Die Autoren danken Herrn Dr. Keji Zhaos Labor (NIH / NHLBI) für ihre Hilfe bei der Bereitstellung von Sequenzierung Ergebnisse danken. Wir möchten auch, um die UCSC Genom-Projekt für die Nutzung der Genom-Browser zu visualisieren abgebildet Sequenzierung liest danken. Diese Arbeit wurde durch die NIH R00HD055052 Pathway worden zu Independence Award und R01HD065816 aus NICHD, der Lucile Parkard-Stiftung, und der Johns Hopkins University Anschubfinanzierung zu XC unterstützt

(Der gesamte Chip Prozedur dauert etwa zwei Tage. Vorbereitung der ChIP-Bibliotheken für Hochdurchsatz-Sequenzierung dauert weitere 2-3 Tage.) 1. Bereiten Sie sezieren und Tissue für Chip-Technologie (~ 1 Mio. Zellen) <ol><li> Sezieren Gewebe von Interesse (zB 200 Paare von Drosophila Hoden) in kaltem PBS + 1x Protease-Inhibitor (auflösen 1 Kugel von Protease-Inhibitor-Cocktail in 1,5 ml 1x PBS zu 7x Stammlösung zu erhalten) + PMSF (Endkonzentration 100 pg / mL). Das Gewebe spülen zweimal und resuspendieren Gewebe in 200 ul der gleichen PBS-Lösung mit Inhibitoren. </li><li> Um das Beispiel zu beheben, fügen 5,5 ul 37% Formaldehyd (Formaldehyd in warmen 37 ° C Wasserbad für 1 min vor der Verwendung). Bei 37 ° C für 15 Minuten, alle 5 Minuten Wirbel dazwischen. </li><li> Legen Sie die Probe auf Eis für das Gewebe, um für 2 Minuten absitzen. Spülen Sie 2x mit 450 ul PBS (mit Protease-Inhibitoren und PMSF). Probe kann nun sein Geschäftd bei -20 ° C Wiederholen Sie Dissektion mehrmals um genügend Material für ChIP zu erhalten. </li></ol> 2. Bereiten Überstand mit Protein-DNA-Konjugation für Chip-Assay <ol><li> Kombinieren Sie genug Probe aus Schritt 1.3 in einer 1,75 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Entfernen von PBS Gewebeprobe. Zugabe von 200 ul Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM CaCl 2, 0,2% Triton X-100 oder NP-40, 5 mM Butyrat und 1x Proteinase-Inhibitor-Cocktail). In frischen PMSF Stammlösung zu Lysepuffer (PMSF Endkonzentration von 0,5 mM). Homogenisieren mit blauen Homogenisator (Fisher Cat # 749521-1590) bis zum Gewebe vollständig distanzieren, ohne Aggregation, bei RT (Raumtemperatur) für 10 Minuten inkubieren. </li><li> Beschallung: Verwendung Mikrospitze Sonicator (Misonix HS-XL200) in Kraft 20. Mit Ultraschall für 10 Sekunden und liegen auf Eis für 50 Sekunden. Wiederholen Sie 4-5 mal (optimale Beschallung Zeit sollte empirisch ermittelt werden, da längere Beschallung kleinere Fragmente erhalten werden. Für CHIP Verwendung von Antikörpern gegen Histone Modifikationen, die wir normalerweise beschallen Chromatin auf ca. 200-300 bp; für Transkriptionsfaktor oder Chromatin-Regler (z. B. Polycomb Proteine), die wir normalerweise zu beschallen Chromatin 200-1000 bp. Allerdings sollte die optimale Fragmentgröße empirisch getestet werden. Hinweis: Halten Sie das Röhrchen auf Eis AUCH WÄHREND Beschallung für die Stichprobenziehung aus erwärmt wird! </li><li> Verdünnen der Probe mit indem 1,8 ml RIPA-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,1% Na-Desoxycholat, 1% Triton X-100, mit Protease-Inhibitoren PMSF und bei der gleichen Konzentration wie beschrieben vorher). Sparen Sie 40 ul als Input-Steuerung durch Zugabe von 2 ul 5 M NaCl und Inkubation bei 65 ° C über Nacht (O / N) zur Vernetzung umzukehren. </li><li> Um Antikörper zu konjugieren Perlen, dann werden 40 ul Protein A-Kügelchen in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, fügen Sie dann 600 ul PBS und Rock bei 4 ° C für 2 Minuten, gelten Perlen Magnet und entfernen Überstand. Geben Sie 100 ul PBS und den Antikörper von Interesse (Menge des Antikörpers sollte bestimmt werden, empitisch). Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder 4 ° C für 4 Stunden. </li><li> Entfernen Sie aus Perlen von Magneten und Überstand 1ml Chromatin Auszug aus Schritt 2.4 an den Beads. Drehen bei 4 ° CO / N </li><li> Bewerben Chipprobe zu Magnet und entfernen Überstand. Waschen der Kügelchen mit der folgenden Puffer bei 4 ° C für 10 Minuten: 2x mit 1 ml RIPA-Puffer [1,89 ml &#39;RIPA Puffer&#39; + 315 ul 7x Proteaseinhibitoren PMSF + 20 ul]; 2x mit 1 ml RIPA-Puffer + 0,3 M NaCl [1,89 ml RIPA-Puffer + 220 ul 3 M NaCl]; 2x mit 1 ml LiCl-Puffer (0,25 M LiCl, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC); 1x mit 1 ml 1x TE + 0,2% Triton X-100; 1x mit 1 ml 1x TE. </li><li> Zu vernetzen rückgängig zu machen, die Perlen zu resuspendieren in 100 ul TE-Puffer + 3 ul 10% SDS + 5 ul Proteinase K (20 mg / mL). Inkubation bei 65 ° CO / N. </li><li> Bewerben Perlen an Magneten und den Überstand in ein neues Röhrchen. Der Überstand enthält Ihre DNA-Probe. Waschen Sie Perlen mit 100 ul TE + 0,5 MNaCl und kombinieren die beiden Überstand. </li><li> Phenol-Chloroform extrahieren die DNA-Probe. Fügen Sie 200 ul Phenol: Chlorofrom: IAA (25:24:1)-Mix und Wirbel. Zentrifugieren bei 14k für 5 Minuten bei RT. Alternativ können DNA extrahiert unter Verwendung von Qiagen PCR Purification Kit werden. </li><li> Die überstehende / wässrige Schicht in ein neues Röhrchen, und geben linearen Acrylamid bis zu einer Endkonzentration von 20 ug / ml (Alternativ 1 ul Glykogen bei 20 mg / ml pro 1 ml des Überstandes können ebenfalls verwendet werden. Glycogen für verwendet wird anschließende qPCR oder PCR-Analysen während lineare Acrylamid-Assays für die Sequenzierung verwendet wird.) Geben Sie 20 ul 3 M NaOAc und 500 ul 100% EtOH. Gut mischen und inkubieren bei 80 ° C für 10 Minuten. Spin bei maximaler Geschwindigkeit für 20 Minuten bei 4 ° C </li><li> Überstand abnehmen und waschen mit 300 ul 70% EtOH. Der Luft trocknen und resuspendieren Probe in 50 ul TE-Puffer. Probe kann nun bei -20 ° C gelagert werden Probe für die quantitative PCR (qPCR)-Tests (1) verwendet werden. </li></ol> 3a. Analysieren ChIP-ED-DNA mittels qPCR <ol><li> Verdünnen Sie genomischer DNA unter der folgenden Konzentration, um eine Standardkurve zu machen: unverdünnt, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000. </li><li> Für jedes Primerpaar einrichten qPCR in zweifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte mit genomischer DNA aus Schritt 3a.1, Input-Steuerung und ChIP-ED-DNA: 10 ul 2x SYBR PCR-Mix (Fermentas, K0222); 1 ul 10 uM Vorwärts-Primer; 1 ul 10 uM Reverse-Primer; x ul ChIP-ED-DNA (Input-Steuerung, oder genomische DNA); y ul Nuclease-freiem H 2 O um das Reaktionsvolumen auf 20 ul einzustellen. </li><li> Drehen Sie den 96-Well Platte mit Mini-Plate Spinner (Labnet). </li><li> Führen Sie mit qPCR ABI 7300 real time PCR-System (oder andere Echtzeit-PCR-Systeme) mit der folgenden Bedingung: Stufe 1: 50 ° C für 2 min, 1 Zyklus; Stufe 2: 95 ° C für 10 min, 1 Zyklus; Stufe 3: 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 1 min, 40 cycles; Stufe 4 (Dissoziationsstufe): 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 1 min, 95 ° C für 15 s. </li><li> Überprüfen Sie die Dissoziationskurve: Ein Peak bei der thermischen Spaltung Grundstück deutet auf eine einzelne Fragment aus der PCR-Reaktion. Mehr als ein Peak auf nicht-spezifische Produkt mit dem Primerpaar, sollten die qPCR-Daten nicht verwendet werden. </li><li> Bestimmen der linearen Phase des exponentiellen Amplifikation der PCR-Reaktion für jeden Primer, durch Berechnung der Formel, die DNA-Menge löst gemäß der Ct-Wert (Schwellenwert-Zyklus)-Wert, der auf der Standardkurve unter Verwendung der Reihe von verdünnten genomischer DNA in 3a basiert. 1. </li><li> Wenn der Ct-Wert von CHIP-ED-DNA und Input-Steuerung im linearen Bereich der Ct-Wert sind, berechnen die Anreicherung von ChIP-ED-DNA-Technologie bzw.-Eingang, nach dem Verdünnen Faktor von CHIP-ED-DNA und Eingabekontrolle in 2.4. </li></ol> 3b. Amplify ChIP-ED-DNA für die Hochdurchsatz-Sequenzierung. <ol><li> End-Reparatur von Chip-ED-DNA-Mix (Verwenden SieEpicentre DNA-END-Reparaturset), bis auf Eis gesetzt: 1-34 ul genomische DNA aus Schritt 2.12 (0,1 bis 5 ug) 5 ul 10x Puffer End Reparatur 5 ul 2,5 mM dNTP-Mix 5 ul 10 mM ATP x ul H 2 O um das Reaktionsvolumen auf 49 ul anzupassen 1 ul End-Reparatur-Enzym-Mix (T4 DNA-Polymerase + T4 Polynukleotid-Kinase) Inkubieren für 45 Minuten bei RT. Entschlacken Reaktion unter Verwendung von Qiagen MinElute Reaction Cleanup Kit. Man eluiert in 30 ul Elutionspuffer (EB). </li><li> In A-Überhänge an das 3&#39;-Ende: 30 ul eluierte DNA aus Schritt 3b.1 5 ul 10x NEB Buffer # 2 10 ul 1 mM dATP 2 ul dH 2 O 3 ul 5 U / ul Klenow-Fragment (3 &#39;→ 5&#39; Exo-) Inkubieren für 30 Minuten bei 37 ° C Entschlacken Reaktion unter Verwendung von MinElute ReactionCleanup Kit. Man eluiert in 10 ul EB. </li><li> Solexa Linkerligation: 10 ul eluierte DNA aus Schritt 3b.2 10 pl ddH 2 O 2.5 &amp;mu; l 10x T4 DNA-Ligase-Puffer 1 ul Adapter Oligo-Mix von Illumina (1/10-diluted ab Lager lieferbar) 2,5 ul T4 DNA-Ligase (400 Einheiten / ul) Inkubation für 1 Stunde bei RT. Entschlacken Reaktion unter Verwendung von MinElute ReactionCleanup Kit. Man eluiert in 20 ul EB. Probe kann nun bei -20 ° C gelagert werden </li><li> Führen Sie den eluierten DNA-Probe von Schritt 3b.3 mit dem E-Gel-Apparatur. Isolieren von 300 bis 500 bp-Bande im Gel und Reinigung unter Verwendung des Qiagen Gel Extraction Kit (dieser Schritt entfällt die ~ 125 bp selbst ligierten Linker aus dem Adapter Oligo-Ligation). Man eluiert in 12 ul EB. </li><li> Amplify Bibliothek unter Verwendung von gepaarten-End-(PE)-Primer von Illumina: 10,5 ul der eluierten DNA aus Schritt 3b.4 12,5 ul Mastermix (2X Phusion HF, Finnzymes) 1 ul PE1 PCR-Primer 1 1 ul PE2 PCR-Primer 2 PCR-Bedingungen: 98 ° C für 30 Sek. (98 ° C 10 sec, 65 ° C 30 sec, 72 ° C 30 sec), 20 Zyklen wiederholen 72 ° C für 5 Minuten. </li><li> Proben aus Schritt 3b.5 für ChIP-seq nach der Auswahl der richtigen Größe DNA (300-500 bp) unter Verwendung des 2% igen Agarosegel verwendet werden. Probe kann nun bei -20 ° C gelagert werden Am besten ist es jeden Chip Probe auf einem einzigen Gel zur Vermeidung von Kontaminationen zu isolieren. Die Proben können für Hochdurchsatz-Sequenzierung eingereicht werden. </li></ol> 3c. Solexa Pipeline-Analyse <ol><li> Der 25-bp-Sequenzierung liest wurden aus dem Illumina Genome Analyzer (GA)-Pipeline erhalten. </li><li> Alle gelesen wurden zu dem Drosophila-Genoms (dm3) unter Verwendung des ELAND (Efficient Local Alignment der Nukleotid-Daten) Software ausgerichtet sind, so dass bis zu zwei Fehlpaarungen mit der Referenzsequenz. </li><li> Einzigartig abgebildet mal gelesen wurden für Downstream-Analyse erhalten. Für mehrere identische mal gelesen wurden bis zu drei Exemplare erhalten, um die Möglichkeit von Verzerrungen von PCR-Amplifikation zu reduzieren. </li><li> Der Ausgang des GA-Pipeline wurde in Browser erweiterbare Daten (BED) konvertiert. </li><li> So generierendie Perücke Dateien zum Upload auf die UCSC Browser zur Visualisierung verwendeten wir eine Python-Tasche, die in einer früheren Veröffentlichung 3 wurde mit 4 bp als der Bildschirmgröße und der 160 bp DNA-Fragment wie die Größe beschrieben. </li><li> Um Drosophila-Gene in stille und äußerte Gene klassifizieren, verwendeten wir eine digitale Zahl genannt RPKM (liest / pro Kilobasen zusammengeführt exonische Region / pro Million mapped liest). Gene mit RPKM = 0 wurden als stille Gruppe und Gene mit RPKM ≥ 1 wurden in die Gruppen zum Ausdruck, die in drei Untergruppen, wie Gene, die mit niedrigen, mittleren und hohen Expressionsniveaus klassifiziert werden können eingestuft, und jede Gruppe hat etwa die gleiche Anzahl von Gene. </li><li> Um die Histonmodifikationen Ebene und Genexpression zu vergleichen, haben wir ein Python-Skript, das in einer früheren Veröffentlichung 3 beschrieben wurde. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Beispiele für ChIP-qPCR-Ergebnisse mit BAM (Beutel Murmeln)-Mutante<html> Hoden sind in Abbildung 1 4 gezeigt. In Bam Hoden, es zu einem Ausfall beim Übergang von der proliferativen Spermatogonien zu differenzieren Spermatozyten 5, 6. Wir verwenden bam Hoden als Quelle für undifferenzierte Keimzellen, die in diesem Gewebetyp angereichert sind. Differenzierung Gene für Spermien Differenzierung erforderlich, wie männlich-spezifischen Transkriptionsfaktors 87 (mst87F), Don Juan (dj) und Fuzzy-Zwiebel (FZO) sind nicht in bam Hoden exprimiert. Diese Gene sind mit der repressiven H3K27me3 Histonmodifikationen 7 (Abbildung 1A) angereichert, sind aber ohne die aktive H3K4me3 Histonmodifikationen 8 (Abbildung 1B), ein Chromatin-Signatur wir als &quot;monovalenten&quot; 7. Die Anreicherung von entweder H3K27me3 oder H3K4me3 wird durch Normalisierung zu einem konstitutiv exprimierten Cyclin A (CycA)-Gen 4 bestimmt. Inhalt &quot;&gt; Chip-seq-Analyse unter Verwendung der gleichen Menge von Antikörpern (dh repressive H3K27me3 und aktive H3K4me3) mit BAM-Mutante Hoden (Abbildung 2) die qPCR Ergebnisse in Abbildung 1 dargestellt validiert. Für die drei untersuchten Gene mst87F terminalen Differenzierung, DJ und FZO , ihre genomische Regionen stark mit H3K27me3 aber nicht H3K4me3 (2A-2C) angereichert. Im Gegensatz dazu weist das konstitutiv exprimierte Gen signifikante CycA H3K4me3 wenig H3K27me3 Bindung nahe der Transkriptionsstartstelle (TSS) (2D). Darüber hinaus sind die Profile der ChIP H3K27me3 und H3K4me3 in der Nähe der TSS von vier Klassen von differentiell exprimierten Genen, die der Funktion der einzelnen Histonmodifikationen. Wie in 3A gezeigt ist, ist die Anreicherung von H3K27me3 stromabwärts des TSS invers mit Genexpression korreliert. Die stillen Gene haben die höchste H3K27me3 während diehoch exprimierte Gene haben keine H3K27me3 bindend. Diese Daten sind konsistent mit der repressiven Rolle der H3K27me3 auf die Genexpression. Im Gegensatz dazu zeigten die Anreicherung von H3K4me3 um die TSS den umgekehrten Korrelation mit Genexpressions-Ebene (3B), im Einklang mit der aktiven Rolle der H3K4me3 auf die Genexpression. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig1.jpg" /> Abbildung 1. QPCR Analyse der ChIP-ED-DNA unter Verwendung von entweder Antikörper gegen das repressive H3K27me3 Histonmodifikationen (A) oder aktiv H3K4me3 Histon-Modifikation (B) in undifferenzierten Zellen angereicherte bam mutierten Hoden. (A) in der BAM Hoden, Differenzierung Gene (Mst87F, dj, FZO) werden mit dem H3K27me3 repressive Histon-Modifikation bereichert. (B) Differentiation Gene sind mit H3K4me3 aktive Marke erschöpft. Das Niveau der Chip-DNA (ChIP DNA / Eingang) auf das Ziel-Gen (Mst87F, DJ oder FZO) wurde zum ersten Mal an den lev normalisiert<html> el der Chip-DNA an der Steuerung CycA Gen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung aus drei unabhängigen biologischen Replikate. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig2.jpg" /> Abbildung 2. UCSC Genom-Browser Momentaufnahmen H3K27me3 und H3K4me3 Anreicherung über die gesamte genomische Regionen (A) Mst87F (B) dj und (C) FZO, (D) CycA Gene. Die eingekreisten H3K27me3 angereicherte Region (D) spiegelt die Chromatin Status ein überlappender Gen CG7264, die in der BAM niedrig exprimiert wird Hoden (RPKM = 1), aber hoch in Wildtyp-Hoden exprimiert (RPKM = 130) 8 (ChIP-seq Daten aus 7). Sonden in der quantitativen PCR-Analyse von ChIP Ergebnisse in Abbildung 1 verwendet werden, am unteren Rand jeder Parzelle beschriftet. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . tp_upload/3745/3745fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. ChIP-seq Profile mit H3K27me3 und H3K4me3 in bam Hoden 7. Die vier Gruppen Gens (Gene 7509) wurden entsprechend ihrer Genexpression auf RNA-seq Ergebnisse 8 klassifiziert. Die repräsentativen Klassen von Genen sind für die Anreicherung eines bestimmten Histon-Modifikation aufgetragen, mit Sequenzen aus 3kb stromaufwärts bis 3kb hinter ihren Transkriptionsstartstellen (TSS). Dies erzeugt ein Profil der Anreicherung von (A) H3K27me3 (K27) und (B) H3K4me3 (K4) ChIP-seq Analysen in jeder Gruppe. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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	<li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster.">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li><li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells.">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li><li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li><li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage.">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li><li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis.">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li><li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles:+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis.">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li><li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis.">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li><li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq.">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Vielseitigkeit der Chip-Analysen in diesem Protokoll behandelt werden, können auf verschiedenen Geweben, die eine Gelegenheit, die Chromatin-Zustand in einer biologisch relevanten System zu studieren bietet eingesetzt werden. Chip-Experimenten unter Verwendung von Zellen aus kultivierten Systeme sind bequem durchgeführt werden, da große Menge von Zellen leicht erhalten werden kann. Jedoch nicht kultivierten Zellen nicht notwendigerweise Zellen in einem mehrzelligen Umgebung. Durch die Entwicklung dieser Technik m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Kompletter Mini Protease Inhibitor Cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyd (37%) </td><td> Supelco </td><td> 47.083 U- </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pistill </td><td> Fischer Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Linearem Polyacrylamid </td><td> Sigma </td><td> 56575-1ML </td><td></td></tr><tr><td> Glykogen </td><td> Qiagen </td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green / ROX qPCR Master Mix </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> Mini Plate Spinner </td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> Real-time PCR-System </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td> Small Volume Ultraschall-Prozessor </td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td> Modell eingestellt </td></tr><tr><td> Dynabeads, Protein A </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> Dynamag Magnet </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> Phenol: Chlorofrom: IAA </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentre DNA-END-Reparatur-Kit </td><td> Epicentre Biotechnologies </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Reaction Reinigungs Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow-Fragment (3 &#39;→ 5&#39; Exo-) </td><td> New England Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA-Ligase </td><td> Promega Corporation </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> Adaptor-Oligonukleotiden </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Gepaart-Ende-Primer 1,0 und 2,0 </td><td> Illumina </td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-Gel Elektrophorese-System </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue

Epigenetik bleibt ein sich schnell entwickelndes Feld, das untersucht, wie das Chromatin Zustand zu differentiellen Genexpression in verschiedenen Zelltypen in verschiedenen Entwicklungsstadien beiträgt. Epigenetische Regulation trägt zu einem breiten Spektrum an biologischen Prozessen wie Zelldifferenzierung während der Embryonalentwicklung und Homöostase im Erwachsenenalter. Eine kritische Strategie in der epigenetischen Studien ist zu untersuchen, wie verschiedene Histon-Modifikationen und Chromatin Faktoren Genexpression zu regulieren. Um dieses Problem anzugehen, wird Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) weit verbreitet, um einen Schnappschuss des Vereins von besonderer Faktoren, die mit DNA in den Zellen von Interesse zu erhalten verwendet. Chip-Technik häufig verwendet kultivierten Zellen als Ausgangsmaterial, das in Hülle und Fülle und Homogenität erhalten werden können, um reproduzierbare Daten zu generieren. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen: Erstens ist die Umgebung, um Zellen in Petri-Schale wachsen anders als in vivo, kann somitspiegeln nicht die endogenen Chromatin Zustand der Zellen in einem lebenden Organismus. Zweitens kann nicht alle Arten von Zellen ex vivo kultiviert werden. Es gibt nur eine begrenzte Anzahl von Zelllinien, von denen die Menschen genügend Material für die Chip-Assay erhalten können. Hier beschreiben wir eine Methode, um ChIP Experiment mit Drosophila Gewebe zu tun. Das Ausgangsmaterial wird Gewebe aus dem lebenden Tier seziert, so kann genau die endogenen Chromatin Zustand. Die Anpassungsfähigkeit dieser Methode mit vielen verschiedenen Arten von Gewebe ermöglicht es Forschern, viel mehr biologisch relevanten Fragen rund um epigenetische Regulation in vivo 1, 2 anzugehen. Die Kombination dieser Methode mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird weiter Forschern erlauben, eine epigenomischen Landschaft zu erhalten.

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Kürzlich Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie hat stark Empfindlichkeit von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Experiment erhöht und aufgefordert ihre Anwendung unter Verwendung von gereinigten Zellen oder Gewebe präpariert. Hier haben wir beschreiben eine Methode zur Chip-Technik mit nutzen<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe, das den endogenen Chromatin Zustand in einem gut charakterisierten biologischen System adressieren kann.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

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Biology

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

25.0K Aufrufe.  Johns Hopkins University. Kürzlich Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie hat stark Empfindlichkeit von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Experiment erhöht und aufgefordert ihre Anwendung unter Verwendung von gereinigten Zellen oder Gewebe präpariert. Hier haben wir beschreiben eine Methode zur Chip-Technik mit nutzen Drosophila Gewebe, das den endogenen Chromatin Zustand in einem gut charakterisierten biologischen System adressieren kann.

Serie: Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Strukturierung von embryonalen Stammzellen mit dem Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Forschung

Biologie

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Methylierte DNA Immunpräzipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Methods Article

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe