우리는 그래픽 작업을 위해 크리스틴 존슨 감사합니다.

동물을 포함한 모든 프로토콜에 제출하고 승인 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 보스턴 어린이 병원에와 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 권고에 따라 실시된다. 절차를 수행하는 동안 멸균 계측 및 무균 techniqure을 사용하십시오. 펠렛의 1 준비 <ol><li> 수크 랄 페이트 10 ㎎ 및 멸균 구부러 주걱 hydron의 60 mg의 달다. 별도의 microcentrifuge 튜브에 배치합니다. </li><li> 멸균 10cm 접시에 메쉬의 1cm 사각형 조각을 놓습니다. 그래서 얕은 뚜껑에 달려 메쉬 반전. 옆으로 설정합니다. </li><li> 적어도 10 분 동안 hydron와 소용돌이에 에탄올 500 μl를 추가합니다. </li><li> 간단히 수크 랄 페이트와 소용돌이에 : 성장 인자 (bFGF를 20 μg, VEGF에 대한 50 μg 기준)의 해당 금액을 추가합니다. 보관 성장 인자1 ㎎ / ㎖의 농도에서 -80 ° C 냉동고. 추가 액체 볼륨은 완전히 묻힌 수크 랄 페이트을 보장하기 위해 20 μl를 최소해야하지만, 50 μl를 초과하지 않아야합니다. 큰 부피는 다음 단계에서의 액체의 증발이 어렵게 만든다. </li><li> 혼합물이 완전히 건조 될 때까지 사용되는 액체의 양에 따라 일반적으로 30 ~ 50 분, 낮은에서 설정 한 원심 증발기로 수크 랄 페이트 혼합물을 놓습니다. <ol><li> 멸균 주걱의 테이퍼 끝 잔류 수분의 혼합물을 확인합니다. 혼합물은 &quot;사각 사각&quot;느껴야한다. </li></ol></li><li> 튜브 내에서 수크 랄 페이트 혼합물을 분리시킨 주걱의 테이퍼 끝을 사용합니다. </li><li> 수크 랄 페이트에 hydron의 10 μl를 추가합니다. <ol><li> 때문에 hydron의 점성 특성으로 200 μL 피펫 팁의 끝을 절단 한 후 그려 다시 피펫 팅 및 수크 랄 페이트에 추가하기 전에 10 μl를 놓습니다. </li></ol></li><li> 신속하게 구부러진 말다툼을 사용울라는 hydron 및 수크 랄 페이트를 혼합 튜브에서 제거합니다. <ol><li> 절곡 주걱 끝의 바닥 측을 따라 혼합물을 모아서 튜브의 벽을 따라 주걱을 그리면서 다음 튜브를 회전한다. 이 단계가 효율적으로 수행해야하므로, 혼합물을 신속하게 건조된다. </li></ol></li><li> 제자리에 고정 집게를 사용하여 제조 된 메쉬 상 혼합물을 확산. 혼합물에도 층일과 메쉬의 구멍에 기입한다. </li><li> 튜브 포함 hydron로 구부러진 주걱을 담그고 메쉬가 코트에게 양면을 사용합니다. </li><li> 접시의 가장자리에 측면에 기울고 코팅 된 메쉬를 넣고 30 ~ 45 분 동안 실온에서 건조 할 수 있습니다. </li><li> -20 ° C의 냉동고에서 메시를 놓거나 다음 단계로 바로 진행합니다. 접시 내부에 메쉬를 유지합니다. </li><li> 큰 페트리 접시, 뚜껑의 내부에 35mm 접시를 놓습니다. 신중하게 떨어져 35mm의 접시 위에 메쉬의 섬유를 당겨 집게의 쌍을 사용합니다. 길 잃은 펠릿 C이 단부에 큰 접시에서 수집 될 수있다. <ol><li> 범위에 균일 알약을 확인합니다. 따라서 프로세스는 bFGF에 대한 펠릿 당 표준 투여 량을 대략 250 펠릿을 산출하고 VEGF는 각각 80, 200 NG NG이다. </li></ol></li><li> 최대 3 개월 -20 ° C 냉동고에서 35mm 접시에 보관 펠렛. </li></ol> 펠렛의 2 외과 이식 <ol><li> 운영 현미경 수술 영역을 설정합니다. </li><li> AVERTIN (400 ~ 500 ㎎ / ㎏, 복강 내)와 마우스를 마취 등의 눈이 볼 수 현미경으로 마우스를 놓습니다. 마취의 충분한 수준을 보장하기 위해 발가락 핀치를 수행합니다. </li><li> 안구 꼭대기 proparacaine 용액 1 방울을 배치하여 마우스를 마취 눈. 20 ~ 30 초 정도 기다렸다가 거즈 패드를 가볍게 두 드리십시오. </li><li> 흠집이 생길 수 #와 포셉과 눈 사이의 피부를 떠날 특정되는 한 보석상의 집게를 마우스 눈을 Proptose. 이 올바르게 적용 압력을 판단하는 것이 중요합니다.60; 너무 단단히 눈을 잡고 너무 눈 수술 중 이동할 수 보류를 느슨하게하면서, 빨간색과 자극이 될 원인이됩니다. </li><li> 각막으로 각막 윤부에서 약 1mm를 절개를하기 위해 30 ° microknife를 사용합니다. 절개의 길이는 1 ~ 2 mm 이상이어야한다. 절개는 midstroma에 상피층을 넘어 침투 깊이만큼 있지만, 눈을 파열 너무 깊이하지해야합니다. </li><li> 절개에 수직 인 포켓을 만들기 위해 폰 그라프 칼을 사용한다. <ol><li> 절개 사이트에서 각막 층 아래에​​ 칼을 밀어 부드럽게에서 칼을 작동하므로 주머니를 형성하는 공간을 확대 절개을 따라 이동합니다. 그것은 눈의 곡률로 작업 할 수있을뿐만 아니라, 마우스를 이동하는 데 도움. 눈을 파열 방지하기 위해 끝이 아래로 밀어하지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> proparacaine와 # 5 보석상의 집게를 적신 접시에서 펠렛을 선택합니다. 눈에 펠릿을 넣습니다. </l난&gt; <li> proparacaine와 폰 그라프 칼을 적셔하고 고무하고 유연하게 펠릿에 액체의 일부를 전송합니다. 거즈 패드 나 면봉으로 과도한 습기를 제거합니다. </li><li> 각막 층 아래 내부를 밀어 폰 그라프 칼을 사용하여 주머니에 펠릿을 넣습니다. 전체 펠릿 내부되면, 펠렛의 안전을 확인하기 위해 사이트를 통해 폰 그라프 칼의 평평한면을 실행합니다. </li><li> 코트 트리플 항생제 연고와 눈. </li><li> 위에 마우스를 켜고 반대 눈 수술을 반복합니다. </li></ol> 각막 신생 혈관의 3 정량화. 시간의 집합 기간 동안 선박을 개발하기 위해 동물을 둡니다. 용기 등급의 일이 사용 성장 인자에 따라 달라집니다. 학년의 bFGF는 일 6 일에 (5)와 약한 VEGF에 주입의 일이 일 0입니다. <ol><li> AVERTIN와 마우스 (400 ~ 500 ㎎ / ㎏, 복강 내)를 마취. </li><li> GRA 용 세극등 현미경을 사용땡. 한 눈은 혈관이 성장하는데 유독 눈의 둘레 선박의 길이와 거리를 정량화하는 측정 보조 장치로서 사용 접안 렌즈 내의 십자선, 선이있다. <ol><li> 그래서 눈은 바로 앞 펠릿 눈에 볼 마우스를 위치, 범위의 앞에 마우스를 잡습니다. 피부는 얼굴에 체결과 눈이 약간 proptosed되도록 엄지 손가락과 집게 손가락 사이의 머리를 안정. </li></ol></li><li> 윤부 혈관을 따라 직접 펠릿 아래의 십자선의 y 축 놓습니다. 펠릿을 향해 상향 분지 혈관의 길이를 측정한다. mm의 십분의이 측정을 기록하고 선박 길이 (VL) (그림 1A)를 지정합니다. </li><li> 이 선박은 싹 것을 눈 주위의 거리가 분명이되도록 마우스 나 십자선를 돌립니다. 그것은 12 지정이 번호 클럭 시간 (CH) (그림 1을 통해 하나의 간격 시계 얼굴과 눈을 생각하는 가장 쉬운 방법입니다B). 그것은 전체 번호 또는 0.25 (예를 들면, 2, 2.25, 2.5 또는 2.75)의 분수를 할 수 있습니다. 참고 : CH는 주관적이다. 예를 들어, 일부는 다른 용기 길이가 절반 최대 인 지점에서의 측정을 중지 할 수있는 동안 윤부로부터 발아 모든 선박을 포함하는 눈 주위의 거리를 측정 할 수있다. 중요한 요소는 한 학년에 선택하는 방법과 일치하는 것입니다. </li></ol><img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> 각막 혈관 신생의 정량도 1. (A) 80 ng의 bFGF로 펠렛 C57BL / 6J 마우스 혈관 길이를 측정하도록 배향 세극등 레티클을 도시에 이식한다. VL = 0.9 mm. (B) 같은 눈 보여주는 세극등 레티클은 시계 시간을 측정하기 위해 회전. CH = 3.25. 계산 된 혈관 영역 = 1.84mm 2. 이 이미지들은 디지털 십자선 회로도를 추가 할 수 있도록 향상되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="5"><li> 타원형의 영역을 기반으로 아래의 식을 이용하여 혈관 영역 (VA), 계산 익스프레스 VA 제곱 밀리미터 (참고, 그것은 채점 할 때이 점을 명심하도록. 도움이된다). 수식은 다음과 같습니다 선박 세로 x 시계 시간 X 0.2 π = 선박 지역 </li></ol>

<ol>
	<li>Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+bovine+vascular+endothelial+cells:+fibroblast+growth+factor+as+a+survival+agent.">Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).</li><li>Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissues+contain+chemoattractants+for+vascular+endothelial+cells.">Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells.</a> Nature. 288, 483-484 (1980).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+response+of+FGF-2+for+lymphangiogenesis.">Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).</li><li>Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+suppression+of+angiogenesis+following+radiation+exposure+is+independent+of+hematopoietic+reconstitution.">Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution.</a> Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).</li><li>Turner, P. V., Albassam, M. 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저자가 공개하는 게 없다.

성공적인 각막 분석을 수행하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 이식되는 선박을 자극 할 수있는 균일 한 알약을하고있다. 펠릿 제조의 가장 중요한 부분)은 반송파없이 성장 인자를 사용하는 일이다; 2) 펠릿 주조 메쉬 에펜 도르프 튜브에서 신속하지만 신중 최종 혼합물을 이동) 및 수크 랄 페이트 hydron 3과 성장 인자의 양호한 혼합을 보장한다. 그것은 &quot;더미&quot;펠릿 기술을 연?...

혈관 신생 과정은 새로운 혈관의 형성은 기존의 것들을 형성, 매우 복잡하고 혈관 발아와 형태 형성의 여러 단계를 제어하는​​ 여러 내인성 인자에 의해 조절된다. 혈관 신생 인해 프로 및 항 - 혈관 신생 인자의 균형의 변화, 통상적으로 정지 상태를 유지 맥관 밸런스에 트리거된다. 성인의 혈관 신생은 여성의 난소주기 동안이나 같은 상처 치유 및 조직 재생 등의 수리 과정에서 특정 생리 학적 조건에서 발생합니다. 그러나, 또한 악성 종양,자가 면역 질환 및 염증성 상태를 포함한 여러 병리 상태의 특징이다. 이러한 생리 학적 및 병리학 적 상태에서 혈관 신생의 참여는 연구와 치료를위한 매력적인 대상의 중요한 주제 있습니다. 때문에 혈관의 복잡성과 여러 가전의 참여에모델을 한정 남아 독특한 생체 미세 요점을 되풀이 할 수 관내 내피 세포, 혈관 주위 세포, 순환 세포와 간질 세포를 포함하는 과정에서 LLS와 요인. 혈관 신생의 체외 분석의 주요 크게 내피 세포에 직접적인 영향을 관찰하고 통제 된 조건에서 혈관 신생 과정의 특정 단계를 측정에 초점을 맞추고있다. 이러한 분석법은 내피 세포 증식 1, 마이그레이션이, 네트워크 형성 3, 관 형성 (4)의 정량화 및 타원체 5 돋아을 포함한다. 생체 내 모델을 시험 관내 것과 달리, 더 복잡하고 다양한 조직 세포 유형을 포함, 예 되 대동맥 링 분석 6. 생체에 존재하는 역시, 다른 시스템과 마찬가지로 순환 세포의 기여 및 내피 세포의 천연 기질을 캡처 할 수있다. 시도많은 개선되지만, 마이크로 유체 시스템 (7)을 사용하여 수행되는 생체 내 세팅 그러나 심지어 이러한 분석법을 모방 흐름 하에서 혈관 신생을 연구, 생체 내에서 여전히 존재하는 모든 구획을 설명 할 수 없다. 인해 시험 관내 및 생체 외에서 혈관 신생 모델의 한계로 생체 내 혈관 신생 모델 연구에 대한보다 안정적인 선택 남아있다. 이러한 모델의 예는 현미경 8 미만 성장하는 혈관의 시각화를 허용 투명한 챔버, &quot;윈도우&quot;의 주입을 포함, 예컨대 마우스 귀 및 닭 융모 막과 같은 정상 조직에있는 매트 리겔 및 혈관 형성과 같은 주사 피하 임플란트 (CAM ). 그러나, 대부분의 허용 및 정량 생체 내 혈관 신생 모델 중 하나는 자연적 무혈성 이용한다 여기서 설명 micropocket 각막 신생 혈관 분석이며,&quot;화면&quot;으로 각막 시각화하고 새로운 혈관 성장을 구를 평가합니다. 생쥐에서 개발로 여기에서 우리는 각막 micropocket 분석에 대해 설명합니다. 초기 모델 토끼 각막 혈관 신생 비특이적 자극을 측정 하였다. 이 토끼 눈의 전방의 방수에 종양 조각을 도입하여 수행 종양에 의한 혈관 신생 (11)을 측정 하였다. 그러나, 분석은 나중에 더 나은 지정하고 혈관 신생 효과를 표준화하기 위해 특정 성장의 효과를 연구하기 위해 열 요인 진화했다. 눈에 성장 인자를 분리하기 위하여, 혈관 신생 성장 인자의 공지 된 양을 함유하는 서방 형 펠렛 대신 원단으로 사용 하였다. 등의 bFGF 또는 VEGF와 같은 정제 된 재조합 혈관 형성 단백질의 가용성은 혈관 신생 modulaters (12)의 특정 대상으로 사용을 활성화. 초기에, 분석했다대부분의 크기로 인해 나중에 모델이 마우스로 번역 작업하기 쉽게 토끼에 사용; 더 작고 덜 비싼 동물 모델. 마우스에 토끼로부터 이동시켜 혈관 (13)에 영향을 미치는 유전 적 구성 요소에 대한 연구의 새로운 영역을 생성, 유전자 조작 된 동물을 사용 할 수 있다는 중요한 장점을 제공했다. 혈관 신생 연구에서 각막 분석의 더 이용 목적에 더하여, 다른 생물학적 과정은 또한 수정 된 분석법을 사용하여 조사되고있다. 예를 들어, 림프관의 연구는 특정 분자 마커 (14)를 통해 림프 혈관의 시각화를 허용 저용량의 bFGF 펠렛의 주입을 통해 가능하게되었다. 또한,이 분석은 혈관 (15) 상에 방사선의 효과를 평가하는 수단을 제공했다. 요약하면, 각막의 혈관 신생 micropocket 분석은 정량적, 담당자는roducible, 생체 내에서 혈관을 유연하게 평가. 이 분석의 주요 장점은 용기가 자연스럽게 무 혈관 조직에서 성장하기 때문에 배경 혈관의 측정이 필요하다는 것이다. 우리는 여기에서 자세한 내용이 분석의 프로토콜을 설명하고 발생할 수있는 다양한 시나리오에 대해 설명합니다. 분석은 3 이산 세그먼트로 구성되어 있습니다. 여기에서는 생성 된 신생 혈관 성장을 정량화하는 데 사용되는 성장 인자를 포함하는 펠릿의 제조에, 후속 수술 이식 최종적 방법을 서술한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Section 1: Pellet preparation</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucralfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#S0652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydron (aka Poly(2-Hema))</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#P3932-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">Pharmco Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">#111000200CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Growth factors:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Fibroblast growth factor (FGF)</td>
			<td style="width:111px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vascular endothelial growth factor (VEGF)</td>
			<td style="width:111px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#293-VE-050/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm dish</td>
			<td style="width:111px;">Becton-Dickson</td>
			<td style="width:119px;">#353001</td>
			<td>Used for storage of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">#25384-342</td>
			<td>Used as work surface for preparing pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mesh</td>
			<td style="width:111px;">Sefar America</td>
			<td style="width:119px;">#03--300/51</td>
			<td>300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spatulas</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21-401-10</td>
			<td>Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#05-408-146</td>
			<td>One for hydron, one for sucralfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2315E</td>
			<td>Need 2 for pulling mesh apart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal evaporator</td>
			<td style="width:111px;">ThermoSavant</td>
			<td style="width:119px;">DNA110 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 2: Surgical implantation of pellets</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td>NDC# 6131401601</td>
			<td>Eye anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:111px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">NDC# 2420878055</td>
			<td>Contains neomycin, polymixin and bacitracin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ophthalmic microknife, 5 mm</td>
			<td style="width:111px;">Surgistar</td>
			<td style="width:119px;">#924501</td>
			<td>30 degree angle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">von Graef knife</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#3401E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #1</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2301E</td>
			<td>Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2305E</td>
			<td>For picking up pellets and placing on eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small curved scissors</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#5636E</td>
			<td>For trimming whiskers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blotting eye after proparacaine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 3: Grading of Corneal Neovascularization</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slit lamp</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">FS-2</td>
			<td>Needs an ocular with a reticule to assist in measuring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye

마우스 각막 micropocket 분석은 혈관 형성을 평가하기위한 강력하고 정량적 생체 분석이다. 무 혈관 각막에 걸쳐 자연적으로 혈관의 성장을 유발 특정 성장 인자를 포함하는 표준화 된 서방 형 펠렛을 사용함으로써, 혈관 신생을 측정 및 정량화 될 수있다. 본 분석에서 사용되는 혈관 신생 반응은 성장 인자의 종류와 양에 따라 몇 일에 걸쳐 발생된다. 신생 혈관의 유도는 일반적으로 하나 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 의해 트리거된다. hydron 및 수크 랄 페이트 (폴리-HEMA (폴리 (2 - 히드 록시 에틸 메타 크릴 레이트))) 및 펠릿 혼합물을 캐스팅 이들 성장 인자를 조합하여, 그들은 수술 마우스 눈에 이식 될 수있다. 이러한 균일 한 펠릿을 용기 영역 Q에 필요한 충분한 혈관 반응을 가능하게 (각각의 bFGF 또는 VEGF) 대여섯 일 동안 성장 인자를 느리게 출시슬릿 램프를 사용하여 uantification. 이 분석은 혈관 신생 변조기 약물이나 치료법뿐만 아니라 혈관 형성에 영향을 미치는 유전 적 배경을 가지의 비교 평가를 포함한 다양한 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 분석을 연습 후 숙련 된 조사관이 눈 미만 5 분의 펠렛을 이식 할 수 있습니다.

통상 낮은 혈관 신생 C57BL / 6J 생쥐의 bFGF와 VEGF 펠렛 전형적인 결과가도 2A 및 B에 도시되어, 각각.도 2E 이러한 성장의 다양한 투여와 C57BL / 6J 균주에서 혈관 영역의 정규 분포 (VA)을 나타낸다 요인. 1.8-2.4 mm (2)의 범위의 값이 허용 비록 80 ng의 bFGF의 펠렛은 일반적으로, 대략 2.0 mm 2의 VA 초래한다. 200 ng를 VEGF 펠렛은 일반적으로 0.6-0.9 mm (2)의<...

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The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

이 프로토콜은 생쥐에서 개발로 각막 micropocket 분석에 대해 설명합니다.

각막 Micropocket 분석 : 마우스 눈에있는 혈관의 모델

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K 조회수.  Boston Children's Hospital.  이 프로토콜은 생쥐에서 개발로 각막 micropocket 분석에 대해 설명합니다. 

비디오: The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex three-dimensional retinal blood vessels and capillaries by creating a two-dimensional flat-mount of the interconnected vascular channels after digestion of the non-vascular components of the retina. This allows one to study various pathologic vascular changes, such as microaneurysms, capillary degeneration, and abnormal endothelial to pericyte ratios. However, the method is technically challenging, especially in mice, which have become the most widely available animal model to study the retina because of the ease of genetic manipulations 6,7. In the mouse eye, it is particularly difficult to completely remove the non-vascular components while maintaining the overall architecture of the retinal blood vessels. To date, there is a dearth of literature that describes the trypsin digest technique in detail in the mouse. This manuscript provides a detailed step-by-step methodology of the trypsin digest in mouse retina, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Trypsin digest is one of the most commonly used methods to analyze retinal vasculature. This manuscript describes the method in detail, including key alterations to optimize the technique and remove the non-vascular tissue while preserving the overall architecture of the vessels.

트립신 다이제스트 프로토콜 마우스 모델의 망막 혈관을 분석하는

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

연구

신경과학

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

테스트 시각 기능에 대한 간단한 행동 분석<em&gt;는 Xenopus laevis의</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

거미 막 밑 출혈의 Murine 모델에 대뇌 Vasospasm의 정량화에 대 한 체적 메서드

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Characterizing the Relationship Between Eye Movement Parameters and Cognitive Functions in Non-demented Parkinson's Disease Patients with Eye Tracking

Cognitive impairment is a common phenomenon in Parkinson&#8217;s disease that has implications on the prognosis. A simple, noninvasive and objective proxy measurement of cognitive function in Parkinson&#8217;s disease will be helpful in detecting early cognitive decline. As a physiological metric, eye movement parameter is not confounded by the subject&#39;s attributes and intelligence and can function as a proxy marker if it correlates with cognitive functions. To this end, this study explored the relationship between the eye movement parameters and performance in cognitive tests in multiple domains. In the experiment, a visual search task with eye tracking was set up, where subjects were asked to look for a number embedded in an array of alphabets scattered randomly on a computer screen. The differentiation between the number and the alphabet is an overlearned task such that the confounding effect of cognitive ability on the eye movement parameters is minimized. The average saccadic amplitude and fixation duration were captured and calculated during the visual search task. The cognitive assessment battery covered domains of frontal-executive functions, attention, verbal and visual memory. It was found that prolonged fixation duration was associated with poorer performance in verbal fluency, visual and verbal memory, allowing further exploration on the use of eye movement parameters as proxy markers for cognitive function in Parkinson&#8217;s disease patients. The experimental paradigm has been found to be highly tolerable in our group of Parkinson&#39;s disease patients and could be applied transdiagnostically to other disease entities for similar research questions.

Here, we present a protocol to study the relationship between the eye movement parameters and cognitive functions in non-demented Parkinson&#39;s disease patients. The experiment used an eye tracker to measure the saccadic amplitude and fixation duration in a visual search task. The correlation with performance in multi-domain cognitive tasks was subsequently measured.

안구 추적을 통해 비탈증 파킨아 병 환자에서 눈 운동 매개 변수와 인지 기능 사이의 관계를 특성화

Cognitive impairment is a common phenomenon in Parkinson&#8217;s disease that has implications on the prognosis. A simple, noninvasive and objective proxy ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

드로소필라의 신속한 식품 선호 분석

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

작고 큰 눈의 망막 기능을 연구하기 위해 생체 외 망막 전도의 설정 및 조건 최적화

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

생쥐의 광동태 반사 반응 평가: 새로운 고정밀 프로토콜

Quantification of Visual Feature Selectivity of the Optokinetic Reflex in Mice

The optokinetic reflex (OKR) is an essential innate eye movement that is triggered by the global motion of the visual environment and serves to stabilize retinal images. Due to its importance and robustness, the OKR has been used to study visual-motor learning and to evaluate the visual functions of mice with different genetic backgrounds, ages, and drug treatments. Here, we introduce a procedure for evaluating OKR responses of head-fixed mice with high accuracy. Head fixation can rule out the contribution of vestibular stimulation on eye movements, making it possible to measure eye movements triggered only by visual motion. The OKR is elicited by a virtual drum system, in which a vertical grating presented on three computer monitors drifts horizontally in an oscillatory manner or unidirectionally at a constant velocity. With this virtual reality system, we can systematically change visual parameters like spatial frequency, temporal/oscillation frequency, contrast, luminance, and the direction of gratings, and quantify tuning curves of visual feature selectivity. High-speed infrared video-oculography ensures accurate measurement of the trajectory of eye movements. The eyes of individual mice are calibrated to provide opportunities to compare the OKRs between animals of different ages, genders, and genetic backgrounds. The quantitative power of this technique allows it to detect changes in the OKR when this behavior plastically adapts due to aging, sensory experience, or motor learning; thus, it makes this technique a valuable addition to the repertoire of tools used to investigate the plasticity of ocular behaviors.

저자 스포트라이트: 생쥐에서 광학 동태 반사의 시각적 특징 선택성을 연구하기 위한 정확하고 정량적인 접근 방식 

Here, we describe a standard protocol for quantifying the optokinetic reflex. It combines virtual drum stimulation and video-oculography, and thus allows precise evaluation of the feature selectivity of the behavior and its adaptive plasticity.

생쥐에서 광동태 반사의 시각적 특징 선택성 정량화

The optokinetic reflex (OKR) is an essential innate eye movement that is triggered by the global motion of the visual environment and serves to stabilize ...