 현장 1 영상에 사용될 자신의 능력을 입증했습니다. 이러한 시스템으로, 그러나 필요한 인프라는 스캐닝 레이저 시스템 및 복잡한 광원을 포함한, 복잡하고 비싼 것입니다. 여기 우리는 5000 미국 $ 이하 부품 - 더 - 선반이 꺼져 사용하여 하루에 만들 수 있습니다 고해상도 microendoscope의 설계 및 조립을위한 프로토콜을 제시한다. 플랫폼은 이미지 해상도 측면에서 유연성을 제공 뷰 필드 및 운영 파장, 우리는 이러한 매개 변수가 쉽게 최종 사용자의 특정 요구를 충족하기 위해 수정할 수있는 방법을 설명합니다. 우리와 다른 excised 6 살아있는 동물의 조직 2,5, 그리고 생체내 2,7 인간의 조직에서 체외 세포 배양 2-5에서에서 고해상도 microendoscope (HRME)의 사용을 살펴 보았다. 사용자 proflavine 2-4, benzoporphyrin - 유도체 monoacid 반지 (럴 - MA) 5, fluoroscein 6,7, 전체를받은 모든 중, 또는 FDA의 investigational 승인 등 여러 가지 형광 대비 요원의 사용을보고 인간의 과목에서 사용하십시오. 고해상도 microendoscopy는 형태로 여기서 설명에 기본 및 임상 과학에서 근무하는 연구자의 다양한 관심을 끌 수 있습니다. 기술은 사용자가 고해상도, 원위치에 세로 이미징을 수행함으로써, 기존의 benchtop 현미경을 보완 효과적이고 경제적인 접근 방식을 제공합니다.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging at JoVE.com

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

그들의 모국어 microenvironment에서 진화 많은 생물 학적 및 임상 상황에서는 그것은 세포 프로세스를 연구에 유리합니다. 여기 우리는 세포 배양, 동물 실험 및 임상 환자 연구에 실시간 영상을 제공할 수있는 저비 용의 광섬유 현미경의 조립 및 사용에 대해 설명합니다.

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

high-resolution-fiber-optic-microendoscopy-for-situ-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

34.3K 조회수.  Rice University. 그들의 모국어 microenvironment에서 진화 많은 생물 학적 및 임상 상황에서는 그것은 세포 프로세스를 연구에 유리합니다. 여기 우리는 세포 배양, 동물 실험 및 임상 환자 연구에 실시간 영상을 제공할 수있는 저비 용의 광섬유 현미경의 조립 및 사용에 대해 설명합니다.

비디오: High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

고해상도 3D 영상의 전 VIVO</em마이크로 중부 표준시로> 생물 학적 샘플

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

연구

생체공학

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

멀티 모달 이미징 및 비 침습적에 대한 분광학 섬유 다발 Microendoscopy 플랫폼,<em&gt; 생체</em&gt; 조직 분석

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

적절 한 위치와 뼈 마이크로 아키텍처를 사용 하 여 생체 내에서 마이크로-단층의 집중된 고해상도 이미징 쥐 뒷 다리의 구속

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

최적화 된 설치 및 히스테리시스 측정 현장에서 자기 도메인 이미징에 대 한 프로토콜

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

고해상도 무늬 Biofilm 증 착을 사용 하 여 pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...