저자 시퀀스 결과를 제공하는 그들의 도움 박사 Keji 조의 연구소 (NIH / NHLBI)에 감사드립니다. 우리는 또한 매핑 시퀀싱 읽은을 시각화하기위한 게놈 브라우저의 사용을 위해 UCSC 게놈 프로젝트를 감사드립니다. 이 작품은 신생 XC로 자금 NICHD, Lucile Parkard 재단, 그리고 존스 홉킨스 대학에서 독립 수상 및 R01HD065816에 R00HD055052 NIH 경로에 의해 지원되었습니다

(전체 칩 절차는 오버 일 정도 소요됩니다. 높은 처리량 시퀀싱을위한 칩 라이브러리의 작성은 다른 2~3일 소요됩니다.) 1. 해부 및 칩 실험 (~ 1,000,000 세포)에 대한 조직의 준비 <ol><li> 차가운 PBS + 1X 프로 테아제 억제제 (7x 주식 솔루션을 얻기 위해 1.5 ML 1X PBS에서 테아제 억제제 칵테일 중 1 개의 펠릿를 해산)에서 (Drosophila testes의 예 2백쌍)에 관심있는 조직을 해부 + PMSF (최종 농도 100 μg / ml) 쇼핑. 두 조직을 씻어하고 억제제와 같은 PBS 용액 200 μL에 조직을 resuspend. </li><li> 예제를 해결하려면, 5.5 μL 37%의 포름 알데히드를 (37 사용하기 전에 1 분 용 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 포름 알데히드) 추가합니다. 15 분 와동 사이에 매 5 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 2 분 동안 진정시킬 수 있도록 조직을 위해 얼음에 샘플을 놓습니다. 450 μL PBS (프로 테아제 억제제와 PMSF와)과 2X 린스. 샘플은 이제 매장이 될 수-20 ° C.에서 D 감자칩 충분한 자료를 얻기 위해 절개를 여러 번 반복합니다. </li></ol> 2. 칩 분석을위한 단백질의 DNA 결합으로 뜨는 준비 <ol><li> 1.75 ML eppendorf 튜브의 단계 1.3에서 충분한 샘플을 결합. </li><li> 조직 샘플에서 PBS를 제거합니다. 200 용해 버퍼의 μL (50 MM 트리스-HCL, pH를 7.6, 1 ㎜ CaCl2, 0.2 % 트리톤 X-100이나 NP-40, 5 밀리미터 butyrate 및 1X proteinase 억제제 칵테일). 추가 용해 완충액 (0.5 mm의 PMSF 최종 농도)로 신선한 PMSF 주식 솔루션을 추가합니다. 조직은 10 분 RT (실내 온도)에서 품어 모든 집계하지 않고 완전히 해리까지 파란 균 질기 (피셔 고양이 # 749521-1590)로 Homogenize. </li><li> Sonication : 파워 20을 사용 microtip의 sonicator (Misonix HS-XL200). 50 초 동안 얼음에서 10 초 그리고 나머지 Sonicate. (이상 sonication 작은 조각을 얻을하므로 최적의 sonication 시간이, 경험적으로 결정되어야한다. histon 대한 항체를 사용하여 칩 4-5 회 반복전자 개조, 우리가 일반적으로 약 200-300 BP에 염색질 sonicate, 전사 인자 혹은 염색질 레귤레이터 (예 Polycomb 단백질)에 대해, 우리는 일반적 200-1000 BP에 염색질 sonicate. 그러나 최적의 조각 크기는 경험적으로 테스트해야합니다. 참고 : 항상에도 가열의 샘플을 방지하기 위해 SONICATING 동안 얼음 튜브를 유지! </li><li> 1.8 ML RIPA 버퍼를 (추가하여 샘플을 희석 10 설명된대로 MM 트리스-HCL, 산도 7.6, 같은 농도에서 테아제 억제제와 PMSF와 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % SDS, 0.1 % 나-Deoxycholate, 1 % 트리톤 X-100, 이전에). 65에서 2 μL 5M NaCl과 부화를 추가하여 입력 컨트롤 등 40 μL를 저장 ° C crosslink를 반대하는 (O / N) 하룻밤 사이에. </li><li> 구슬로 항체를 결합한하려면 1.5 ML eppendorf 튜브 40 μL 단백질에게 구슬을 추가한 후, 2 분 동안 4 ° C에서 600 μL PBS와 바위를 추가 자석에 구슬을 적용하고 뜨는 제거합니다. 100 PBS의 μL과 관심의 항체를 추가합니다 (항체의 양은 empir 결정한다ically). 4시간 1 시간 또는 4 ° C에 대한 RT에서 품어. </li><li> 자석에 의해 구슬에서 뜨는 제거하고 단계 2.4부터 비즈에 1mL 염색질 추출물을 추가합니다. 4에서 회전 ° CO / N. </li><li> 자석에 칩 샘플을 신청하고 뜨는 제거합니다. 십분 각각에 대해 4에서 다음 버퍼 ° C로 염주를 씻으십시오 : RIPA 버퍼 1 ML과 2X [1.89 ML &#39;RIPA 버퍼&#39;+ 315 μL 7x 테아제 억제제 + 20 μL PMSF]; RIPA 버퍼 1 ML과 2X + 0.3 M NaCl [1.89 ML RIPA 버퍼 + 220 μL 3 M NaCl]; LiCl 버퍼 1 ML (0.25 M LiCl, 0.5 % NP40, 0.5 % NaDOC)과 2X; 1X 1X TE의 1 ML과 + 0.2 % 트리톤 X-100; 1X TE 1 ML과 1X. </li><li> crosslink를 반대하려면, 100 μL TE 버퍼에 염주를 resuspend + 3 μL 10% SDS + proteinase K (20 밀리그램 / ML) 5 μL. 65 품어 ° CO / N. </li><li> 자석에 구슬을 적용하고 새 튜브로 뜨는을 전송. 뜨는 당신의 DNA 샘플이 포함되어 있습니다. 100 μL TE + 0.5 M로 구슬을 씻는다NaCl은 두 뜨는을 결합. </li><li> 페놀 - 클로로포름은 DNA 샘플을 추출합니다. Chlorofrom : : 200 μL 페놀 추가 IAA (25:24:1) 혼합 및 소용돌이. RT에서 5 분 14k에 봐. 또는 DNA는 Qiagen PCR 정화 키트를 사용하여 추출 할 수 있습니다. </li><li> 새로운 튜브로 뜨는 / 수성 레이어를 양도, 20 μg / ML (또는 20 밀리그램 / 뜨는의 모든 일 ML에 대한 ML의 글리코겐 1 μL의 최종 농도에 선형 아크릴 아미드를 추가도 사용하실 수 있습니다. 글리코겐이 사용됩니다 선형 아크릴 아미드가 assays를 시퀀스에 사용되는 동안 후속 qPCR 또는 PCR 분석.) 3M NaOAc 20 μL와 500 μL 100 % EtOH를 추가합니다. 잘 섞어서 80에 품어 ° C를 10 분. 4에서 20 분 동안 최대 속도로 스핀 ° C. </li><li> 뜨는 제거하고 300 μL 70 % EtOH로 씻는다. 50 μL TE 버퍼에 대기 건조하고 resuspend 샘플. 샘플은 지금 -20 ° C.에 저장될 수 시료는 정량 PCR (qPCR) 분석 (그림 1)을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 3A. qPCR을 사용하여 칩 에드 DNA를 분석 <ol><li> undiluted, 1 / 10, 100분의 1, 1 / 1000, 5천분의 1 : 표준 곡선을 만들기 위해 다음과 같은 농도에서 게놈 DNA를 희석. </li><li> 각 프라이머 쌍 들어, 단계 3a.1, 입력 제어 및 칩 에드의 DNA에서 게놈 DNA와 96 - 웰 플레이트에 중복으로 qPCR를 설정 : 10 μL 2X SYBR PCR 혼합 (Fermentas, K0222); 앞으로 1 μL 10 μm의 프라이머; 1 μL 10 μm의 역방향 프라이머; X μL 칩 에드 DNA (입력 제어, 또는 게놈 DNA); Y μL nuclease없는 H 2 O 20 μL로 반응 볼륨을 조정합니다. </li><li> 미니 플레이트 스피너 (Labnet)와 96 - 웰 플레이트를 봐. </li><li> 다음과 같은 조건을 사용하여 ABI 7,300 실시간 PCR 시스템 (또는 기타 실시간 PCR 시스템)으로 qPCR을 수행합니다 : 1 단계 : 50 ° 2 분, 1주기위한 C; 2 단계 : 95 10 분, 1 사이클에 대한 ° C; 3 단계 : 95 ° 15 초, 60 ° C 1 분 용 C, 40 Cycles; 4 단계 (분리 단계) : 95 ° 15 초, 60 ° C 1 분, 95 용 C ° 15 s에 대한 C #. </li><li> 해리 곡선을 확인하십시오 : 열 분해 계획에서 하나의 피크는 PCR 반응에서 단일 amplicon을 제안합니다. 하나 이상의 피크는 프라이머 쌍과 비 특정 제품을 나타냅니다, qPCR 데이터는 사용하지 않아야합니다. </li><li> 3A의 희석 게놈 DNA의 시리즈를 사용하여 표준 곡선을 기반으로 CT (사이클 한계) 값에 따라 DNA의 양을 해결 수식을 계산하여 각 프라이머 세트에 대한 PCR 반응의 기하 급수적인 증폭의 선형 단계를 결정합니다. 1. </li><li> 칩 에드의 DNA 및 입력 컨트롤의 CT 값이 CT 가치의 선형 범위 내에있다면, 칩 에드 DNA와 2.4의 입력 컨트롤의 diluting 요인에 따라 칩 에드의 DNA 대 입력의 농축을 계산합니다. </li></ol> 3B. 높은 처리량의 시퀀싱을위한 칩 에드 DNA를 증폭. <ol><li> 칩 에드의 DNA 믹스의 최종 수리 (사용얼음 설정 Epicentre DNA를 최종 수리 키트) : 단계 2.12 (0.1-5 μg) 1-34 μl 게놈의 DNA 5 μl 10X 최종 수리 버퍼 5 μl dNTP 2.5 MM 믹스 5 μl 10 밀리미터 ATP X μl H 2 O 49 μl로 반응 음량을 조절하려면 1 μl 최종 복구 효소 믹스 (T4의 DNA 중합 효소 + T4 폴리 뉴클레오 타이드의 키나제) RT에서 45 분 동안 품어. Qiagen MinElute 반응을 사용하여 반응을 정화 정리 키트. 30 μl 용출 버퍼 (EB)에 Elute. </li><li> 3 &#39;끝에 A-overhangs 추가 : 단계 3b.1에서 eluted DNA 제품의 30 μl 5 μl 10X 코 버퍼 # 2 10 μl 1 ㎜ dATP 2 μl DH 2 O 3 μl 5 U / μl Klenow의 조각 (3 &#39;→ 5&#39;엑소-) 37시 30 분 품어 ° C. MinElute ReactionCleanup 키트를 사용하여 반응을 정화. 10 μl EB에 Elute. </li><li> Solexa 링커 내고 : 단계 3b.2에서 eluted DNA를 10 μl 10 μl ddH 2 O 2.5 &amp;무; 리터 10X T4의 DNA ligase 버퍼 Illumina에서 1 μl 아답터 oligo 믹스 (혈통 1/10-diluted) 2.5 μl T4의 DNA ligase (400 단위 / μl) RT에서 1 시간 동안 알을 품다. MinElute ReactionCleanup 키트를 사용하여 반응을 정화. 20 μl EB에 Elute. 샘플은 지금 -20 ° C.에 저장될 수 </li><li> 전자 젤 장치를 사용하여 단계 3b.3에서 eluted DNA 샘플을 실행합니다. 겔에 300-500 BP 밴드를 분리하고 Qiagen 젤 추출 키트 (이 단계는 어댑터 oligo를 내고에서 ~ 125 BP 자체 출혈도 잡았 linkers을 제거)을 사용하여 정화. 12 μl EB에 Elute. </li><li> Illumina에서 라이브러리 이점 엔드를 사용하여 (PE) primers를 증폭 : 단계 3b.4에서 eluted DNA의 10.5 μl 마스터 믹스의 12.5 μl (2X Phusion HF, Finnzymes) PE1 PCR의 프라이머 1 개 중 1 μl PE2 PCR의 프라이머 2 개 중 1 μl PCR 조건 : 98 ° C ~ 30에 해당하는 초 (98 ° C 10 초, 65 ° C 30 초, 72 ° C에서 30 초), 반복 20주기 15 분 72 ° C에서. </li><li> 단계 3b.5의 표본 표준 2퍼센트 아가로 오스 겔을 사용하여 적절한 크기의 DNA (300-500 BP)를 선택한 후 칩 seq 사용할 수 있습니다. 샘플은 지금 -20 ° C.에 저장될 수 그것은 오염을 방지하기위한 하나의 겔에서 각 칩 샘플을 분리하는 것이 좋습니다. 샘플은 높은 처리량 시퀀싱을 위해 제출할 수 있습니다. </li></ol> 3C. Solexa 파이프라인 분석 <ol><li> 25-BP 시퀀싱 읽고는 Illumina 게놈 분석기 (GA) 파이프라인에서 얻은되었다. </li><li> 모든 읽기가 참조 시퀀스 두 불일치 최대 있도록 큰 영양 (뉴클레오 티드 데이터의 효율적인 로컬 정렬) 소프트웨어를 사용 Drosophila 게놈 (dm3)으로 정렬되었습니다. </li><li> 유니 클리 매핑 읽기는 스트림 분석을 위해 유지되었다. 여러 개의 동일한 읽기의 경우 최대 3 사본은 PCR 증폭의 편견의 가능성을 줄이기 위해 유지되었다. </li><li> GA의 파이프라인의 출력은 브라우저의 확장 가능한 데이터 (침대) 파일로 변환되었습니다. </li><li> 생성하려면시각화를위한 UCSC 브라우저에 업로드를위한 가발 파일, 우리는 창 크기 등 네 BP와 DNA를 조각 크기로 160 BP로 이전 발행물 3에서 설명한되었습니다 비단뱀 짐보 따리를 사용했습니다. </li><li> 침묵과 표현의 유전자에 Drosophila의 유전자를 분류하기 위해, 우리는 RPKM이라는 디지털 숫자 (kilobase 당 /은 exonic 지역을 병합 / 만 당 매핑된가 읽고 읽습니다) 사용됩니다. RPKM = 0과 유전자 RPKM가 ≥ 1, 낮은 적당한 높은 표현 수준 유전자로 세 subgroups로 나눌 수 표현 그룹으로 분류되었다와 침묵 그룹 및 유전자로 분류하고, 각 그룹에 대해 같은 번호를 가지고 있었다 유전자. </li><li> 히스톤 수정 수준과 유전자 발현을 비교하기 위해, 우리는 이전 게시물 3에서 설명한되었습니다 파이썬 스크립트를 사용했습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 웅을 사용하여 칩 qPCR 결과의 예 (구슬의 가방) 돌연변이<html> testes은 그림 1 4에 표시됩니다. 빵 testes에서 proliferative spermatogonia에서 spermatocytes 5, 6을 차별로의 전환에 실패 있습니다. 우리는이 조직 유형에 풍부하고 undifferentiated 배아 세포에 대한 소스로 빵 testes를 사용합니다. 이러한 남성 특정 전사 인자 87 (mst87F), 돈 주앙 (DJ) 및 퍼지 양파 (fzo)와 같은 정자 분화에 필요한 차별화의 유전자는, 빵 testes로 표현되지 않습니다. 이 유전자는 매우 억압 H3K27me3 히스톤 수정 7 (그림 1A)와 풍부한 있지만 활성 H3K4me3 히스톤 수정 8 (그림 1B), 우리가 &#39;monovalent&#39;일곱이라는 염색질 서명없는 상태입니다. H3K27me3 또는 H3K4me3 중의 농축은 constitutively 표현 Cyclin (CycA) 유전자 4 정규화에 의해 결정됩니다. 빵 돌연변이의 testes은 (그림 2) 그림 1에 표시된 qPCR 결과를 확인. 세 가지 테스트 터미널 차별화의 유전자에 대한 mst87F, DJ와 fzo과 항체의 동일한 집합 (즉 억압 H3K27me3 적극 H3K4me3)를 사용하여 콘텐츠 &quot;&gt; 칩 seq 분석 그들의 게놈 영역은 매우 H3K27me3 있지만 H3K4me3 (그림 2A-2C)로 풍부합니다. 반대로 constitutively 표현 CycA 유전자는 상당한 H3K4me3 있지만 전사 시작 사이트 (TSS) (그림 2D) 근처의 작은 H3K27me3 구속력이 있습니다. 또한, differentially 표현 유전자 네 가지 클래스 TSSs 근처 H3K27me3과 H3K4me3의 칩 프로파일은 각 히스톤 수정의 기능과 일치합니다. 다른 이름으로 그림 3A와 같이 TSSs의 H3K27me3 하류의 농축은 반대 유전자 발현 수준과 서로 관련됩니다. 침묵 유전자 반면에 높은 H3K27me3을 가지고높은 표현 유전자는 더 H3K27me3 구속력이 없습니다. 이러한 데이터는 유전자 발현에 H3K27me3의 억압 역할과 일치합니다. 반대로, TSSs 주위 ​​H3K4me3의 농축은 유전자 발현에 H3K4me3의 적극적인 역할과 일치하는 유전자 발현 수준 (그림 3B)와 반대로 상관 관계를 보여주었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig1.jpg" /> 어느 억압 H3K27me3 히스톤 변형 (A) 또는 (b) 웅 셀 - 농축 undifferentiated 돌연변 testes에서 활동중인 H3K4me3 히스톤 변형에 대한 항체를 사용하여 칩 에드 DNA의 그림 1. qPCR 분석. () 빵에 testes, 차별화의 유전자는 (Mst87F, DJ, fzo) H3K27me3 억압 히스톤 변형에 풍부합니다. (B) 분화의 유전자는 H3K4me3 활성 마크 소진됩니다. 대상 유전자 (Mst87F, DJ 또는 fzo)에서 칩 DNA의 수준 (칩 DNA / 입력)이 먼저 레바로 정상화되었다<html> 컨트롤 CycA 유전자에 칩 DNA의 엘. 오차 막대는 세 독립적인 생물의 표준 편차가 복제를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig2.jpg" /> 그림 2. UCSC 게놈 브라우저 H3K27me3의 스냅샷 및 () Mst87F가 (B) DJ와 (C) fzo, (D) CycA의 유전자.는 (D)에서 H3K27me3 강화 지역을 동그라미의 전체 게놈 영역에 걸쳐 H3K4me3 농축도의 염색질 상태를 반영 웅에 미천한 표시됩니다 중복 유전자 CG7264, testes (RPKM = 1)하지만 높은 야생 형 testes로 표현 (RPKM = 130) 8 (7에서 칩 seq 데이터). 그림 1 칩 결과의 정량 PCR 분석에 사용되는 프로브는 각 플롯의 하단에 표시된있다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . tp_upload/3745/3745fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. 칩 seq 프로필 testes 7 웅에 H3K27me3 및 H3K4me3을 사용합니다. 네 가지 유전자 그룹 (7,509 유전자)는 RNA-seq 결과 8 일 기준으로 자신의 유전자 발현 수준에 따라 분류되었다. 유전자의 대표적인 클래스들은 전사 시작 사이트 (TSSs)의 3킬로바이트 상류에 3킬로바이트 스트림의 시퀀스를 사용하여 특정 히스톤 수정의 농축을 위해 꾸몄다됩니다. 이것은 () H3K27me3 (K27)와 각 그룹에서 (B) H3K4me3 (K4) 칩 seq 분석가.의 농축의 프로필을 생성하는 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig3large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오를</a> .

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	<li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster.">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li><li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells.">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li><li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li><li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage.">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li><li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis.">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li><li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles:+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis.">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li><li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis.">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li><li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq.">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

이 프로토콜에서 언급한 칩 분석의 다양성은 생물학적으로 관련 시스템에 염색질 상태를 공부할 수있는 기회를 제공하는 다른 조직에 사용할 수 있습니다. 교양 시스템에서 세포를 이용한 칩 실험은 세포의 대량 쉽게 얻을 수 있기 때문에 수행할 편리합니다. 그러나 교양 전지는 반드시 멀티 셀룰러 환경에서 세포를 반영하지 않습니다. 살아있는 동물의 해부 조직을 이용해이 기술을 개발함으로...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 전체 미니 테아제 억제제 칵테일 </td><td> 로슈 </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> 포름 알데히드 (37 %) </td><td> Supelco </td><td> 47083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 시그마 </td><td> 78,830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes 펠릿 유봉 </td><td> 피셔 과학 </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR 정화 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 28,104 </td><td></td></tr><tr><td> 선형 polyacrylamide </td><td> 시그마 </td><td> 56575-1ML </td><td></td></tr><tr><td> 글리코겐 </td><td> Qiagen </td><td> 158,930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR 녹색 / ROX qPCR 마스터 믹스 </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> 미니 플레이트 스피너 </td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> 실시간 PCR 시스템 </td><td> 응용 Biosystem </td><td> 4,351,101 </td><td></td></tr><tr><td> 작은 볼륨 초음파 프로세서 </td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td> 모델 중단 </td></tr><tr><td> Dynabeads, 단백질 </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> 자석을 Dynamag </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> 페놀 : Chlorofrom : IAA </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentre DNA를 최종 수리 키트 </td><td> Epicentre의 Biotechnologies </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute ReactioN 정리 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 28,204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow 조각 (3 &#39;→ 5&#39;엑소-) </td><td> 뉴잉글랜드 Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4의 DNA ligase </td><td> Promega Corporation은 </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> 어댑터 oligonucleotides </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> 이점 엔드 프라이머 1.0 및 2.0 </td><td> Illumina </td><td> 1,001,783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-젤 Electorphoresis 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue

Epigenetics는 급속히 발전 분야 남아 그 염색질 상태가 서로 다른 개발 단계에서의 서로 다른 세포 유형에서 차동 유전자 발현에 기여하는 방법 연구. Epigenetic 규제는 성인의 배아 발달과 항상성 동안 세포 분화를 포함하여 생물 학적 과정의 광범위한 스펙트럼에 기여한다. epigenetic 연구에 중요한 전략은 다양한 히스톤 수정 및 염색질 요인이 유전자 발현을 조절하는 방법 검토하는 것입니다. 이것을 해결하기 위해, 염색질 Immunoprecipitation (CHIP)이 관심의 세포에있는 DNA와 특정 요인 협회의 스냅샷을 얻기 위해 널리 사용됩니다. 칩 기술은 일반적으로 재현할 데이터를 생성하기 위해 풍부하고 균질성에서 얻을 수 재료를 시작으로 교양 세포를 사용합니다. 그러나 몇 가지주의 사항이 있습니다 : 첫째, 배양 접시에있는 세포를 성장 환경은 따라서 생체내의 그것과는 차이가 있습니다살아있는 유기체의 세포 내생 염색질 상태를 반영하지. 둘째, 세포의 모든 유형은 교양 전직 생체내 될 수 있습니다. 사람들이 칩 분석을위한 충분한 자료를 얻을 수있는 세포 라인의 단지 제한된 수의이 있습니다. 여기 Drosophila 조직을 사용하여 칩 실험을 할 방법을 설명합니다. 시작 자료는 따라서 정확하게 내생 염색질 상태를 반영할 수, 살아있는 동물에서 조직을 해부하고 있습니다. 조직의 다양한 종류가있는이 방법의 적응성은 연구자 더 생물학적으로 많은 생체내 1, 2의 epigenetic 규제에 관한 관련 질문을 해결하실 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱 (칩 seq)와 함께이 방법을 결합하면 더욱 연구자 epigenomic 풍경을 얻을 수 있습니다.

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

최근 높은 처리량 시퀀싱 기술은 크게 염색질 Immunoprecipitation (칩) 실험의 감도를 증가하고 정화 셀 또는 해부 조직을 사용하여 응용 프로그램을하라는 메시지가있다. 여기에 칩 기술을 사용하는 방법을 윤곽을 그리다<em&gt; Drosophila</em잘 특징으로 생물 학적 시스템에서 내생 염색질 상태를 해결할 수&gt; 조직.

사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-using-drosophila-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

25.0K 조회수.  Johns Hopkins University. 최근 높은 처리량 시퀀싱 기술은 크게 염색질 Immunoprecipitation (칩) 실험의 감도를 증가하고 정화 셀 또는 해부 조직을 사용하여 응용 프로그램을하라는 메시지가있다. 여기에 칩 기술을 사용하는 방법을 윤곽을 그리다 Drosophila 조직.

비디오: Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포의 Patterning

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

연구

생물학

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

인간 두뇌 조직에 대한 염색질 어세이

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Methylated DNA의 Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

의 양적 비교 CIS</em트렌스 제닉에서> - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Methods Article

사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직