This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

단일 분자 협 지부에 대한 RNA 분자의 1 준비 <ol><li> 관심 서열 복제. 벡터에 RNA 구조에 대응하는 DNA 서열을 복제. </li><li> 합성 및 전사 템플릿의 정화. PCR에 의한 전사 템플릿을 합성. [여기서 도시 표 1] 다음에, PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 제품을 정제하고,&gt; 200 NG / μL로 샘플을 집중한다. 정제 된 DNA가 전사를 위해 사용되기 때문에,의 RNase가없는 물 용출 농도 단계에 사용한다. </li><li> 시험 관내 전사합니다. RNA 수율을 극대화하기 위해 밤새 37 ° C에서 시험 관내 전사에 의해 RNA를 합성. 전사 후 [여기 장소 표 2], 나는 37 ° C에서 15 분 동안 DNA 템플릿을 소화 한 μL의 DNase를 추가합니다. 실리카 스핀 컬럼을 사용하여 RNA를 정제 하였다. </li><li> 비오틴 핸들 A.의 합성 먼저, 프라이머 AF 및 아르곤과 진한 PCR을 사용하여 개질 된 핸들을 생성증폭 된 DNA&gt; 200 NG / μL로를 entrate. 다음으로, 프라이머 신장 반응을 이용하여 PCR 생성물로 바이오틴 변형을 통합한다. [장소 여기 표 3] NOTE : 바이오틴 손잡이 A (비오틴-HA)을 정제없이 직접 어닐링에 사용될 수있다. 비오틴-HA는 RNA에 어닐링 할 수있는 바와 같이, 그것은 두 단계의 RNase없는 물을 사용하는 것이 중요하다. </li><li> 디그 옥시 제닌 수정 핸들 B.를 합성의 합성 프라이머 Bf로와 디그 옥시 제닌 수정 올리고 파 - BR (그림 3)를 사용하여 PCR에 의해 핸들 B (발굴-HB)를 수정 디그 옥시 제닌. 이어서, PCR 생성물을 정제하고&gt; 200 NG / μL로 샘플을 집중한다. </li><li> 핸들에 어닐링 RNA. 핸들 RNA를 어닐링. [여기서 도시 표 4 및 표 5] </li><li> 단련 된 샘플을 정화. 열처리 된 시료의 에탄올 3 볼륨을 넣고 잘 섞는다. 적어도 1 시간 동안 -70 ℃에서 혼합물을 저장합니다. 15,800 XG에 스핀 다운 및 상층 액을 제거한다. 동결 건조기를 사용하여 펠렛을 건조시킵니다. 에서 펠렛을 녹여100 μL의 RNase없는 물. 참고 : 샘플을 사용할 준비가 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 광 핀셋의 2 교정 및 운영 <ol><li> 비디오 모니터의 픽셀 크기를 보정 <ol><li> 트랩으로 알려진 지름 (크기 기준)와 비드를 광 트랩을 사용합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어를 사용하여 포획 된 구슬의 캡처 이미지 (그림 4). </li><li> 중심 법에 의한 이미징 소프트웨어를 이용하여 비드의 직경을 결정한다. </li><li> 다른 크기의 구슬의 직경을 결정하기 위해이 절차를 반복합니다. </li><li> 화소의 물리적 크기를 얻기 위해 선형 회귀에 의해 측정 한 비드의 직경 및 공지를 장착한다. </li></ol></li><li> 거리 보정 확인 <ol><li> 트랩에 비드를 광 트랩을 사용합니다. </li><li> 촬상 소프트웨어에 의해 그 무게 중심의 화소 위치를 결정하고 Minitweezers를 사용하여 위치를 기록한다. </li><li> diffe하는 비드 스티어<html> 위치를 임대하고 위치 결정을 반복합니다. </li><li> 교정 픽셀 크기를 이용하여 m 단위로 화소로부터 비드의 X 및 Y 위치를 변환한다. </li><li> 비디오 의해 Minitweezers 측정 위치 사이의 X 및 Y를 비교한다. 값의 두 세트에 동의한다. 이미지 해상도가&gt; 0.1 μm의이기 때문에 정확도를 보장하기 위해 측정 사이에 1 μm의를 통해 비드를 이동합니다. 거리 보정 Minitweezers에 기억 한 필적 없으면 계측기를 재조정. </li></ol></li><li> 트랩 강성 교정 <ol><li> 광학 트랩을 사용하여 구슬을 캡처 여전히를 개최합니다. </li><li> 3 초 동안 속도&gt; 5 kHz에서 바이 패스 고속 데​​이터 수집을 사용하여 트랩의 힘을 기록한다. </li><li> 소프트웨어를 이용하여 비드의 기록 동작에서 전력 스펙트럼을 생성한다. 로렌츠 (그림 5) (38) 파워 스펙트럼에 맞는 : 542 / 51542eq1.jpg &quot;너비 =&quot;200 &quot;/&gt; (식. 1) 어떤 S (F)는 F의 주파수에서의 힘을, F (C)는 코너 주파수이고, S는 0 점근 전력이다. 코너 주파수는 C F, 열 동작 전원이 점근 값의 절반으로 감소 주파수이다. F (C)가 레이저 파워와 구슬의 크기에 따라 달라집니다으로, 개별적으로 갇혀 비드를 교정. </li><li> f를 C에서 트랩의 스프링 상수 κ를 계산한다 : <img alt="식 (2)" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (식. 2) 하는 γ는 비드 (식. 3)의 항력 계수이다. 힘의 변화에​​서 RNA의 확장 변경 사항을 결정하기 위해 스프링 상수를 사용합니다. </li></ol></li><li> 스토크 법률 테스트 <ol><li> 광 트랩을 사용하여 비드를 캡처. 백업 및 힘 비드를 이동 다른 속도로. </li><li> 구슬의 움직임을 기록하고 Minitweezers을 이용한 강제. </li><li> 비드의 반경을 계산한다. NOTE : 마찰력, F d를, 유체의 구형 입자의 움직임에 의해 생성은 스토크의 법칙에 의해 설명 될 수있다 : <img alt="식 (3)" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (식. 3) R은되는 구의 반경, V는 속도이다, h는 참조 테이블에서 발견 될 수있는 유체의 동점도이다. F의 D와 같은 힘을 측정하여, 비드 부의 반경은 식을 사용하여 계산 될 수있다. 3 (그림 6) 및 이미지 수집 소프트웨어에 의해 결정이 동의해야한다. 스톡스 법칙 테스트 효과적으로 전체적인 교정 및 기기의 성능을 테스트한다. </li></ol></li></ol> 단일 RNA 분자의 3 Nanomanipulation <ol><li> 유체 만들기. <ol><li> 2 번 커버 유리에 6 홀 (2mm 직경 각) (도 7a)를 뚫고 (7B 그림) 레이저 조각기를 사용하여 양면 폴리이 미드 테이프로 세 슬릿 (2mm 폭을) 잘라. </li><li> 양면 캡톤 테이프의 두 층으로이 커버 유리를 끼워 흐름 챔버를 확인합니다. 테이프 (그림 7C) 사이에 마이크로 피펫과 두 개의 바이 패스 튜브를 삽입합니다. </li><li> 유체 구멍 (그림 7D)을 일치시켜 금속 프레임 상에 유량 용기를 탑재합니다. </li><li> 폴리에틸렌 호스 (그림 7E)를 통해 선택의 버퍼 가득 10 ML 주사기로 챔버의 유체 채널을 연결합니다. </li><li> 두 목표 사이의 광 핀셋에 전체 챔버를 탑재합니다. 유체 채널 챔버의 앞면이 오른쪽으로 향하도록해야합니다. 올바른 목표를 후퇴와 t에 장착 구멍에 프레임 (그림 7E)의 황동 핀 플러그그는 핀셋. 챔버의 위치를​​ 고정하는 나사를 조입니다. </li></ol></li><li> 열처리 된 시료와 구슬을 혼합. 안티 - 디그 옥시 제닌 코팅 구슬 (발굴 구슬)로 어닐링 샘플을 혼합하고,이 혼합물은 5 ~ 10 분 동안 실온에서 체류 할 수 있습니다. 전형적으로, 어닐링 된 시료 1 ㎕의 완충액 1 ㎖에 5 ㎕를 발굴 비드와 혼합된다. NOTE : 비드의 양은 유동 챔버로 로딩되는 비드의 적당한 양이 바이 패스 관으로부터 전달되도록 보장하기 위해 선택되어야한다. 비드 어닐링 시료의 비율은 쉽게 정량화 될 수 없다. 이상적인 경우에, 대부분의 비즈 비즈의 작은 부분 만이 비드 당 하나의 RNA 분자를 가질 수 있도록 RNA에는 없다. 어닐링 된 샘플 및 비드 현탁액을 정량화하기 어렵다 같이, 유일한 방법은 현재 가장 및 혼합비를 변화와 핀셋 혼합물을 테스트하는 것이다. </li><li> 마일 위에, 즉 (유동 챔버에서 반응 사이트로 수 마이크로 미터 구슬 배달cropipette 팁, 그림 7C). <ol><li> 1 ML의 주사기에 스트렙 타비 딘 - 코팅 구슬 (연쇄상 구균 구슬)의 현탁액을로드합니다. </li><li> 유량 용기 (도 7a)의 바닥 채널로 이어지는 유체 튜브에 주사기를 연결합니다. </li><li> 챔버로 패 혈성 구슬을 흘러 주사기를 밀어 넣습니다. </li><li> 바닥 바이 패스 관 (도 7b)의 개구 근처 광 트랩을 배치하는 모터 제어 소프트웨어를 사용하여 전체 챔버를 이동. 그런 다음 연쇄상 구균 구슬을 캡처하는 트랙볼에 의해 광 트랩을 운영하고 있습니다. </li><li> 모터 제어 소프트웨어를 사용하여 마이크로 피펫의 선단 주변의 비드를 이동. </li><li> 마이크로 피펫에 비드를 빨아 마이크로 피펫에 연결된 주사기를 당깁니다. </li><li> 추가 연쇄상 구균 구슬을 세척하는 중간 채널에 주사기를 눌러 부드럽게 흐름을 적용합니다. </li><li> 유사하게, 시료의 혼합 챔버의 상부 채널 발굴 - 비즈 (단계 3.2 참조) 전달. </li><li> 발굴 비드를 캡처 및 광학 트랩을 사용하여 연쇄상 구균 - 비드가 가까이 가져. </li><li> 흐름을 적용하여 중간 채널을 청소합니다. NOTE : strep- 그들이 뷰 현미경 하에서 시각적으로 구별 될 수 있도록 비드가 DIG 다른 사이즈로 선택된다 (도 4). </li></ol></li><li> 낚시 &#39;구슬의 쌍 사이에 테 더링 단일 분자. <ol><li> 연쇄상 구균 비드 (그림 4)의 상부에 수직으로 발굴 비드를 놓습니다. </li><li> 트랩을 핸들에 의해 아래로 연쇄상 구균 구슬을 향해 발굴 비드를 이동합니다. 힘의 변화를 시각화하는 컴퓨터의 힘 - 거리 그래프 창을 엽니 다. </li><li> 이 구슬의 접촉시, 수직 거리 패 혈성 구슬에서 발굴 구슬을 이동합니다. </li><li> 특정 접촉이 이루어지지 않은 경우, 힘은 거의 제로 남아있다. 이 비드 분자에 의해 접속하는 경우에는, 힘이 크게 증가이 비드를 분리 할 때. 일반적으로 &quot;낚시&quot;라고 함이 절차는 종종 상승률이며구슬의 각 쌍에 ORMED 여러 번 효과적인 단일 분자 연결 고리를 찾을 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

<html> 협 지부 샘플의 준비에서 수정 및 문제 해결 클로닝 벡터의 선택. 여기에 설명 된 일반적인 구조 (도 3) 특수 클로닝 벡터를 필요로하지 않지만, 벡터는 프로모터가 원하는 위치에서 PCR을 통해 도입 될 수 있도록 전사의 용이성을 위해 고유 T7 또는 T3 프로모터를 갖지 않는 것이 바람직하다. 순서 및 핸들의 길이.</em...

광 핀셋 기술의 개발은 오랫동안 생물학 연구에서의 응용 프로그램과 함께 제공하고있다. 광 포획 효과가 처음 발견되었을 때, 아서 Ashkin 오염 된 물에서 박테리아 레이저 포커스 하나에 포획 될 수 있음을 관찰 하였다. 그 이후로, 박테리아는 생물 물리학 학생들의 세대에 대한 의도하지 않은, 재미 실험뿐만 아니라 미생물 생리학 2,3를 공부하는 심각한 연구 도구가되었습니다 덫. 광 트래핑 기술은 미세 가공 대상물 (1)을 고정화 집속 레이저 빔을 사용한다. 실제로, 또한 트랩 (ΔX)의 중심으로부터 변위에 의해 포획 된 개체에 힘 (F)을 측정 광 스프링 같은 레이저 트랩 기능한다. κ 짧은 범위, F = κ X ΔX, 내 트랩의 스프링 상수이다. 트랩은 광에 마이크로 picoNewton (PN) 정밀도로 힘을가하도록 사용될 수있다copic 객체와 나노 미터 (nm의) 정확도로 위치를 측정한다. 지난 20 년 동안 광 핀셋 생물 물리학에서 가장 일반적으로 사용되는 단일 분자 기술 중 하나가되었다. 이 기술은 폴딩 및 DNA 4-6, 7-9 RNA, 단백질 10, 11의 역학을 연구하기 위해 사용되어왔다. 광 핀셋은 DNA 복제 12, RNA 전사 (13), 및 단백질 합성 14,15,뿐만 아니라 많은 다른 생체 분자 이벤트 16-18을 관찰하는데 사용되었다. 단일 분자 방법은 주로 RNA의 견고한 접이식 에너지​​ 풍경을 탐구하는 RNA 구조의 연구에 사용된다. RNA 서열은 일반적으로 인해 RNA의 간단한 화학 조성 및 기재 페어링 규칙 여러 안정한 상호 배타적 구조로 접을 수있다. 이것은 긴 RNA 구조 다형성, 즉 리보 스위치 (19, 20)에서 발생하는 등, 유전자 조절에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. recent 게놈 전체의 조사는 몇도 크게 셀룰러 사체 (21)의 큰 부분의 구조 및 단백질 합성에 영향을 작게하는 온도 변화를 밝혔다. 이 예는 이전에 생각보다 다른 RNA 폴딩의 생물학적 역할은 아마도 더 중요하고 널리 퍼져 있음을 암시한다. 구조 다형성은, 그러나, 많은 분자의 평균 속성을 검사 기존의 생화학 및 생물 물리학 적 접근 방법에 대한 도전을 포즈. 예를 들어, &quot;을&quot;과 riboswitch &quot;오프&quot;를 입체 형태는 상호 배타적입니다. 이종 구조에서 파생 된 평균 구조는 생물학적으로 관련 이형를 닮은 것 같지 않다. 또한, 번역되지 않은 RNA와 mRNA의 보통 구조를 형성한다. 단백질과 RNA를 규제와의 상호 작용은 일반적으로 상호 작용의 일환으로 기존 구조의 전개가 필요합니다. 따라서 RNA 전개 / 접힘을 공부하는 것은 해당된다RNA 생물학의 문제를 해결합니다. 이러한 과제를 해결하기 위해, 단일 분자 방법은 한 번에 22 ~ 27에 하나의 분자를 연구함으로써 RNA 구조 다형성을 해명하기 위해 사용되었습니다. 인기 단일 분자 형광 방법에 비해 기계적인 전개 기반 핀셋 개별 분자의 입체 형태는 가해진 힘에 의해 조작 될 수 있고, 나노 미터 정밀도로 측정 할 수있는 장점을 제공한다. 이 기능은 nanomanipulation 큰 RNA의 계층 폴딩 28 해부 될 수있는 개별적인 구조적 도메인의 전개 / 폴딩을 모니터하기 위해 이용 될 수있다. 대안 적으로, 단일 가닥 여러 이형태 중 하나에 접하도록 지시 할 수있다; 또는 기존의 구조가 기계적으로 서로 다른 형태 (29)에 접힘하도록 유도 될 수있다. 생물학적 조건에서 RNA 구조가 온도 변화 또는 리간드 결합시에 변경 될 수있다. 직접 조작의 분자의 능력tructure는 RNA 구조 연구의 새로운 장을 엽니 다. 원칙적으로, 예컨대 원 자간 력 현미경과 자기 핀셋과 같은 다른 기계적 방법은 또한 단일 RNA 분자의 폴딩을 연구하는데 사용될 수있다. 그러나, 이러한 애플리케이션으로 인해 상대적으로 낮은 공간 해상도 (30)에 크게 제한된다. 광 핀셋의 고용은 RNA 구조가 기계적인 힘에 의해 전개 할 수 있습니다. 전개 기계의 장점은 여러 가지다. 금속 이온과 리간드 유도 된 폴딩은 주로 차 구조로 한정되는 반면에 힘은 모두 2 차 및 3 차 구조를 전개 할 수있다. 온도 및 변성제 크게 물과 용질의 활동에 영향을 미칠 수있다. 반대로, 힘은 분자 구조를 교란하는 국소 도포; 주변 환경에의 힘의 영향은 무시할 수있다. 또한, 용융 온도가 가장 작은 RNA 구조의 접힘 열역학을 연구하는 데 사용되는,광 핀셋은 일곱베이스 쌍 tetraloop의 머리 핀의 자형으로 28에서 400 염기 라이 보자 임 (31)에 이르기까지 다양한 크기와 RNA의 구조를 연구하는 데 사용 된 반면. 또한, RNA의 구조는 기계적으로 중온 온도에서 전개 될 수있다. 대조적으로, 열 용융 실험에서의 RNA를 펼쳐, 온도는 일반적으로 상당히 잘 특히 Mg를 2 + 이온의 존재하에, RNA 가수 분해를 증가 생리적 온도 이상으로 상승된다. 그것은 힘의 기계적 효과가 구조에 적용되는 방법에 의존한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 가해진 힘은 접는 에너지 풍경을 올라옵니다. 예를 들면, 힘이 머리핀에 적용될 때, 염기쌍 순차 시간 (도 1A)에 하나씩 세분화된다. 리핑 포크 가해진 힘에 수직 인 나선 축을 따라 진행한다. 최소한 키스 착체가 신장 상태로되면 반대로,이 키스가해진 힘에 평행 염기쌍은 힘로드를 공유 (도 1B). 2 차 및 3 차 폴딩 (28, 32)를 구별하기 위해 이용 될 수있는 서로 다른 기계적 응답에 가해진 힘의 결과로 헤어핀과 키스 복잡한 상대의 다른 형상. 전개 기계의 이론적 측면은 이전에 8,9,30을 검토하고있다. 이 작품은 설정하고 단일 분자 기계 전개 분석을 수행 할 수있는 기본적인 방법을 설명합니다. 실험 설정. 우리의 기계 당기는 실험에서, 협 지부의 RNA 샘플은 두 개의 이중 가닥 DNA / RNA 손잡이로 측면에 관심있는 RNA (그림 2)로 구성되어 7. 전체 분자는 각각-비오틴 스트렙 타비 딘과 디그 옥시 제닌 항 디곡 시게 닌 항체의 상호 작용을 통해 표면이 피복 미크론 크기의 비드 (Spherotech)에 닿는 될 수있다. 한 비드 힘 측정 광학 조원에 의해 개최됩니다AP는 다른 반면, 마이크로 피펫의 선단에 유지된다. 비드 사이의 상대 거리가 트랩 조향 또는 마이크로 피펫을 움직이는 하나에 의해 변경 될 수있다. 이 방법을 사용하여 비드를 테 더링 단일 RNA 분자는 연신 및 완화 될 수있다. 샘플의 준비. 협 지부에 대한 RNA 샘플의 합성은 몇 단계 (그림 3)를 포함한다. 먼저, 관심 RNA에 대응하는 DNA 서열은 제 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다. 다음으로, 세 PCR 반응은 두 개의 손잡이와 전사의 템플릿을 생성하기 위해 수행된다. 전사 템플릿 핸들 영역 및 삽입 된 서열을 포함한다. 전체 길이의 RNA는 시험 관내 전사에 의해 합성된다. 마지막으로, RNA 및 화학적으로 변형 핸들은 협 지부에 대해 분자를 생성하기 위해 함께 열처리된다. 보정 및 핀셋의 작동. Minitweezers 사용의 기본적인 디자인이 작품의 D는 듀얼 빔 광 핀셋 (33)의 다음과 같습니다. 첫 번째 세대 광 핀셋에 비해 많은 개선으로, Minitweezers 특별한 안정성을 표시합니다. 여러 나라에서 연구 그룹의 숫자는 단일 분자 연구 14,15,34-37에 Minitweezers를 사용합니다. 교육 비디오를 포함하여 장치의 건설, 교정 및 운영의 세부 사항은, &quot;족집게 연구소&quot;웹 사이트 (http://tweezerslab.unipr.it)에서 사용할 수 있습니다. 여기서, 염기 매일 수행되어야 개선 및 교정 과정을 상세히 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Minitweezers</td>
			<td style="width:211px;">Steven B. Smith Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Data acquisition card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">USB-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Video card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">PCI-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Labview programming software</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">NI Vision Builder</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Laser engraver</td>
			<td style="width:211px;">Epilogue laser systems</td>
			<td style="width:119px;">Zing-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:211px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">MEGAscript T7 kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">MEGAclear kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Biotin-11-UTP</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td>FERR0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:211px;">New England Labs</td>
			<td style="width:119px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">SVP-20-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Antidigoxigenin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Size standard microspheres</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">PPS-6K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:211px;">Kaptontape.com</td>
			<td>KPPTDE-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 2 cover glass</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-543D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomanipulation of single rna molecules by optical tweezers

인간 게놈의 상당 부분이 전사하지만 번역되지 않습니다. 이 게시물 게놈 시대에, RNA의 규제 기능은 점점 더 중요한 것으로 나타났다. RNA의 기능은 종종 다른 구조를 채택하는 능력에 달려있다, 그것은 직접적 RNA 서열로부터 삼차원 구조를 예측하는 것은 곤란하다. 단일 분자는 한 번에 하나의 분자 구조 분자를 모니터링하여 RNA 구조 다형성의 문제를 해결하기 위해 쇼 전위에 접근한다. 이 작업은 정확하게 광 핀셋을 사용하여 단일 RNA 분자의 폴딩 구조를 조작 할 수있는 방법을 제시한다. 첫째, 방법은 단일 분자 기계 작업에 적합한 분자가 설명되어 합성합니다. 광 핀셋의 적절한 운영을 보장하기 위해 다음, 다양한 교정 절차가 설명되어 있습니다. 다음으로, 다양한 실험을 설명한다. 기술의 유틸리티를 설명하기 위해 기계적으로 전개 RNA 헤어핀의 결과와 단일 RNA 키신g 단지는 증거로 사용된다. 이러한 예에서, nanomanipulation 기술은 독립적으로, 2 차 및 3 차 구조를 포함하여 각 도메인의 폴딩을 연구하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 한계와 방법의 미래 응용 프로그램이 논의된다.

공간에 의해 제한, 단일 RNA 분자의 nanomanipulation는 기계 전개 RNA 헤어핀의 예와 차 구조를 가진 RNA를 표시하여 설명된다. 단일 머리 핀 분자를 조작 테더가 비드 사이에 확립되면, 테더에 연장 및 힘은 사용자 정의 된 프로토콜을 사용하여 조작 될 수있다. 일반적인 네 개의 조작 프로토콜은 일반적으로 사용된다. 포?...

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Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K 조회수.  University at Albany, State University of New York. Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules. 

비디오: Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

연구

생체공학

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

기본, 섬유 긴 간격 및 Segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

의 광학 검출<em&gt; E. 대장균</em메조 포러스 실리콘 바이오 센서에 의해&gt; 박테리아

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

트위스트와 토크의 측정을위한 자석 집게

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 ​​분자의 배달

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...