Ce travail a été financé par la R &amp; D Systems, Inc

1. Préparation des échantillons <ol><li> Recueillir des lysats de traitement, ligand traité, ou d&#39;un inhibiteur et les cellules ligand traités suivant les directives de la fiche gamme Phospho-RTK humaines. Le tampon de lyse a été optimisé pour ce kit. La substitution des tampons de lyse autres peuvent affecter la performance finale du tableau. Pour éviter la dégradation protéolytique échantillon, ajouter 10 pg / ml d&#39;aprotinine, 10 ug / ml de leupeptine, et 10 pg / ml pepstatine A du volume de tampon de lyse pour chaque préparation de lysat de cellules fraîches pour chaque utilisation. </li><li> Concentration lysat doit être mesurée à l&#39;aide d&#39;un acide bicinchoninique (BCA) de dosage. Concentration de l&#39;échantillon peut être ajusté empiriquement pour une sensibilité optimale et faible bruit de fond. Une gamme de 100-300 mg de lysat est recommandé comme un point de départ. </li><li> Cycles gel / dégel des échantillons devraient être évités et la bonne conservation de lysats est nécessaire pour des performances optimales. Dégeler les échantillons de lysat sur la glace. </li></ol><ol><li> Apportez tous les composants du kit à température ambiante avant utilisation. Pour éviter la contamination, porter des gants pour effectuer les procédures. </li><li> Pipeter 2,0 ml de 1 tampon de tableau dans chaque puits de la 4-Eh bien Multi-vaisselle doit être utilisé. 1 Tampon tableau sert de tampon de bloc. </li><li> En utilisant des pinces à pointe plate, retirez chaque membrane à utiliser entre les feuilles de protection et les placer dans un puits de la 4-Eh bien Multi-vaisselle. Le numéro de réseau doit être orientée vers le haut. </li><li> Lors du contact avec 1 tampon Array, le colorant bleu dans les taches disparaissent, mais les anticorps de capture sont conservés dans leurs emplacements spécifiques. </li><li> Incuber pendant 1 heure sur une plate-forme à bascule. Orienter le plateau de telle sorte que chaque extrémité des roches tableau se termine à son puits. La surface de la matrice doit être complètement mouillée et couverte par un tampon de bloc. </li><li> Tandis que les membranes sont de blocage, diluer la quantité désirée de lysat cellulaire à un volume final de 1,5 ml de tampon 1 Array. </li> &lt;li&gt; Tampon tableau Aspirer 1 à partir des puits de la 4-Eh bien Multi-plat et ajouter des solutions de lysat dilué. Placez le couvercle sur le 4-Eh bien Multi-vaisselle. </li><li> Incuber une nuit à 2-8 ° C sur un agitateur oscillant. Un temps d&#39;incubation plus courte peut être utilisée si la sensibilité optimale n&#39;est pas nécessaire. </li><li> Détachez délicatement chaque membrane de la 4-Eh bien Multi-plat et le placer dans des conteneurs en plastique avec 20 ml de tampon de lavage 1X. Le 4-Eh bien Multi-vaisselle ne peut pas être utilisé pour compléter les étapes de lavage. Rincer le 4-Eh bien Multi-vaisselle avec de l&#39;eau déminéralisée ou distillée et séchez soigneusement. </li><li> Laver chaque membrane avec le tampon de lavage 1X pendant 10 min sur un agitateur à bascule plate-forme. Répéter l&#39;opération deux fois pour un total de 3 lavages. </li><li> Diluer l&#39;anticorps anti-phospho-tyrosine-peroxydase de raifort tampon de détection (HRP) dans du tampon 1X tableau 2 en utilisant le facteur de dilution sur l&#39;étiquette du flacon. Pipeter 2,0 ml de solution diluée dans chaque puits de la 4-Eh bien Multi-vaisselle. </li><li> Détachez délicatement chaque membrane de son récipient de lavage.Permettre le tampon en excès de s&#39;écouler à partir de la membrane et la membrane retourne à la 4-multi-puits contenant la vaisselle dilué anti-phospho-tyrosine-HRP. Couvrir les puits avec le couvercle. </li><li> Incuber pendant 2 heures à température ambiante sur un agitateur oscillant. </li><li> Laver chaque baie comme décrit précédemment. </li><li> Effectuez les étapes restantes sans interruption. Détachez délicatement chaque membrane de son récipient de lavage. Permettre le tampon en excès de s&#39;écouler à partir de la membrane en épongeant le bord inférieur sur du papier absorbant. Placer chaque membrane sur une feuille de matière plastique protecteur avec le numéro d&#39;identification vers le haut. </li><li> Pipeter 1 ml du réactif préparé Chemi Mélanger uniformément sur chaque membrane. Utiliser moins de 1 ml de mélange de réactifs Chemi par membrane peut entraîner une couverture incomplète membrane. La substitution de certains réactifs à haute intensité de chimioluminescence de réactifs Chemi 1 et 2 peuvent provoquer soit augmenté ou fond signal diminué en fonction du réactif. </li><li> Soigneusement couvrir avec un plastiqueProtège-document. Doucement lisser les bulles d&#39;air et d&#39;assurer Mix Réactif Chemi est répartie uniformément à tous les coins de chaque membrane. Incuber pendant 1 min. </li><li> Serviettes en papier de position sur le dessus et les côtés du protecteur de feuille de plastique contenant les membranes et bien presser l&#39;excès Mix Réactif Chemi. </li><li> Retirez le protecteur de feuille supérieure en plastique et posez avec soin un laboratoire essuie-tout absorbant au-dessus des membranes pour éponger tout restant Mix Réactif Chemi. </li><li> Laissant membranes sur le protecteur de feuille de plastique en bas, couvrir les membranes d&#39;une pellicule plastique en prenant soin de lisser doucement les bulles d&#39;air. Enroulez le wrap excès de plastique autour de l&#39;arrière de la feuille de protection de sorte que les membranes et les protecteurs de feuilles sont complètement enveloppé. </li><li> Placer les membranes avec les numéros d&#39;identification vers le haut, dans une cassette de film d&#39;autoradiographie qui n&#39;est pas utilisé avec la détection des isotopes radioactifs. </li><li> Exposer à la lumière du film Kodak BioMax pour 1-10 min. Expositions multiples sont recommterminé. Sinon, les images peuvent être recueillies à l&#39;aide d&#39;un imageur chimiluminescence compatible comme le Carestream Health Image Station 4000MM PRO. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Signaux positifs observés sur le film développé peut être rapidement identifié en plaçant la superposition sur l&#39;image de la transparence et de matrice en l&#39;alignant avec les paires de points de référence imprimées dans les coins à cet effet. Le numéro d&#39;identification estampé sur le tableau doit être placé sur le côté gauche avait. L&#39;emplacement des commandes et des anticorps de capture est mentionnée dans l&#39;annexe de la fiche gamme Phospho-RTK humaines. </li><li> Densités de pixels sur le film développé peut être recueillie à l&#39;aide d&#39;un scanner de mode de transmission tels que l&#39;Epson Perfection V750 PRO. </li><li> Créer un modèle pour analyser la densité de pixel de chaque point du tableau en utilisant un programme d&#39;imagerie appropriée des logiciels d&#39;analyse. Programmes compatibles comprennent le logiciel ImageQuant ou ArrayVision de GE, sof Vision de l&#39;Ouesttware avec des modèles spécifiques à protéome tableaux de profils, BioRad Quantité One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ et AlphaView Protéines simple. </li><li> La valeur des exportations de signaux dans un fichier tableur pour manipuler dans un programme tel que Microsoft Excel. </li><li> Déterminer la moyenne du signal (densité de pixels) de la paire de points représentant chaque dupliquée RTK. </li><li> Soustraire un signal de fond moyenne de chaque spot. Utilisez un signal provenant d&#39;une zone claire de l&#39;ensemble ou des taches de contrôle négatif comme une valeur de fond. </li><li> Comparer les signaux correspondants sur des tableaux différents pour déterminer la variation relative des niveaux de phosphorylation RTK entre les échantillons. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Ce protocole démontre comment l&#39;homme Phospho-RTK réseau peut être utilisé pour cribler les effets de la stimulation du ligand et des inhibiteurs de la phosphorylation RTK. Dans la figure 1, les données sont indiquées pour MDA-MB-453 cellules qui ont été traitées, traitées avec 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) pendant 5 min, ou pré-traités avec des inhibiteurs connus de la famille ErbB 8-11 avant HRGβ1 traitement. Pour les expériences d&#39;inhibition, les cellules ont été incubées avec 1 uM HDS 029, 200 nM PD 153035 ou 200 nM PD 158780 dans la GDF pendant trois heures. Chaque tableau a été incubé avec 100 pg de lysat. Une augmentation de la phosphorylation est observée pour ErbB2, ErbB3, ErbB4 et taches de capture lors de la comparaison avec les cellules non traitées HRG-β1 traitée MDA-MB-453 cellules. Le traitement des cellules avec les trois inhibiteurs sélectifs de la famille ErbB avant HRG-β1 incubation provoqué des réductions dans ErbB2, ErbB3, ErbB4 et de phosphorylation. Dans la figure 2, les données sont indiquées pour les cellules Kato III connus pour surexprimer le FGF R2 RTK. Dans cette série d&#39;expériences, les cellules Kato III n&#39;ont pas été traités, traités avec 100 ng / ml rhFGF acide (FGF) et 1 ug / ml d&#39;héparine, ou prétraitée avec le FGF R inhibiteurs sélectifs 12-15 avant le traitement parFGF et de l&#39;héparine. Le PD173074 inhibiteurs, PD 161570 et PD 166285 ont été utilisés à une concentration de 1 uM et incubées avec les cellules Kato III pour 3 heures dans un milieu sans sérum. Bien qu&#39;il y ait une phosphorylation constitutive à la fois de l&#39;EGF R et R2 FGF dans les cellules non traitées III KATO, une augmentation de la phosphorylation R2 FGF a été observée lors du traitement FGF. L&#39;incubation des cellules avec PD 173074, PD 161570, PD 166285 ou entraîné une baisse de FGF R2 et R EGF phosphorylation. Bien que ces inhibiteurs sont connus affecter la phosphorylation des membres de la famille FGF R, ces résultats démontrent l&#39;utilité de l&#39;homme Phospho-RTK réseau pour surveiller l&#39;effet d&#39;une concentration spécifique de l&#39;inhibiteur peut avoir sur d&#39;autres RTK, tels que EGF R dans ce cas. <img alt="Figure 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;induction et l&#39;inhibition de la réceptionteur phosphorylation de la tyrosine kinase dans les cellules cancéreuses du sein. images Array de Proteome Profiler homme Phospho-RTK tableaux et les profils correspondants histogramme sont affichés. MDA-MB-453 ont des cellules non traitées ou traitées avec des inhibiteurs de RTK suivie d&#39;un traitement avec NRG-β1/HRG-β1. Le tableau a été utilisé pour surveiller les effets des inhibiteurs de la phosphorylation de la kinase MDA-MB-453 cellules. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2.jpg" /> Figure 2. Images de tableaux d&#39;induction et l&#39;inhibition de la phosphorylation de tyrosine kinase du récepteur dans les cellules de cancer gastrique. D&#39;un profileur Human Proteome Phospho-RTK réseau et les profils correspondants histogramme sont affichés. Kato cellules III étaient untréé ou traités avec des inhibiteurs de RTK suivi d&#39;un traitement avec FGF acide et de l&#39;héparine. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Références <ol><li> Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenbourg, PA, Oberg, A., Van Guelpen, B., Rutegård, J., Stenling, R., &amp; Palmqvist, les cellules R. cancer colorectal activer les fibroblastes adjacents, résultant dans FGF1/FGFR3 signalisation et l&#39;invasion accrue. Am. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011). </li><li> Morishita, A., Gong, J., Nomura, T. Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba, R., D&#39;Armiento, J., &amp; Masaki, T. L&#39;utilisation de réseau pour identifier des protéines kinases de récepteurs tyrosine ciblables pour le traitement du cancer du côlon humain. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010). </li><li> Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, B., Guo, T. Wong, GC, Socci, ND, Maki, RG,DeMatteo, RP, Besmer, P., &amp; Antonescu, CR caractérisation moléculaire des tumeurs stromales gastro-intestinales pédiatriques. Clin. Cancer Res. 14, 3204-3215 (2008). </li><li> Stommel, JM, Kimmelman, CA, Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Brennan, C, Chin, L., &amp; DePinho, RA coactivation des récepteurs tyrosine kinases affecte la réponse des cellules tumorales aux thérapies ciblées. Science. 318, 287-290 (2007). </li><li> Agarwal, S., Zerillo, C, Kolmakova, J., Christensen, JG, Harris, LN, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, et Stern, DF Association constitutivement activée de récepteur du facteur de croissance des hépatocytes (Met) à la résistance à un double inhibiteur de EGFR/Her2 non à petites cellules cellules cancéreuses du poumon. Br. Cancer juge. 100, 941-949 (2009). </li><li> Dewaele, BM, Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, CD, Coindre JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schöffski, P., Marynen, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., &amp; Dębiec-Rychter, M. Co-actif et PDGFRA EGFR sont des cibles thérapeutiques potentielles dans le sarcome intimal. Cancer Res. 70, 7304-7314 (2010). </li><li> Yoon, YK, Kim, HP, Han, SW, Hur, HS, Oh, DY, Im, SA, Bang, YJ, et Kim, Combinaison TY de l&#39;EGFR et MEK1 / 2 inhibiteur montre les effets synergiques de supprimer EGFR/HER3-dependent l&#39;activation d&#39;Akt dans les cellules humaines de cancer gastrique. Mol. Ther cancer. 8, 2526 à 2536 (2009). </li><li> Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V. Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., &amp; Ponts, les propriétés biochimiques et AJ antiproliférative de 4 - [Ar (alk) ylamino] pyridopyrimidines, une nouvelle classe chimique du puissant et spécifique du facteur de croissance épidermique inhibiteur de la tyrosine kinase du récepteur. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997). </li><li> Bos,M. Mendelsohn, J. Kim, YM, Albanell, J. Fry, DW, et Baselga, J. PD153035, un inhibiteur de tyrosine kinase, empêche l&#39;activation du récepteur épidermique de facteur de croissance et inhibe la croissance des cellules cancéreuses dans un récepteur de numéro de façon dépendante. Clin. Cancer Res. 3, 2099-2106 (1997). </li><li> Stoll, SW, Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Léopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M. Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, EF, et Elder, l&#39;utilisation différentielle JT et la localisation des tyrosine kinases récepteurs erbB dans la peau par rapport aux kératinocytes normaux et malins. néoplasies. 3, 339-350 (2001). </li><li> Klutchko, SR, Zhou, H., Les hivers, RT, Tran, TP, ponts, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Elliott, WL, Meade, MA, Roberts, BJ, Fry, DW, Gonzales, AJ, Harvey , PJ, Nelson, JM, Sherwood, V., Han, HK, Pace, G., Smaill, JB, Denny, WA, et Showalter, les inhibiteurs de tyrosine kinase HD. 19. 6-alknyamides de 4-4-anilinoquinazolines et anilinopyrido [3,4-d] pyrimidines comme inhibiteurs irréversibles de la famille erbB de récepteurs à tyrosine kinase. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006). </li><li> Kunii, K. Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M. Di Bacco, A., Elbi, C., &amp; Lutterbach, B. FGFR2-amplifiés gastriques lignées de cellules cancéreuses nécessitent FGFR2 et ErbB3 de signalisation pour la croissance et la survie. Cancer Res. 68, 2340-2348 (2008). </li><li> Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Sharma, SV, Bruges, J., Meyerson, M., Settleman, J . &amp; Gray, NS Une approche guidée par la structure à la création d&#39;inhibiteurs de FGFR covalentes. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010). </li><li> Batley, BL, Doherty, AM, Hamby, JM, Lu, GH, Keller, P., Dahring, les savoirs traditionnels, Hwang, O., Crickard, K., &amp; Panek RL L&#39;inhibition de l&#39;activité du FGF-1 récepteur tyrosine kinase de PD 161570 , une nouvelle protéine-Tyrosine kinase. Life Sci. 62 143-150 (1998). </li><li> Panek, RL, Lu GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, les savoirs traditionnels, Hamby, JM, Hallak, H., Doherty, AM, &amp; Keiser, JA In vitro caractérisation pharmacologique de PD 166285, un puissant nouveau nanomolaire et largement actif inhibiteur de protéine tyrosine kinase. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997). </li></ol>

The Human Phospho-RTK est une alternative économique et rapide aux méthodes traditionnelles telles que l&#39;immunoprécipitation (IP) de l&#39;Ouest pour les changements de dépistage de la phosphorylation RTK. En utilisant cette méthode, les niveaux relatifs de 42 phospho-RTK ont été projetés simultanément en utilisant un seul échantillon de cellules MDA-MB-453 ou un lysat de cellules Kato III. En outre, ce test tableau dont 2,5 heures de temps de manipulation, ce qui rend cette méthode beaucoup plus efficace que de temps effectuez plusieurs IP-Western. En utilisant une méthode de détection par chimiluminescence, aucun équipement spécialisé delà de ce qui est généralement utilisé pour recueillir des données occidentaux était nécessaire. Les tableaux sont sensibles et peuvent être utilisées pour comparer les changements de phosphorylation causées à la fois par ligand et le traitement inhibiteur. Cette méthode permet également l&#39;évaluation de la sélectivité inhibiteur de hors-cible RTK. Réponses positives peuvent en outre être évaluée en utilisant un dosage quantitatif comme un test ELISA. Pour utiliser efficacement des tableaux pour détecter des changementsde la phosphorylation, certaines lignes directrices clés expérimentaux doivent être suivies. Tout d&#39;abord, les expériences devraient inclure des échantillons de contrôle appropriés. Par exemple, dans ces expériences l&#39;effet des inhibiteurs de cellules MDA-MB-453 ou Kato III lysats ont été mesurées sur des échantillons de lysat préparés le jour même. Seules les données de tableau qui sont collectées au sein de la même expérience doit être analysé afin de minimiser les variations de signal en raison des différences de manipulation d&#39;échantillon, le temps d&#39;incubation, la technique de la pipette, ou la technique de lavage. Comparaison des intensités de signal entre deux analytes sur la même membrane n&#39;est pas recommandé, car les anticorps de capture n&#39;ont pas été sélectionnés pour avoir des affinités parallèles.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=ary001" target="_blank">Human Phospho-RTK Array Kit</a></td>
			<td>R&amp;D Sytems</td>
			<td>ARY001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1167</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-453 cells</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kato III cells</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=396-hb" target="_blank">Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain</a></td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>396-HB-050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=232-fa" target="_blank">Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)</a></td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>232-FA-025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDS 029</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2646</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 153035</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1037</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 158780</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2615</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 173074</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 161570</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 166285</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3785</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and pipette tips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized or distilled water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-tipped tweezers</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform shaker</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic containers with the capacity to hold 50 ml</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For washing arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transparent sheet protector</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent lab wipes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography cassette</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film developer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodak BioMax Light Film</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>178 8207</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film developer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Station 4000MM PRO</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection Scanner</td>
			<td>Epson</td>
			<td>V750 PRO</td>
			<td>Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays - advertisement

Le dérèglement de la tyrosine kinase du récepteur (RTK) expression et la phosphorylation est fréquemment associée à la propagation développement et métastatique des cellules cancéreuses 1-3. D&#39;importants efforts ont été concentrés sur les inhibiteurs de développement pour cibler RTK spécifiques et interrompre les voies de signalisation aberrantes associées à des états pathologiques 4-7. L&#39;objectif de cette étude était de mesurer les effets d&#39;un certain nombre d&#39;inhibiteurs de la phosphorylation sur RTK. Cette étude a utilisé l&#39;homme Phospho-RTK tableau, qui est un immunodosage en sandwich la membrane afin de surveiller les augmentations ou diminutions de la phosphorylation des RTK nombreux simultanément dans un seul échantillon. Dans cet essai, les deux RTK phosphorylée et non phosphorylée présente dans un échantillon de lysat sont capturées par des anticorps distincts imprimés en double à travers une membrane de nitrocellulose de la taille d&#39;une lame de microscope. Après lavage, les tableaux sont mis à incuber avec des anticorps anti-phospho-tyrosine-peroxydase de raifort (HRP),qui prend en sandwich avec RTK phosphorylés capturés sur le tableau. Après une étape de lavage élimine les tableaux sont incubés avec des réactifs chimiluminescents. Signal produit à chaque spot réseau est proportionnelle à la quantité de phospho-protéine liée par chaque anticorps de capture. Dans ces expériences, les tableaux ont été utilisés pour mesurer les augmentations de la phosphorylation suite à une stimulation du ligand soit le cancer du sein MDA-MB-453 ou KATO III cellules cancéreuses gastriques, ainsi que pour caractériser une diminution de la phosphorylation associés au traitement des cellules avec des inhibiteurs sélectifs envers ErbB ou les membres de la famille FGF R.

Tableaux Proteome anticorps profils sont un moyen pratique et économique pour détecter des changements dans la tyrosine kinase du récepteur (RTK) phosphorylation sans effectuer de nombreuses immunoprécipitation (IP) Westerns. Le tableau RTK ARY001 humain permet la mesure qualitative des RTK multiples dans un seul échantillon en utilisant une détection par chimiluminescence.

Les changements de profilage dans phosphorylation tyrosine kinase du récepteur à l&#39;aide des puces à anticorps - Publicité

The dysregulation of receptor tyrosine kinase (RTK) expression and phosphorylation is frequently associated with the development and metastatic spread of ...

profiling-changes-receptor-tyrosine-kinase-phosphorylation-using

Without Section

Profiling Changes in Receptor Tyrosine Kinase Phosphorylation using Antibody Arrays - ADVERTISEMENT

11.5K vues.  R&D Systems, Inc.. Tableaux Proteome anticorps profils sont un moyen pratique et économique pour détecter des changements dans la tyrosine kinase du récepteur (RTK) phosphorylation sans effectuer de nombreuses immunoprécipitation (IP) Westerns. Le tableau RTK ARY001 humain permet la mesure qualitative des RTK multiples dans un seul échantillon en utilisant une détection par chimiluminescence.

Vidéo: Les changements de profilage dans phosphorylation tyrosine kinase du récepteur à l'aide des puces à anticorps - Publicité

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids 1-6, the unfolding of proteins 7, and binding affinity of different ligands 8. By coupling these nanopores to the resistive-pulse technique 9-12, such measurements can be done under a wide variety of conditions and without the need for labeling 3. In the resistive-pulse technique, an ionic salt solution is introduced on both sides of the nanopore. Therefore, ions are driven from one side of the chamber to the other by an applied transmembrane potential, resulting in a steady current. The partitioning of an analyte into the nanopore causes a well-defined deflection in this current, which can be analyzed to extract single-molecule information. Using this technique, the adsorption of single proteins to the nanopore walls can be monitored under a wide range of conditions 13. Protein adsorption is growing in importance, because as microfluidic devices shrink in size, the interaction of these systems with single proteins becomes a concern. This protocol describes a rapid assay for protein binding to nitride films, which can readily be extended to other thin films amenable to nanopore drilling, or to functionalized nitride surfaces. A variety of proteins may be explored under a wide range of solutions and denaturing conditions. Additionally, this protocol may be used to explore more basic problems using nanopore spectroscopy.

A method of using solid-state nanopores to monitor the non-specific adsorption of proteins onto an inorganic surface is described. The method employs the resistive-pulse principle, allowing for the adsorption to be probed in real-time and at the single-molecule level. Because the process of single protein adsorption is far from equilibrium, we propose the employment of parallel arrays of synthetic nanopores, enabling for the quantitative determination of the apparent first-order reaction rate constant of protein adsorption as well as and the Langmuir adsorption constant.

Surveillance des protéines par adsorption à semi-conducteurs Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Recherche

JoVE Journal

Bio-ingénierie

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Déterminer l&#39;activité phagocytaire des échantillons d&#39;anticorps cliniques

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Immunologie et infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Neurosciences

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

Profilage anticorps par immunoprécipitation Systèmes luciférase (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Biologie

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: préparation d&#39;échantillons à la détection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in adulthood 1,2,3. Inactivating mutations in KISS1R identified in patients have been associated with iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2 and precocious puberty 4. Functional studies of these mutants are crucial for our understanding of the mechanisms underlying the regulation of reproduction by this receptor as well as those shaping the disease outcomes, which result from abnormal KISS1R signaling and function. However, the highly GC-rich sequence of the KISS1R gene makes it rather difficult to introduce mutations or amplify the gene encoding this receptor by PCR.
Here we describe a method to introduce mutations of interest into this highly GC-rich sequence that has been used successfully to generate over a dozen KISS1R mutants in our laboratory. We have optimized the PCR conditions to facilitate the amplification of a range of KISS1R mutants that include substitutions, deletions or insertions in the KISS1R sequence. The addition of a PCR enhancer solution, as well as of a small percentage of DMSO were especially helpful to improve amplification. This optimized procedure may be useful for other GC-rich templates as well.
The expression vector encoding the KISS1R is been used to characterize signaling and function of this receptor in order to understand how mutations may change KISS1R function and lead to the associated reproductive phenotypes. Accordingly, potential applications of KISS1R mutants generated by site-directed mutagenesis can be illustrated by many studies 1,4,5,6,7,8. As an example, the gain-of-function mutation in the KISS1R (Arg386Pro), which is associated with precocious puberty, has been shown to prolong responsiveness of the receptor to ligand stimulation 4 as well as to alter the rate of degradation of KISS1R 9. Interestingly, our studies indicate that KISS1R is degraded by the proteasome, as opposed to the classic lysosomal degradation described for most G protein-coupled receptors 9. In the example presented here, degradation of the KISS1R is investigated in Human Embryonic Kidney Cells (HEK-293) transiently expressing Myc-tagged KISS1R (MycKISS1R) and treated with proteasome or lysosome inhibitors. Cell lysates are immunoprecipitated using an agarose-conjugated anti-myc antibody followed by western blot analysis. Detection and quantification of MycKISS1R on blots is performed using the LI-COR Odyssey Infrared System. This approach may be useful in the study of the degradation of other proteins of interest as well.

Mutations in the kisspeptin receptor (KISS1R) are associated with reproductive disorders in patients. Here we describe how to introduce mutations of interest in the GC-rich sequence of KISS1R as well as the use of KISS1R constructs to characterize the degradation pathway of the receptor by immunoprecipitation and western blot.

Mutagenèse et d&#39;analyse des mutations génétiques dans la séquence riches en GC récepteur KISS1 identifiés chez l&#39;homme souffrant de troubles de la reproduction

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Activités de surveillance kinase et la phosphatase dans le cycle cellulaire par Ratiométrique FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Dosage de l&#39;activité kinase de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Conception et utilisation des tableaux chémostat multiplexés

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...