이 작품은 R &amp; D 시스템즈가 추진하는 사업

1. 샘플 준비 <ol><li> 인간 Phospho-RTK 어레이 데이터 시트에있는 지침에 따라 치료, 리간드는 치료, 또는 방지제와 리간드 치료 세포 lysates를 수집합니다. 용해 버퍼는이 키트에 최적화되었습니다. 다른 용해 버퍼의 대체는 배열의 마지막 성능에 영향을 미칠 수 있습니다. proteolytic 샘플 저하를 방지하기 위해, 10 μg / ML Aprotinin, 10 μg / ML 류 펩틴, 10 μg / ML Pepstatin 각 사용에 대한 신선한 각각의 세포 lysate 준비에 필요한 용해 버퍼의 양을 추가합니다. </li><li> Lysate 농도는 bicinchoninic 산 (BCA) 분석을 사용하여 측정해야합니다. 샘플 농도는 경험적으로 최적의 감도 및 낮은 배경에 맞게 변경 될 수 있습니다. lysate의 100-300 μg의 범위는 초기 시작 지점으로하는 것이 좋습니다. </li><li> 샘플의 동결 / 해동 사이클은 피해야합니다 그리고 lysates의 적절한 저장 용량은 최적의 성능을 위해 필요합니다. 얼음에 냉동 lysate 샘플을 해동. </li></ol><ol><li> 사용하기 전에 실온에 모든 키트 구성 요소를 가져와. 절차를 수행하는 동안 오염을 방지하기 위해 장갑을 착용하십시오. </li><li> 사용되는 4 - 그럼 멀티 요리의 각 잘에 배열 버퍼 1 피펫 2.0 ML. 배열 버퍼 1 블록 버퍼 역할을합니다. </li><li> 평면 팁 핀셋 사용하여 4 음 ​​다중 요리의 잘의 보호 시트와 장소 사이에서 사용되는 각 멤브레인을 제거합니다. 배열 번호는 위쪽으로 직면해야한다. </li><li> 배열 버퍼 1 접촉시, 장소에서 청색 색소가 사라집니다하지만, 캡처 항체들은 특정 위치에 유지됩니다. </li><li> 흔들 플랫폼에서 1 시간에 품다. 동양은 트레이, 각 배열 바위 끝은 잘에 종료하는 것을. 배열의 표면은 완전히 침수와 블록 버퍼에 포함해야합니다. </li><li> 멤브레인 차단 있지만, 배열 버퍼 1 1.5 ML의 최종 볼륨에 세포 lysate의 원하는 수량을 희석. </li> &lt;리&gt; 기음의 배열 4 - 그럼 다중 접시의 우물에서 버퍼 1과 희석 lysate 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 4 - 그게 다 음식에 뚜껑을 놓으십시오. </li><li> 흔들 플랫폼에 2-8 ° C에서 하루 아침에 품다. 최적의 감도가 필요하지 않은 경우 짧은 배양 시간 사용할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 1X 워시 버퍼의 20 ML과 개별 플라스틱 용기에 4 - 그럼 멀티 요리와 장소에서 각 멤브레인을 제거합니다. 4 - 그럼 멀티 요리는 세척 단계를 완료하는 데 사용할 수 없습니다. deionized 또는 증류수와 함께 4 - 그럼 여러 요리를 씻어 완전히 건조 시키십시오. </li><li> 흔들 플랫폼 흔드는 10 분에 1X 워시 버퍼 각 멤브레인을 씻으십시오. 3 세차의 총을 두 번 반복합니다. </li><li> 유리 병의 라벨에 희석 요소를 사용하여 두 1X 배열 버퍼에 반 phospho-티로신 - 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP) 감지 버퍼를 희석. 4 - 그럼 멀티 요리의 각도에 희석 솔루션의 피펫 2.0 ML. </li><li> 신중은 세탁 컨테이너의 각 멤브레인을 제거합니다.막에서 분출과 희석 방지 phospho-티로신-HRP을 포함하는 4 자 다 요리에 막 돌려 초과 버퍼를 허용합니다. 뚜껑과 함께 우물을 다룹니다. </li><li> 흔들 플랫폼에 상온에서 2 시간에 품다. </li><li> 이전에 설명 된대로 각 배열을 씻으십시오. </li><li> 중단없이 나머지 단계를 완료합니다. 신중은 세탁 컨테이너의 각 멤브레인을 제거합니다. 초과 버퍼가 흡수 종이로 하단 가장자리를 blotting하여 멤브레인의 배수 할 수 있습니다. 최대 직면하고있는 식별 번호와 플라스틱 시트 프로텍터에 각 멤브레인을 배치합니다. </li><li> 준비된 Chemi 시약의 피펫 한 ML은 각 막에 고르게 섞는다. 막 당 Chemi 시약 믹스 미만의 1 ML을 사용하면 불완전 막 보도 될 수 있습니다. Chemi 시약 1과 2에 대한 몇 가지 높은 강도 chemiluminescent 시약의 대체는 시약에 따라 증가 배경이나 감소 신호 중 하나가 발생할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 플라스틱으로 커버시트 보호. 부드럽게 공기 방울을 부드럽게하고 Chemi 시약 믹스는 각 막의 모든 구석 구석에 골고루 분포되어 있는지 확인합니다. 1 분에 품다. </li><li> 위치 종이 상단과 세포막을 포함하는 플라스틱 시트 프로텍터의 양쪽에 수건을주의 깊게 초과 Chemi 시약 믹스을 짜낸 후에 사용합니다. </li><li> 상단 플라스틱 시트 프로텍터를 제거하고 신중하게 흡수 실험실 남아있는 Chemi 시약 믹스를 가릴 수있는 멤브레인의 상단에 닦아 놓여 있었다. </li><li> 하단 플라스틱 시트 프로텍터에 세포막을 남겨두면, 플라스틱 랩은 부드럽게 공기 방울을 부드럽게 관리하고있는 멤브레인을 다룹니다. 멤브레인 및 시트 보호가 완전히 포장되도록 시트 수호자의 뒤로 초과 플라스틱 랩으로 감싸. </li><li> 방사성 동위 원소 검출에 사용되지 않은 autoradiography 영화 카세트에 최대 직면하고있는 식별 번호와 세포막을 놓으십시오. </li><li> 1-10 분 동안 코닥 BioMax 라이트 필름에 노출. 다중 노출은 recomm 아르종료되었습니다. 또한, 이미지 등의 Carestream 건강으로 chemiluminescence 호환 영상을 사용하여 수집 될 수 있습니다 이미지 역 4000MM PRO. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 개발 영화에서 본 긍정적 인 신호를 신속하게 배열 이미지에 투명 오버레이를 배치하고이 목적 모서리에 인쇄 참조 명소 쌍으로 정렬하여 식별 할 수 있습니다. 배열에 날인 된 식별 번호는 왼쪽 측면에 배치했다한다. 컨트롤과 캡처 항체의 위치는 인간 Phospho-RTK 어레이 데이터 시트의 부록에 나열됩니다. </li><li> 개발 필름에 픽셀 밀도는 같은 엡손의 완벽 V750 PRO로 전송 모드 스캐너를 사용하여 수집 할 수 있습니다. </li><li> 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 배열의 각 지점에서 픽셀 밀도를 분석 할 수있는 템플릿을 만듭니다. 호환 프로그램은 GE에서 ImageQuant 또는 ArrayVision 소프트웨어, 서양 비전 sof를 포함프로파일 배열, BioRad 수량 하나 어도비 포토샵, NIH ImageJ, 그리고 단백질 간단한 AlphaView를 프로테옴 할 특정 템플릿을 사용 tware. </li><li> Microsoft Excel과 같은 프로그램에서 조작을위한 스프레드 시트 파일에 신호 값을 보냅니다. </li><li> 각 RTK를 대표하는 중복 장소 쌍의 평균 신호 (픽셀 밀도)를 확인합니다. </li><li> 각 지점에서 평균 배경 신호를 뺍니다. 배열 또는 배경 값으로 부정적인 제어 장소의 명확한 영역에서 신호를 사용합니다. </li><li> 샘플 사이의 RTK의 인산화 수준의 상대적 변화를 결정하기 위해 서로 다른 배열에 해당하는 신호를 비교합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 이 프로토콜은 인간 Phospho-RTK 배열이 RTK의 인산화에 리간드 자극과 억제제의 효과를 차단하는 데 사용할 수 있습니다 방법을 보여줍니다. 그림 1에서 데이터는 100 NG로 치료, 치료했다 MDA-MB-453 세포에 표시됩니다5 분, 또는 알려진 ErbB 가족 억제제 전에 HRGβ1 치료에 8-11으로 사전 처리를위한 / ML rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1). 억제 실험 세포는 1 μM HDS 029, 200 nm의 PD 153,035, 또는 세 시간 동안 200 nm의 SFM에서 PD 158,780와 incubated되었습니다. 각 배열은 lysate 100 μg과 incubated되었습니다. 인산화의 증가는 ErbB2, ErbB3에 대한 관찰, 그리고 ErbB4 캡처 명소 HRG-β1과 치료 세포를 비교 MDA-MB-453 세포를 취급하고 있습니다. 이전 HRG-β1 부화에 세 ErbB 가족 선택적 억제제로 세포의 치료는 ErbB2의 감소, ErbB3 및 ErbB4 인산화를 일으켰습니다. 그림 2에서, 데이터는 RTK FGF의 R2를 overexpress 것으로 알려진 카토 III 셀에 표시됩니다. 실험의 집합에, 카토 III 세포는 이전에 치료 100 NG / ML rhFGF 산성 (FGF)와 1 μg / ML 헤파린, 또는 FGF R 선택적 억제제 12-15과 pretreated로 치료, 치료했다FGF 및 헤파린. 억제제 PD173074, PD 161,570, 그리고 PD 166,285는 1 μm의 농도에서 사용하고 혈청 무료 미디어 3 시간의 카토 III 세포와 incubated되었습니다. EGF R 및 치료 가토 III 세포에서 FGF의 R2 모두의 제정 인산화, FGF의 R2의 인산화의 증가가 있지만 FGF 치료에 관찰되었다. PD 173,074으로 세포를 잠복기, PD 161,570, 또는 PD 166,285이 FGF R2와 EGF R의 인산화를 감소하게되었습니다. 이러한 억제제는 FGF R 가족 구성원의 인산화에 영향을 미칠 알려져 있지만, 이러한 결과는 억제제의 특정 농도가이 경우에 해당 EGF R과 같은 다른 RTKs에있을 수 있습니다 효과를 모니터링하기위한 인간 Phospho-RTK 배열의 유틸리티를 보여줍니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1.jpg" /> 1 그림. recep의 유도와 억제유방암 세포에서 티로신 키나제 토르의 인산화. 프로테옴 프로파일 러 인간 Phospho-RTK 배열 및 해당 히스토그램 프로파일의 배열 이미지는 표시됩니다. MDA-MB-453 세포는 치료 또는 RTK 억제제는 NRG-β1/HRG-β1 치료를 다음과 처리했다. 배열은 MDA-MB-453 세포에 키나제 인산화에 억제제의 효과를 모니터링하기 위해 사용되었다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2.jpg" /> 그림 2. 프로테옴 프로파일 러 인간 Phospho-RTK 배열 및 해당 히스토그램 프로필에서 유도 및 위 암 세포의 수용체 티로신 키나제 인산화의 억제. 배열 이미지가 표시됩니다. 카토 III 전지는 unt했다reated 또는 FGF 산성 및 헤파린 치료를 다음 RTK 억제제로 치료하는 것은. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 참조 <ol><li> Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenborg, PA, Oberg, A., 반 Guelpen, B., Rutegard, J., Stenling, R., &amp; Palmqvist은 R. 대장 암 세포는 결과 옆에 섬유 아세포를 활성화 FGF1/FGFR3 신호와 증가 침략 인치인가. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011). </li><li> 모리시​​타, A., 공, J., 노무라, T., 요시다, H., Izuishi, K., 스즈키, Y., Kushida, Y., Haba, R., D&#39; Armiento, J., &amp; 마사키, T. 단백질 배열의 사용은 인간의 대장 암 치료에 대한 타겟팅 수용체 티로신 kinases를 식별합니다. INT. J. Oncol. 37, 829-835 (2010). </li><li> Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, B., 구오, T., 웡, GC, Socci, ND, 마키, RG,소아 위장 stromal 종양의 DeMatteo, RP, Besmer, P., &amp; Antonescu, CR 분자 특성. Clin. 암 해상도. 14, 3204-3215 (2008). </li><li> Stommel, JM, Kimmelman, AC, 잉, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, 리곤, KL, 브레넌, C., 친, L., &amp; DePinho는 수용체 티로신 kinases의의 RA의 Coactivation 타겟팅 요법에 종양 세포의 반응에 영향을 미칩니다. 과학. 318, 287-290 (2007). </li><li> Agarwal, S., Zerillo, C., Kolmakova, J., 크리스텐슨, JG, 해리스, 종이, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, &amp; 스턴,에 대한 저항과 constitutively 활성화 간세포 성장 인자 수용체의 DF 협회 (메트로폴리스) 비 작은 세포 폐암 세포에서 이중 EGFR/Her2 억제제. BR. J. 암. 100, 941-949 (2009). </li><li> Dewaele, BM, Floris, G., Finalet - Ferreiro, J., 플레쳐, CD, Coindre, JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, 워즈니악, A., Vanspauwen, V., Schoffski, P., Marynen, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., &amp; Debiec - Rychter, M. 공동 활성화 PDGFRA와 EGFR은 내막 육종의 잠재적 인 치료 대상입니다. 암 해상도가. 70, 7304-7314 (2010). </li><li> 윤 YK, 김, HP, 한, SW, 허, HS, 오, DY, 인스턴트 메시지, SA, 탕, YJ, &amp; 김, EGFR 및 MEK1 / 2 억제제 TY의 조합은 억제 EGFR/HER3-dependent의 시너지 효과를 보여줍니다 인간의 위 암세포의 AKT 활성화. 몰. 암 군터. 8 2526년부터 2536년까지 (2009). </li><li> 튀김, DW, 넬슨, JM, Slintak, V., 헬렌 켈러, PR, Rewcastle, GW, 데니, WA, 저우, H., &amp; 교량, 4 AJ 생화학 및 antiproliferative 등록 - 아르곤 (하시죠) ylamino] pyridopyrimidines, 강력한 및 특정 표피 성장 인자 수용체 티로신 키나제의 억제제의 새로운 화학 클래스입니다. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997). </li><li> 보스,M., Mendelsohn, J., 김, YM, Albanell, J., 프라이, DW, &amp; Baselga, J. PD153035, 티로신 키나제 억제제는 표피 성장 인자 수용체 활성화를 방지하고 수용체에 암 세포의 성장을 억제 번호 - 종속 방식. Clin. 암 해상도. 3, 2099-2106 (1997). </li><li> 산보 나온 것처럼, SW, Kansra, S., Peshick, S., 프라이, DW, 레오폴드, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M., 장, T., Werb, Z., Derynck, R., 바그너, EF, 및 장로, 정상 및 악성 keratinocytes에 비해 피부에 ErbB 수용체 티로신 kinases의 JT 차등 활용 및 현지화가. Neoplasia. 3, 339-350 (2001). </li><li> Klutchko, SR, 저우, H., 겨울, RT, 트란, TP, 다리, AJ, Althau, IW, Amato, DM, 엘리엇, WL, 미드, 프라이 MA, 로버츠, BJ, DW, 곤잘레스, AJ, 하비 , PJ, 넬슨, JM, 셔우드, V., 한, 홍콩, 속도, G., Smaill, JB, 데니, WA, &amp; Showalter, HD의 티로신 키나제의 억제제. 19. 6 으니까 말인데티로신 키나제 수용체의 ErbB 가족의 돌이킬 수 억제제 등 4 anilinoquinazolines 및 4 anilinopyrido [3,4-D] pyrimidines의 nyamides. J. 메드. 화학. 49 1475-1485 (2006). </li><li> Kunii, K., 데이비스, L., Gorenstein, J., 해치, H., 야시로, M., 디 Bacco, A., Elbi, C., &amp; Lutterbach, B. FGFR2 - 증폭 위 암 세포 라인 FGFR2이 필요합니다 그리고 Erbb3의 성장과 생존을 위해 신호. 암 해상도. 68, 2340년부터 2348년까지 (2008). </li><li> 저우, W., 허, W. 맥 더못, U., Dutt, A., 시안 (西安), W., Ficarro, SB, 장, J., Sharma, SV, 브루, J., Meyerson, M., Settleman, J . &amp; 그레이, NS 공유 결합 FGFR 억제제를 만드는 구조 - 가이드 서비스입니다. 화학. Biol. 17 285-295 (2010). </li><li> PD 161,570의 FGF-1 수용체 티로신 키나제 활동 Batley, BL, 도허티, AM, Hamby, JM, 루, GH, 헬렌 켈러, P., Dahring, TK, 황, O., Crickard, K., &amp; Panek RL 억제 , 새로운 단백질- 티로신 키나제의 억제제. 생활 문화. 62 143-150 (1998). </li><li> Panek, RL, 루 GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, Hamby, JM, Hallak, H., 도허티, AM, &amp; Keiser, PD 166,285의 체외 약리 특성에 JA, 새로운 nanomolar 강력하고 광범위하게 활성 단백질 티로신 키나제의 억제제. J. Pharmacol. 특급. 군터. 283, 1433년부터 1444년까지 (1997). </li></ol>

인간 Phospho-RTK는 RTK의 인산화의 심사 변경 서양 immunoprecipitation (IP)와 같은 전통적인 방법에 경제적 빠른 대안입니다. 이 방법 사용, 42 phospho-RTKs의 상대적 수준은 MDA-MB-453 또는 카토 III 세포 lysate의 단일 샘플을 사용하여 동시에 상영되었다. 또한,이 배열 분석이 방법이 훨씬 더 시간이 효율적인 다중 IP-서부를 수행하는 것보다, 2.5 시간 체험 시간을 필요합니다. chemiluminescence 검출 방법을 채용함으로써, 일반적으로 서양 데이터를 수집하는 데 사용됩니다 어떤 외의 특수 장비가 필요 없습니다. 배열은 민감하고 리간드와 억제제 치료 모두에 의한 인산화의 변화를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 외부 대상 RTKs에 억제 선택성의 평가를 할 수 있습니다. 긍정적 조회수가 더 이러한 엘리사와 같은 양적 분석을 사용하여 평가 될 수 있습니다. 효과적으로 변경 화면에 배열을 고용하려면인산화에 주요 실험 가이드 라인 준수해야합니다. 첫째, 실험 적절한 제어 샘플을 포함해야합니다. 예를 들어, 이러한 실험에 MDA-MB-453 또는 카토 III lysates에 억제제의 효과가 같은 날에 준비 lysate 샘플에서 측정되었습니다. 같은 실험에서 수집 만이 배열 데이터는 샘플 처리의 차이, 배양 시간, pipet 기술, 또는 세탁 기술로 인해 신호의 변화를 최소화하기 위해 분석해야합니다. 캡처 항체가 병렬 동질성을 가지고 선택하지 한 이후 같은 막에 두 analytes 사이의 비교 신호 강도는 권장하지 않습니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=ary001" target="_blank">Human Phospho-RTK Array Kit</a></td>
			<td>R&amp;D Sytems</td>
			<td>ARY001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1167</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-453 cells</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kato III cells</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=396-hb" target="_blank">Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain</a></td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>396-HB-050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=232-fa" target="_blank">Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)</a></td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>232-FA-025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDS 029</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2646</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 153035</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1037</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 158780</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2615</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 173074</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 161570</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 166285</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3785</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and pipette tips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized or distilled water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-tipped tweezers</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform shaker</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic containers with the capacity to hold 50 ml</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For washing arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transparent sheet protector</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent lab wipes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography cassette</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film developer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodak BioMax Light Film</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>178 8207</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film developer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Station 4000MM PRO</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection Scanner</td>
			<td>Epson</td>
			<td>V750 PRO</td>
			<td>Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays - advertisement

수용체 티로신의 키나제 (RTK) 표현과 인산화의 dysregulation이 자주 암 세포의 개발 및 전이성 확산과 연결되어 있습니다. 1-3 상당한 노력은 특정 RTKs을 타겟팅과 질병 상태와 관련된 비정상 신호 경로를 방해 개발 억제제에 집중되었습니다 . 본 연구의 4-7 목적은 RTK의 인산화에 대한 억제제의 선택 수의 효과를 측정하는 것이 었습니다. 이 연구는 단일 샘플로 동시에 다수의 RTKs에 대한 인산화의 증가 또는 감소를 모니터링 할 수있는 멤브레인 기반의 샌드위치 면역 분석법 인 인간 Phospho-RTK 배열을 사용 하였다. 이 분석에서 모두 phosphorylated과 unphosphorylated RTKs는 lysate 샘플에 존재는 니트로 셀룰로스 막 현미경 슬라이드의 크기에 걸쳐 복제에 인쇄 이산 항체에 의해 캡처됩니다. 세척 후, 배열, 안티 phospho-티로신 - 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP)와 incubated 아르배열에 캡처 한 phosphorylated RTKs로하는 샌드위치. 두 번째 세척 단계 후, 배열 chemiluminescent 시약과 incubated 수 있습니다. 각 배열 지점에서 생성 신호는 각 캡처 항체에 의해 구속 phospho-단백질의 양에 비례합니다. 이 실험에서, 배열은 MDA-MB-453의 유방암 또는 가토 III 위 암 세포뿐만 아니라, ErbB에 대한 선택적 억제제로 세포의 치료와 관련된 인산화의 감소를 특징하는 하나의 리간드 자극에 따라 인산화의 증가를 측정하는 데 사용 된 또는 FGF R의 가족.

프로테옴 프로파일 항체 어레이는 수많은 immunoprecipitation (IP) 서부을 수행하지 않고 수용체 티로신 키나제의 (RTK) 인산화의 변화에​​ 대한 화면으로 편리하고 비용 효율적인 방법입니다. ARY001 인간 RTK 배열은 chemiluminescence 감지를 사용하여 하나의 샘플에서 여러 RTKs의 질적 측정 할 수 있습니다.

항체 배열을 사용하여 수용체 티로신 키나제 인산화의 프로파일 변경 - 광고

The dysregulation of receptor tyrosine kinase (RTK) expression and phosphorylation is frequently associated with the development and metastatic spread of ...

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Without Section

Profiling Changes in Receptor Tyrosine Kinase Phosphorylation using Antibody Arrays - ADVERTISEMENT

11.5K 조회수.  R&D Systems, Inc.. 프로테옴 프로파일 항체 어레이는 수많은 immunoprecipitation (IP) 서부을 수행하지 않고 수용체 티로신 키나제의 (RTK) 인산화의 변화에​​ 대한 화면으로 편리하고 비용 효율적인 방법입니다. ARY001 인간 RTK 배열은 chemiluminescence 감지를 사용하여 하나의 샘플에서 여러 RTKs의 질적 측정 할 수 있습니다.

비디오: 항체 배열을 사용하여 수용체 티로신 키나제 인산화의 프로파일 변경 - 광고

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids 1-6, the unfolding of proteins 7, and binding affinity of different ligands 8. By coupling these nanopores to the resistive-pulse technique 9-12, such measurements can be done under a wide variety of conditions and without the need for labeling 3. In the resistive-pulse technique, an ionic salt solution is introduced on both sides of the nanopore. Therefore, ions are driven from one side of the chamber to the other by an applied transmembrane potential, resulting in a steady current. The partitioning of an analyte into the nanopore causes a well-defined deflection in this current, which can be analyzed to extract single-molecule information. Using this technique, the adsorption of single proteins to the nanopore walls can be monitored under a wide range of conditions 13. Protein adsorption is growing in importance, because as microfluidic devices shrink in size, the interaction of these systems with single proteins becomes a concern. This protocol describes a rapid assay for protein binding to nitride films, which can readily be extended to other thin films amenable to nanopore drilling, or to functionalized nitride surfaces. A variety of proteins may be explored under a wide range of solutions and denaturing conditions. Additionally, this protocol may be used to explore more basic problems using nanopore spectroscopy.

A method of using solid-state nanopores to monitor the non-specific adsorption of proteins onto an inorganic surface is described. The method employs the resistive-pulse principle, allowing for the adsorption to be probed in real-time and at the single-molecule level. Because the process of single protein adsorption is far from equilibrium, we propose the employment of parallel arrays of synthetic nanopores, enabling for the quantitative determination of the apparent first-order reaction rate constant of protein adsorption as well as and the Langmuir adsorption constant.

고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

연구

JoVE Journal

생체공학

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

임상 항체 샘플 Phagocytic 활동 결정

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

면역학 및 감염병학

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

신경과학

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

루시페라제 Immunoprecipitation 시스템 (입술)에 의해 항체 프로파일

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

생물학

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in adulthood 1,2,3. Inactivating mutations in KISS1R identified in patients have been associated with iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2 and precocious puberty 4. Functional studies of these mutants are crucial for our understanding of the mechanisms underlying the regulation of reproduction by this receptor as well as those shaping the disease outcomes, which result from abnormal KISS1R signaling and function. However, the highly GC-rich sequence of the KISS1R gene makes it rather difficult to introduce mutations or amplify the gene encoding this receptor by PCR.
Here we describe a method to introduce mutations of interest into this highly GC-rich sequence that has been used successfully to generate over a dozen KISS1R mutants in our laboratory. We have optimized the PCR conditions to facilitate the amplification of a range of KISS1R mutants that include substitutions, deletions or insertions in the KISS1R sequence. The addition of a PCR enhancer solution, as well as of a small percentage of DMSO were especially helpful to improve amplification. This optimized procedure may be useful for other GC-rich templates as well.
The expression vector encoding the KISS1R is been used to characterize signaling and function of this receptor in order to understand how mutations may change KISS1R function and lead to the associated reproductive phenotypes. Accordingly, potential applications of KISS1R mutants generated by site-directed mutagenesis can be illustrated by many studies 1,4,5,6,7,8. As an example, the gain-of-function mutation in the KISS1R (Arg386Pro), which is associated with precocious puberty, has been shown to prolong responsiveness of the receptor to ligand stimulation 4 as well as to alter the rate of degradation of KISS1R 9. Interestingly, our studies indicate that KISS1R is degraded by the proteasome, as opposed to the classic lysosomal degradation described for most G protein-coupled receptors 9. In the example presented here, degradation of the KISS1R is investigated in Human Embryonic Kidney Cells (HEK-293) transiently expressing Myc-tagged KISS1R (MycKISS1R) and treated with proteasome or lysosome inhibitors. Cell lysates are immunoprecipitated using an agarose-conjugated anti-myc antibody followed by western blot analysis. Detection and quantification of MycKISS1R on blots is performed using the LI-COR Odyssey Infrared System. This approach may be useful in the study of the degradation of other proteins of interest as well.

Mutations in the kisspeptin receptor (KISS1R) are associated with reproductive disorders in patients. Here we describe how to introduce mutations of interest in the GC-rich sequence of KISS1R as well as the use of KISS1R constructs to characterize the degradation pathway of the receptor by immunoprecipitation and western blot.

생식기 장애와 인간에서 확인된 GC 풍부한 KISS1 수용체 유전자 시퀀스에 돌연변이 돌연변이 유발 및 분석

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

다중 Chemostat 배열의 설계 및 사용

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...