우리는 축 광학 핀셋과 관련하여 도움이이 원고에게 스트레칭 데이터의 일부를 기여를위한 Dr Yih-팬 첸 감사드립니다. 이 작품은 NSF 부여 PHY-0957293 및 FOCUS 부여 PHY-0114336 후원했다.

1. 핀셋 설정 <ol><li> 1064 nm의 레이저에서 빔은 두 개의 직교 편광 빔으로 분할되어 있습니다. 하나는 다른이 (그림을 참조하십시오. 2) 보정 목적으로 사용되는 동안 생체 분자를 조작하는 데 사용됩니다. </li><li> 각 빔의 위치 및 포커스가 독립적으로 각각 빔 조향 거울과 광학 망원경에 의해 제어되는 동안 조작 빔의 강도는 음향 광학 향기 (AOD)에 의해 제어됩니다. </li><li> 빔 그런 다음 다른 편광 빔 스플리터와 재결합하고 약간 현미경 대물의 뒷면 조리개를 너무 많이 넣다하기 위해 텔레 스코핑 광학의 마지막 세트에서 추가로 에어컨이 있습니다. 조작 빔에 대한 약간 작은 요소, 약 20 %가 선형 잠재력 큰 실행 가능한 영역으로 변환하는 얕은 초점을 제공하면서 보정 빔을위한 50 % 너무 많이 넣다가 꼭 광학 트랩에 연결됩니다. 빔은 단단하게 PlanApo 60x/1.4 오일 집중 현미경 OBJ에 중점을두고 있습니다샘플 셀에 ective. </li><li> 이 핀셋 설정은 콘덴서에 의해 샘플 챔버에 초점을 맞춘 할로겐 램프의 조명을 제공하는 홈 구축 brightfield 현미경과 결합되어 있습니다. brightfield 이미지는 이색 성 거울로 레이저 빛으로부터 분리 후 두 CCD 카메라에 이미징된다. 다른 CCD는 이미지를 가진 위치 현미경에서 드리프트를 보상하도록 피드백 제어 시스템 역할을하는 단일 붙어 참조 microsphere에 사용되는 동안 하나의 CCD 데이터를 취득 우리의 주요 수단으로 역할을하고, 정확한 샘플링 속도를 얻을 수 있도록 실행 소프트웨어입니다. </li><li> 샘플 coarsely XY 스테이지의 목적과 관련하여 위치하고 정확하게 포함 된 입체 압전 단계에 위치 할 수 있습니다. </li><li> 앞으로 분산 및 전송 레이저 광은 brightfield 응축기이 수집하여 광 검출기에 초점을 맞추고 있습니다. 그 결과 신호는 100 kHz에서에서 안티 앨리어싱 필터를 통해 필터링 증폭되고DAQ 카드를 사용하여 200 kHz에서에서 cquired. </li></ol> 2. 축 방향 위치에 비드의 확실한 크기를 보정 <ol><li> 이 인산염에 희석 800 nm의 직경 폴리스티렌 마이크로의 솔루션을 분산과 샘플 챔버 (9)를로드하는 것은 염분 버퍼. 10-15분에 앉아 후 가볍게 초과 마이크로을 제거하는 버퍼를 플러시 보자. </li><li> 무작위로 coverglass에 붙어 microsphere를 찾아서 microsphere가 defocused 이미지를 생성 할 수있는 초점을 아래에 약 1 μm까지의 샘플 챔버의 높이를 조정합니다. </li><li> 이미지의 명백한 크기를 측정하려면 먼저 LabView에서 기능을 일치 기하학적 패턴을 사용하여 microsphere의 중심을 찾으십시오. </li><li> 다음으로, 각 단면의 중심에 대해 360 °를 평균하여 microsphere의 방사상 강도 프로필을 생성합니다. brightfield 이미지의 각에 흰색 링에 해당하는 방사형 프로필, 찾을 이차 함수 장착 할 수 있습니다밝기 피크. 이 정상과 중심 사이의 거리가 구슬의 명백한 크기의 척도로 사용할 수 있습니다. </li><li> 보정 piezostage를 사용하여 서서히 microsphere의 축 위치를 증가시키고 CCD 카메라 각 축 위치에 이미지를 획득. </li><li> (그림을 참조하십시오. 3)의 축 위치를 microsphere의 명백한 크기를 상관 관계 각 연속 이미지의 이미지 분석을 반복합니다. 방법에 의해 얻은 축 해상도는 1.4 nm의 약 7입니다. </li></ol> 3. 조작 빔의 광학 가능성을 매핑 <ol><li> collinearly 조작 빔 및 보정 빔을 정렬하여 시작합니다. 조작 빔이 훨씬 약한있을 동안 보정 빔이 목표의 뒤쪽 구멍 50 주변 MW해야 10 MW이라고합니다. </li><li> 조작 빔이 스위치 오프로 교정 빔의 많은 엄격한 트랩 내에서 무료 microsphere를 한정. </li><li> 이제 마니 켜pulation 빔. 조작 빔이 보정 빔보다 훨씬 약한이기 때문에, microsphere의 축 위치는 약간 어리둥절합니다. 축 위치에 결과 변경으로 이미 설명 defocused brightfield 이미지에서 측정 할 수 있습니다. </li><li> 조작 빔을 해제하고 여전히 보정 빔에 갇힌 microsphere와 함께 망원경 렌즈를 조정하여 보정 빔의 축 포커스를 이동. , 조작 빔을 켜 microsphere와 반복의 후속 변위를 측정합니다. </li><li> 변위의 ΔX는 보정 빔의 초점의 축 위치에 역모를 꾸몄다 할 수 있습니다. microsphere의 가장 큰 변위에 해당하는 축 위치는 광학 트랩의 선형 지역 (그림을 참조하십시오. 4)의 중심을 결정합니다. </li><li> 축 위치의 함수로 조작 빔의 광학 힘을 얻기의 마지막 단계의 강성을주의 깊게 측정이 필요보정 빔. 이를 구하려면 조작 빔이 스위치 오프 상태에서 망원 렌즈를 조정하여 표면 위의 마이크로 미터 주위에 보정 빔에 갇혀 microsphere를, 이동합니다. </li><li> 광 검출기로 전송 빛의 강도를 측정하여 microsphere의 열 축 움직임을 기록합니다. </li><li> 신호의 자기 상관가 변동의 일정한 시간을 부여 하나의 지수 감쇠 함수에 장착 할 수 있습니다. τ Z </li><li> 유체 마찰 계수 ζ, microsphere의 대부분은 표면 5,10에 마이크로 근접을 위해 수정 될 수 있습니다. 보정 트랩의 강성 그 다음 κ Z = ζ / τ Z (참조 보충 자료 A와 B)에 의해 주어진다. </li><li> 교정 트랩의 강성을 아는 것은 한 힘 ƒ으로 생의 Z = κ Z ΔX 통합 이전에 측정 축 변위를 변환 할 수 있습니다S 커브가 조작 빔의 축 광학 가능성 (그림을 참조하십시오. 4)의 공간 매핑을 산출. </li></ol> 4. DNA 샘플 스트레칭 <ol><li> 챔버 (9)가 포함 된 표면이 닿는 DNA 분자를 (&lt;1 kbp) 마운트하고, brightfield 이미지를 관찰하면서 망원경을 조정하여 약간 unstretched 마이크로 위의 조작 빔의 초점을 배치합니다. 그런 다음 마이크로 중 하나가 갇혀 될 때까지 무대의 위치를​​ 조정합니다. </li><li> 대략 광학 트랩의 XY 평면의 중심에있는 microsphere의 위치. LabView의 광장 파도의 일련을 생성하고 반복적으로 레이저 빔을 켜거나 끌 AOD로 보낼 수 있습니다. 조심스럽게 레이저 및 샘플 챔버의 가열을 방지하기에 국가의 기간의 강도를 제어합니다. 일반적으로, 레이저 전력 (목적의 뒤쪽 구멍에서 측정) 2 MW 주위에 사용하고 200 밀리 초 (에서), 500 MS (해제)의 펄스를 보낼 수 있습니다. 광장 w의 진폭번가는 AOD로 전송하면 0.5 주변해야 V. </li><li> 함정이 반복적으로 해제 켜져되어로 microsphere를 감상하고 레이저 microsphere의 움직임에 어떤 특혜 방향을 유도하는 경우 확인합니다. 반복적으로 X와 Y 방향 모두에서 microsphere 위치를 조정하는 동안 piezostage을 제어하여 microsphere의 임의의 움직임은 레이저가 켜져있을 때하지만 현저하게 제한 XY 평면에서 등방성 수있게됩니다. </li><li> 다음, Z 방향으로 구슬을 맞 춥니 다. 이 시간, 동시에 실시간으로 마이크로 축 변위를 측정하면서 다시 레이저 빔을 맥박과 해제. 선형 지역 내 센터 무대되는데,이 Z 변위가 가장 높은 지점입니다. </li><li> Z 방향으로 신중 정렬 후 트랩 여전히 XY 평면에 중심 있는지 확인하기 위해 필수적입니다. XY 정렬이 변경 한 경우 microsphere가 세 따라 적절히 중심으로 될 때까지, XY와 Z 정렬 모두 반복해야합니다축. </li><li> DNA에 이르는를 들어, 그들을 축 변위를 얻기 위해 기록, 0.025의 단계 V. 각 단계에서 0 V에서 0.5 V까지 AOD 400 100 프레임의 프레임과 평균 전압 신호를 전송하여 레이저 강도를 두는. </li><li> 힘 확장 곡선은 이제 (B 보충 자료 참조) 해본 및 수정 WLC 모델 11에 맞게 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 1298 BP와 247 BP 순서, 우리는 reproducibly 신축 할 수 있었던 가장 짧은 시퀀스되는 후자 : 우리는 두 개의 DNA 시퀀스에 힘 확장 곡선을 제시한다. 이 길이 저울에 하나는 유한 크기의 효과와 경계 제약에서 발생하는 제로 힘 연장을 설명해야하기 때문에 DNA의 짧은 뻗어 들어, 기존의 웜 형태의 체인 (WLC)이 모델은 완전히 힘 확장 관계를 설명하지 않습니다. 힘 확장 측정 그러므로 effecti이 수정 WLC 모델을 사용하여에 맞게해야지속성 길이와 보충 자료에 자세한 설명 적합한 매개 변수로 제로 힘을 확장하고있어. dsDNA 큰 윤곽 길이를 들어, 효과적인 지속성 길이는 단순히 명목상의 지속성 길이 (~ 50 nm 정도)과 제로 힘을 확장 무시 될 수 있습니다. 그러나 윤곽 길이가 짧아 해짐에 따라, 효과적인 지속성 길이는,은 50 나노 미터 및 DNA 아래 감소도 영 힘에 따라, 상당한 확장을 보여줍니다. 힘 확장 곡선의 데이터와 해당 맞게이 그림에 표시됩니다. 두 시퀀스에 대해 5. 수정 WLC 맞는부터, 우리는 효과적인 지속성 길이는 1,298 BP DNA와 247 BP의 DNA 25 나노 35 나노 미터로 결정했습니다. 설명의 목적을 위해, 우리는 각 순서의 힘 확장 곡선의 한 대책을 제시하고 있습니다. 실제로, 하나는 측정을 여러 번 반복하여 표준 오류와 함​​께 평균 결과를 얻을 것입니다. 그것은 THA도 주목해야합니다t 각 곡선을 취득 후에는 microsphere 이전에 프로토콜에 설명 된대로 달리 microsphere가 realigned해야합니다 선형 영역 내에 갇혀 올바른 위치에 유지되도록 필수적입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" /> 축 방향 광학 족집게의 그림 1 원칙. (왼쪽) 초점 근처 종래의 광학 핀셋 트랩. 구슬 그런 다음 장력을 발휘하는 coverslip으로 측면 이동합니다. (오른쪽) 축 광 핀셋에서 microsphere는 광학 가능성의 선형 영역에서, 초점에서 떨어져 갇혀있다. 이 구성에서는 폴리머는 확장 범위에 대한 지속적인 긴장에서 개최됩니다. 또한, 레이저 강도를 증가하면 축 방향으로 microsphere를 이동합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" /> 의 그림 2 도식 표현축 방향 광학 족집게 레이저 광 (1064nm ND : YvO 4). 편광 빔 스플리터 (PBS)를 통과하여 두 기둥으로 분할되어 있습니다. 조작 빔, 음향 광학 편 향기 (AOD)를 통해 전달하고 보정 빔은 망원경 렌즈를 사용하여 독립적으로 조정할 수 있습니다. 두 빔 그런 다음 높은 NA의 목적으로 다른 PBS를 사용하여 재결합 및 샘플에 중점을두고 있습니다. 동시에, brightfield 조명이 microsphere를 추적하는 데 사용, 샘플을 통과 필터링 (IR) 적외선이며, 다음 피드백 제어 시스템의 일부로서 다른 행위 동안 측정을 소요 하나는 두 개의 CCD 카메라에 의해 이미징 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" /> 3 축 방향 위치 보정을 그림. 축 위치를 보정하기 위해, 우리는 무대의 축 위치를 변화의 챔버 coverslip에 붙어있는 구슬의 defocused 이미지를 획득. 마이크로의 크기phere은 그 중심과 microsphere의 이미지 주위에 형성된 밝은 링에 대한 최고 강도의 위치 사이의 거리에 의해 주어진다. 삽입은 구슬의 크기를 제공하는 레이디 얼 강도 분포를 제공합니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" /> 광학 가능성을 매핑 뒤에는 네 원리를 그림. 조작 빔의 광학 힘을 매핑하려면이 훨씬 더 강력한 보정 빔 안에 갇힌 microsphere에 유도하는 축 변위가 측정됩니다. 이 변위는 최대 인 선형 지역의 센터에 자리 잡고 있습니다. 축 방향 위치 곡선 대 광학 힘이 광학 가능성을 찾기 위해 통합 할 수 있습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" /> 그림 5 강제 확장 곡선. 데이터는 임의의 1298 BP와 247 BP (삽입) segmen에 표시됩니다dsDNA의 t는 축 광학 핀셋으로되었다. 데이터 포인트는 EQ의 수정 WLC 모델에 맞게되었습니다. 3 (고체 라인)과는 1298bp와 247bp 각각에 대해 34 나노 미터 및 25 나노 미터의 효과적인 지속성 길이를 나왔고.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

종래의 광 핀셋은 refractile 개체에 일정한 힘을 적용하는 중 아날로그 또는 컴퓨터 제어의 의견에 의존하고 있습니다. 이러한 적극적인 피드백 시스템은 단백질의 바인딩에서 DNA 또는 필라멘트를 따라 분자 모터의 급속한 스테핑으로, 예를 들어, 어려움 표본의 확장의 급격한 변화가 발생할 조건 하에서 수행되어 있습니다. 일정한 힘을 적용하기위한 다양한 수동 방법이 최근 개발되었습니다. base...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 코멘트 </th></tr><tr><td> ND : YVO4 레이저 </td><td> 스펙트럼 물리학 </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> 음향 광학 변류기 </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 목표 </td><td> 하늘 </td><td> PlanApo </td><td> 60X, NA 1.4 </td></tr><tr><td> 압전 단계 </td><td> 매드시 연구소 </td><td> 나노 LP100 </td><td> XYZ 단계 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> 광 검출기 </td><td> 전기 광학 기술 </td><td> 동부 표준시 - 3020 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리스티렌 비즈 </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm​​, streptavidin 광을 낸 </td></tr><tr><td> 안티 digoxigenin </td><td> 로슈 </TD&gt; <td> 11333089001 </td><td> 양에서 </td></tr><tr><td> 프리 머 </td><td> MWG 오페론 </td><td> 사용자 oligos </td><td> 하나의 뇌관 : 비오틴 기타 : digoxigenin </td></tr><tr><td> PCR 시약 </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> DNA 형성 촉매의 효소 dNTPs </td><td></td></tr><tr><td> Coverglass </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에 대한 다른 화학 물질 버퍼 </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 보충 자료 A. 유체 마찰 계수 표면 근처 microsphere의 유체 마찰 계수를 결정하는 사람은 다음과 같은 확장 5,10를 사용할 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="수식 1" /> 있는 다음과 같은 속기 H로 도입되었습니다 : <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="수식이" /> 마찰 계수는 표면 위에 거리 η에 위치한 microsphere의 중심으로, 유체 점성 η과 microsphere의 반지름의 관점에서 정의됩니다. 십년 쯤 조건에 확장 할 때 합류가 합리적으로 잘 converges. 강성 보정에 축 방향 위치의 B.의 영향 트랩 강성의 교정 표면에서 증가 거리를 증가 교정의 정확성, 그리고 함정이 실험적으로 사용되는 실제 축 위치 사이의 효율이 줄어을 포함한다. 일반적으로 트랩이 실제 실험 조건보다 더 높은 표면, 800-1000 nm의 주위에 교정된다. C.는 웜 형태의 체인 (WLC) 모델을 수정 힘 확장 곡선은 수정 WLC m에 맞게 할 수 있습니다odel이 다음과 같이 제로 광학 힘에 볼륨 제외 효과를위한 계정 : <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="수식 3" /> F 선택은 광학 힘이고, X O는 영 힘 확장에 적합한 매개 변수이며, X 선택이 힘을 아래의 확장, 전 DNA의 윤곽 길이이며, L * P는 &quot;효과에 대한 두 번째 적합한 매개 변수입니다 &quot;지속성 길이. F wlc 일반적인 WLC 모델 11에 의해 주어진다 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="수식 4" /> 위치 ε 상대 DNA 확장입니다.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

이하 kilobase보다 윤곽 길이의 DNA에 이르는위한 단일 분자 기술은 실험 어려움이 따른다 있습니다. 그러나, 이러한 히스톤 구속력과 DNA 1,2의 단백질로 인한 루핑 등 여러 흥미로운 생물학적 이벤트가,이 길이 규모 발생합니다. 최근에는 DNA의 기계적 성질은 소형 nucleosomes와 염색질 섬유 3,4로 DNA의 패키징과 같은 기본적인 세포 과정에 중요한 역할을하는 표시되었습니다. 분명 DNA의 짧은 뻗어의 기계적 성질을 이해 한 후 중요합니다. 이 논문에서, 우리는 몇 백 basepairs 짧은 등의 윤곽 길이와 DNA의 기계적 동작을 연구 개발 한 단일 분자 광 tweezing 기술에 실질적인 가이드를 제공합니다. DNA의 짧은 세그먼트를 스트레칭의 주요 장애물은 기존의 광 핀셋은 일반적으로 directio에 힘을 적용하도록 설계되어 있습니다N 무대 5,6에 측면 (그림을 참조하십시오. 1). 이 구조에서, 구슬과 coverslip 사이의 각도는, 그 DNA가 묶여있다하기 위해, submicron의 길이 DNA 매우 가파른됩니다. 축 위치는 현재 확장 가까이 coverslip에 microsphere를 끌 때문에, steric 효과가 향상되고 도전이 될 수있는 차지, 그리고해야합니다. 또한, 마이크로의 비대칭의 결과로, 측면 확장 생성합니다 확장 중에 반응성 힘 변화의 방향부터 광학 트랩 내에 인해 microsphere의 회전에 토크의 수준을 변화. 스트레칭 submicron의 DNA에 대한 대체 방법은 자신의 고유 한 장애물에 반대하는 실행합니다. 예를 들어, 듀얼 빔 광학 트랩이되는 두 트랩 사이 마이크로 사이의 빛의 분산에서 포인트 간섭 효과 큰 문제를 일으킬하기 시작, 파장 주위의 DNA에 이르는으로 제한됩니다. 트랩 중 하나를 교체micropipette으로 가능성이 가장 높은 유사한 문제로 고통 것입니다. 사람이 직접 D​​NA을 향상시킬 수있는 축 잠재력을 사용할 수 있지만, 적극적인 피드백 체계는 일정한 힘이의 대역폭은 특히 낮은 힘에서 매우 제한됩니다를 적용 할 필요됩니다. 우리는 직접 일정한 힘을 축 광학 핀셋 7,8를 사용하여 coverslip에서 떨어져 DNA를 당겨 이러한 근본적인 문제를 회피. 이 문제는 광학 힘이 일정한 힘있는이 레이저 파워를 조정하여 조정 될 수 있습니다 광학 가능성 선형 지역의 구슬을 수집에 의해 달성된다. 선형 영역 내에 트래핑은 또한 축 방향으로 약 350 나노 미터에 대한 확장 DNA에 모든 광학 힘 - 클램프 역할을합니다. coverslip에 붙어 참조 microsphere가 동일한 위치와 초점에 남아 있도록 동시에 정교하게 무대의 위치를​​ 조정하여 열 및 기계적 드리프트 보상거의 무한 관찰 기간 동안 llowing.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

우리는 짧은 DNA 분자의 기계적 성질을 탐험 할 수있는 일정한 힘을 축 광 핀셋의 사용을 보여줍니다. 축 방향으로 DNA를 스트레칭함으로써, 우리는 우리 ~ 100 nm의 짧은으로 DNA 분자를 연구 할 수 있습니다 steric hindrances 및 종래의 측면 조작하여 발생하는 유물을 최소화합니다.

상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

stretching-short-sequences-dna-with-constant-force-axial-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K 조회수.  University of Michigan. 우리는 짧은 DNA 분자의 기계적 성질을 탐험 할 수있는 일정한 힘을 축 광 핀셋의 사용을 보여줍니다. 축 방향으로 DNA를 스트레칭함으로써, 우리는 우리 ~ 100 nm의 짧은으로 DNA 분자를 연구 할 수 있습니다 steric hindrances 및 종래의 측면 조작하여 발생하는 유물을 최소화합니다.

비디오: Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

원자 힘 현미경을 사용하여 재조합 DNA와 단백질 단지의 시각화

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

연구

생체공학

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

PDMS 막에 마이크로 패턴 세포를 스트레칭

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

트위스트와 토크의 측정을위한 자석 집게

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

곡선 변환 기반 도구를 사용하여 피브릴라 콜라겐 조직을 정량화

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...