この作品は、R＆D Systems社によって資金を供給された

1。試料調製<ol><li>人間ホスホ-RTKアレイデータシートに記載されているガイドラインに従って、未処理、リガンドが処理、またはインヒビターおよびリガンド処理した細胞からライセートを収集します。溶解バッファーは、このキット用に最適化されている。他の溶解バッファーの置換は、配列の最後のパフォーマンスに影響を与える可能性があります。タンパク質分解サンプルの劣化を防ぐために、10μg/ mlのアプロチニン、10μg/ mlのロイペプチン、10μg/ mlのペプスタチン各使用のための新鮮な各細胞溶解物の準備に必要な溶解バッファーのボリュームに追加します。 </li><li>ライセート濃度はビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いて測定されるべきである。試料濃度は、経験的に最適な感度と低バックグラウンドのために調整することができる。ライセートの100から300μgの範囲は、最初の出発点として推奨されています。 </li><li>サンプルの凍結/融解サイクルは避けるべきであり、溶解物の適切なストレージが最適なパフォーマンスを得るために必要とされる。氷の上で凍結溶解物サンプルを解凍します。 </li></ol><ol><li>使用前に室温にすべてのキット部品を持参してください。手順を実行する際は、汚染を避けるため、手袋を着用してください。 </li><li>使用する4ウェルマルチディッシュの各ウェルに配列バッファ1のピペット2.0ミリリットル。配列バッファ1にブロックバッファとして機能します。 </li><li>フラットチップピンセットを使用して、4穴マルチディッシュのウェルに保護シートと場所の間から使用する各膜を除去します。配列番号が上向きされるべきである。 </li><li>配列バッファ1と接触すると、スポットから青色色素は消えますが、捕捉抗体は、それらの特定の位置に保持されます。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上で1時間インキュベートする。各配列の岩は、その十分の端から端ようオリエントトレイ。アレイの表面は完全に濡らし、ブロックバッファによってカバーされるべきである。 </li><li>膜が遮断されていますが、アレイバッファー1を1.5 mlの最終体積に細胞溶解物の所望量を希釈します。 </li> &lt;4穴マルチディッシュのウェルからLI&gt;吸引アレイバッファー1および希薄化後ライセートソリューションを追加します。 4穴マルチディッシュに蓋を置きます。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上で2〜8℃で一晩インキュベートする。最適な感度が必要ない場合は短いインキュベーション時間を用いてもよい。 </li><li>慎重1X洗浄バッファー20mlで個々のプラスチックの容器に4ウェルマルチディッシュと場所から各膜を除去します。 4穴マルチディッシュは洗浄ステップを完了するために使用することはできません。脱イオン水または蒸留水で4穴マルチディッシュをすすぎ、完全に乾燥させます。 </li><li>ロッキングプラットフォームシェーカー上で10分間1X洗浄バッファーで各メンブレンを洗浄します。 3回洗浄し、合計2回繰り返します。 </li><li>バイアルラベルに希釈係数を使用して2 1X配列バッファーに抗ホスホ - チロシン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）検出バッファーで希釈します。 4穴マルチディッシュの各ウェルに希釈した溶液をピペットで2.0ミリリットル。 </li><li>慎重に洗浄コンテナから各膜を除去します。過剰なバッファが膜から排出し、希釈した抗リン酸化チロシン-HRPを含む4穴マルチディッシュに膜を返すことができます。蓋付き井戸をカバーしています。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上で室温で2時間インキュベートする。 </li><li>前述のように、各アレイを洗浄します。 </li><li>中断されることなく残りの手順を完了します。慎重に洗浄コンテナから各膜を除去します。過剰なバッファが吸収紙の上下端をブロッティングにより膜から排出させます。上向きに識別番号が付いているプラ​​スチックシートプロテクターに各膜を置きます。 </li><li>準備ケミコン試薬のピペット1ミリリットルは、各膜上に均一に混ぜる。膜当たりケミコンの試薬ミックス未満の1ミリリットルを使用すると、不完全な膜のカバレッジになることがあります。ケミコン試薬1と2のためのいくつかの高強度の化学発光試薬の置換は、試薬に依存して増加又は減少させた背景信号のいずれかが発生することがあります。 </li><li>慎重にプラスチックでカバーシートプロテクター。ゆっくり気泡を滑らかにし、ケミコンの試薬ミックスは、各膜の隅々に均等に分散されていることを確認してください。 1分間インキュベートします。 </li><li>位置は、用紙の上部と膜を含有するプラスチックシートプロテクターの両側にタオルと慎重に過剰ケミコンの試薬ミックスを絞り出す。 </li><li>上部プラスチックシートプロテクターを取り外し、慎重に吸収ラボが残っているケミコンの試薬ミックスをオフに滲み膜の上に拭いて横たわっていた。 </li><li>底のプラスチックシートプロテクターに膜を残し、ラップを優しく気泡を滑らかにするために世話をして膜をカバーしています。膜やシートプロテクターが完全に包まれるように、シートプロテクターの背面の周囲に過剰なラップを包みます。 </li><li>放射性同位元素の検出で使用されていないオートラジオグラフィーフィルムカセットに、上向きに識別番号を持つ膜を置きます。 </li><li> 1から10分間コダックバイオマックスライトフィルムに公開します。多重露光recommアール終了しました。代わりに、画像はこのようなケアストリームヘルスとして化学発光互換イメージャを使用して収集されてもよい イメージステーション4000ミリメートルのPRO。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li>現像したフィルムに見られる正の信号がすばやくアレイ画像に透明のオーバーレイを配置し、この目的のためのコーナーで印刷基準スポットのペアで揃えることによって同定することができる。アレイ上のスタンプ識別番号が残っていた側に配置されるべきである。コントロールと捕捉抗体の位置は人間ホスホ-RTKアレイシートの付録に記載されています。 </li><li>現像したフィルム上のピクセル密度は、エプソンパーフェクV750 Proなどの伝送モードのスキャナを使用して収集することができる。 </li><li>適切な画像解析ソフトウェアプログラムを使用して、配列の各スポットで画素密度を解析するためのテンプレートを作成します。互換性のあるプログラムは、GE、ウェスタンビジョンSOFからImageQuantまたはArrayVisionソフトウェアが含まれていますプロファイラアレイ、バイオラッド数量ワン、Adobe Photoshopのは、NIH ImageJの、およびタンパク質シンプルAlphaViewをプロテオームに固有のテンプレートを使用しtware。 </li><li> Microsoft Excelなどのプログラムでの操作のためのスプレッドシートファイルに信号値をエクスポートします。 </li><li>各RTKを表す重複スポットのペアの平均信号（画素密度）を決定します。 </li><li>各スポットからの平均バックグラウンド信号を減算します。バックグラウンド値として配列またはネガティブコントロールスポットのクリアなエリアからの信号を使用します。 </li><li>サンプル間のRTKのリン酸化レベルの相対的な変化を決定するために、異なるアレイ上の対応する信号を比較してください。 </li></ol> 4。代表的な結果このプロトコルは、人間のホスホ-RTKアレイがRTKのリン酸化に対するリガンド刺激や阻害剤の効果をスクリーニングするために使用することができる方法を示しています。 図1では、データは100 ngので処理し、処理しなかったMDA-MB-453細胞のために示されて/ mlの5分間rhNRG-β1/HRG-β1（HRG-β1）、または既知のErbBファミリー阻害剤前HRGβ1治療に8月11日で前処理した。阻害剤の実験のために、細胞を1μMのHDS 029、200nMのPD 153035、または3時間の200 nMのSFM中、PD 158780と共にインキュベートした。各アレイは、ライセートの100μgとインキュベートした。リン酸化の増加は、ErbB2と、ErbB3のために観察され、ErbB4はキャプチャスポットHRG-β1を未処理の細胞を比較し、MDA-MB-453細胞を処理しています。前HRG-β1のインキュベーションにすべての3つのErbBフ​​ァミリー選択的阻害剤で細胞を処理するには、ErbB2の量の削減、ErbB3の、そしてErbB4はリン酸化を引き起こした。 図2では、データがRTKのFGF R2を過剰発現することが知られて加藤III細胞のために示されている。この一連の実験では、加藤III細胞は前と治療〜100 ng / mlのrhFGF酸性（FGF）および1μg/ mlのヘパリン、またはFGF R選択的阻害剤で前処理した12月15日で処理し、処理しなかったFGFおよびヘパリン。阻害剤PD173074、PD 161570、およびPD 166285は1μMの濃度で使用し、無血清培地中で3時間加藤III細胞と共にインキュベートした。未処理KATO III細胞のEGFとFGF R R2の両方の構成的リン酸化がありますが、FGF-R2のリン酸化の増加は、FGF治療時に観察された。 PD 173074、PD 161570、またはPD 166285で細胞をインキュベートして、FGF-R2およびEGF Rのリン酸化を減少をもたらした。これらの阻害剤は、FGF-Rファミリーメンバーのリン酸化に影響を知られているが、これらの結果は、阻害剤の特定の濃度は、この場合に例えばEGF Rなどの他のRTK、に与える影響を監視するためのヒューマン·ホスホ-RTKアレイの有用性を実証する。 <img alt="図1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1.jpg" /> 図1。受容の誘導と阻害乳癌細胞におけるTorのチロシンキナーゼリン酸化プロテオームプロファイラ人間ホスホ-RTKアレイおよび対応するヒストグラムプロファイルからアレイ画像が表示されます。 MDA-MB-453細胞を未処理またはNRG-β1/HRG-β1で処理してRTK阻害剤で処理した。配列は、MDA-MB-453細胞におけるキナーゼリン酸化に対する阻害剤の影響を監視するために使用された。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2.jpg" /> 図2。胃癌細胞における受容体チロシンキナーゼのリン酸化の誘導と抑制。プロテオームプロファイラ人間ホスホ-RTKアレイと対応するヒストグラムプロファイルからのアレイの画像が表示されます。加藤III細胞がUNTだったreatedまたはFGF酸性およびヘパリンで処理してRTK阻害剤で処理する。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 参照<ol><li> Henriksson、ML、エディン、S. Dahlin、AM Oldenborg、PA、オーバーグ、A.ヴァンGuelpen、B. Rutegard、J. Stenling、R.＆Palmqvistは、R.、大腸がん細胞は、結果の隣接する線維芽細胞を活性化するFGF1/FGFR3シグナリングと増加侵略インチアム。 J.病理。178、1387年から1394年（2011年）。 </li><li>森下、A.、ゴング、J.、野村哲也、吉田宏Izuishi、K.、鈴木洋一、櫛田、Y.、羽場、R. D&#39;Armiento、J.、＆正樹、 T·タンパク質配列の使用は、ヒト大腸癌の治療のためのターゲッティング受容体チロシンキナーゼを同定した。Intです。 J. Oncol 37、829から835（2010）。 </li><li> Agaram NP、Laquaglia、MP、Ustun、B.、郭、T.ウォ​​ン、GC、ソッチ、ND、マキ、RGDeMatteo、RP、Besmer、P.＆Antonescu、小児の消化管間質腫瘍のCR分子特性。CLIN。癌解像度 14、3204から3215（2008）。 </li><li>ストンメル、JM Kimmelman、交流、英、H. Nabioullin、R. Ponugoti AH、Wiedemeyer、R. Stegh AH、ブラドナー、JEリゴン、KL、ブレナン、C.チン、L.、＆ DePinhoは、受容体チロシンキナーゼのRAの同時活性化は、標的療法に対する腫瘍細胞の応答に影響を及ぼします。 科学 。318、287から290（2007）。 </li><li> Agarwalさん、S. Zerillo、C. Kolmakova、J.クリステンセン、JG、ハリス、LN、RIMM、DL DiGiovanna、MP＆スターンに対する耐性を持つ構成的に活性化肝細胞増殖因子受容体のDF協会（Met）の非小細胞肺癌細胞におけるデュアルEGFR/Her2阻害剤。Brである。 J.がん。100、941から949（2009）。 </li><li> Dewaele、BM、フロリス、G. Finalet-Ferreiro、J.フレッチャー、CD Coindre、JMギユー、L. Hogendoorn、パソコン、Wozniak氏、A. Vanspauwen、V. Schoffski、P. Marynen、P. Vandenbergh、P. Sciot、R.＆Debiec-Rychter、M.、共同活性化PDGFRAとEGFRは、内膜肉腫の潜在的な治療標的である。 がんResは70、7304から7314（2010）。 </li><li>ユン、YK、キムは、HP、漢、SW、許、HS、ああ、DYイムSA、バン、YJ、＆キム、EGFRおよびMEK1 / 2阻害剤のTYの組み合わせは抑制EGFR/HER3-dependentによる相乗効果を示していますヒト胃癌細胞におけるAKT活性化。 モル。がんTHER。8、2526年から2536年（2009年）。 </li><li>フライ、DW、ネルソン、JM Slintak、V.ケラー、PR Rewcastle、GW、デニー、ワシントン、周、H.、＆ブリッジ、4のAJの生化学的および抗増殖特性 - [AR（アルク） - イルアミノ]ピリド、強力かつ特異的な上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤の新たな化学クラス。 バイオケム。薬理学54、877から887（1997）。 </li><li> BOS、M.、メンデルゾーン、J.キム、YM Albanell、J.フライ、DW＆Baselga、J. PD153035、チロシンキナーゼ阻害剤は、上皮成長因子受容体の活性化を抑制し、受容体の数の癌細胞の増殖を抑制する依存的。CLIN。癌解像度 3、2099年から2106年（1997年）。 </li><li>ストール、SW、Kansra、S. Peshick、S.フライ、DW、レオポルド、WR Wiesenの、JF、Sibilia、M.、チャン、T. Werb、Z. Derynck、R.ワーグナー、EF、 ＆エルダー、正常および悪性のケラチノサイトに比べて皮膚のErbB受容体チロシンキナーゼのJTの差の利用率とローカライズ。 新形成。3、339から350（2001）。 </li><li> Klutchko、SR周、H.、ウィンターズ、RT、トラン、TP、橋、AJ Althau、IW、アマート、DM、エリオット、WL、ミード、マサチューセッツ、ロバーツ、BJ、フライ、DW、ゴンザレス、AJハーヴェイ、PJ、ネルソン、JM、シャーウッド、V.、漢、香港、ペイス、G. Smaill、JB、デニー、WA＆ショウォーター、HDのチロシンキナーゼ阻害剤。 19。 6-ALKチロシンキナーゼ受容体ErbBファミリーの不可逆的阻害剤として4-anilinoquinazolinesと4 anilinopyrido [3,4-d]ピリミジンのnyamides、J.メッド。ケム49、1475年から1485年（2006年）。 </li><li>國井、K.デイビス、L. Gorenstein、J.、ハッチ、H.、矢代、M.ディ·バッコ、A. Elbi、C.＆Lutterbachのは、B. FGFR2増幅された胃癌細胞株はFGFR2を必要とするとERBB3成長と生存のために合図する。 がんResは68、2340から2348（2008）。 </li><li>周、W.、許、W·マクダーモット、U.ダット、A.、西安、W. Ficarro、SBチャン、J.、シャルマ、SV、ブルージュ、J.マイヤーソン、M. Settleman、J 。＆グレー、NS共有FGFRの阻害剤を作成するための構造誘導アプローチ。 ケム。 BIOL 17、285から295（2010）。 </li><li> PD 161570により、FGF-1受容体チロシンキナーゼ活性のバトリー、BL、ドハーティ、AM、ハンビー、JM、呂、GHケラー、P. Dahring、TK、黄、O.、Crickard、K.＆Panek RLの阻害、新たなタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤。 生命科学62 143から150（1998）。 </li><li> Panek、RL、呂GH、Klutchko、SR、バトリー、BL、Darhing、TK、ハンビー、JM Hallak、H.、ドハーティ、AM＆カイザー、PD 166285 の in vitro薬理特性評価における JA、新しいナノモル強力かつ広範に活性タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、J.薬理学。経験。 THER。283、1433年から1444年（1997年）。 </li></ol>

人間ホスホ-RTKは、RTKのリン酸化の変化をスクリーニングするためのウェスタン免疫沈降（IP）などの従来の方法に経済的かつ高速な代替手段です。この方法を使用すると、42ホスホ-RTKの相対的なレベルは、MDA-MB-453や加藤IIIの細胞溶解物の単一のサンプルを使用して同時にスクリーニングした。また、このアレイアッセイは、この方法の方がはるかに時間効率の複数のIP-西部劇を実行するよりも作り、2.5時間のハンズオンタイムを必要とした。化学発光検出法を用いることにより、一般的に欧米のデータを収集するために使用されるものを超えない特殊な機器は必要ありませんでした。配列は敏感であり、リガンドおよびインヒビター治療の両方によって引き起こされるリン酸化の変化を比較するために用いることができる。また、このメソッドは、オフターゲットのRTKに対する阻害剤選択性の評価を可能にします。肯定的なヒットはさらにELISAなどの定量的アッセイを用いて評価することができる。 効果的に変更するための画面に配列を採用するリンでは、いくつかの重要な実験のガイドラインに従う必要があります。まず、実験は適切なコントロールサンプルを含める必要があります。例えば、これらの実験では、MDA-MB-453や加藤IIIの溶解液に阻害剤の効果は、同じ日に準備ライセート試料で測定した。同じ実験内で収集された唯一の配列データは、サンプル処理の違い、インキュベーション時間、ピペット技法、または洗浄技術に起因する信号のばらつきを最小限にするために分析されるべきである。捕捉抗体が平行親和性を有するように選択されていなかったので、同じ膜上の2つの分析対象物との間の信号強度を比較することは、推奨されません。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=ary001" target="_blank">Human Phospho-RTK Array Kit</a></td>
			<td>R&amp;D Sytems</td>
			<td>ARY001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1167</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-453 cells</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kato III cells</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=396-hb" target="_blank">Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain</a></td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>396-HB-050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=232-fa" target="_blank">Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)</a></td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>232-FA-025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDS 029</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2646</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 153035</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1037</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 158780</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2615</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 173074</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 161570</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 166285</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3785</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and pipette tips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized or distilled water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-tipped tweezers</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform shaker</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic containers with the capacity to hold 50 ml</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For washing arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transparent sheet protector</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent lab wipes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography cassette</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film developer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodak BioMax Light Film</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>178 8207</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film developer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Station 4000MM PRO</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection Scanner</td>
			<td>Epson</td>
			<td>V750 PRO</td>
			<td>Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays - advertisement

受容体チロシンキナーゼ（RTK）の発現とリン酸化の調節不全は、頻繁に癌細胞の開発と転移拡散に関連付けられています1月3日の重要な努力が特定のRTKを標的とし、病気の状態に関連付けられている異常なシグナル伝達経路を遮断するように開発阻害剤が注目されている本研究の目的は、4月7日 RTKのリン酸化に対する阻害剤の選択数の効果を測定することであった。本研究では、単一のサンプルで同時に多数のRTKのためのリン酸化の増加または減少を監視するための膜ベースのサンドイッチ免疫測定法である人間のホスホ-RTKの配列を使用していました。このアッセイでは、ライセート試料中に存在する両方のリン酸化および非リン酸化RTKは、ニトロセルロース膜を横切って顕微鏡スライドのサイズを二重に印刷された離散的な抗体によって捕捉されます。洗浄後、アレイは、抗ホスホ - チロシン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とともにインキュベートするアレイ上に捕捉したリン酸化RTKのと挟む。第2の洗浄工程の後に、配列は化学発光試薬と共にインキュベートする。各アレイスポットで生成された信号は、各キャプチャ抗体が結合したリン酸化タンパク質の量に比例する。これらの実験では、配列は、MDA-MB-453乳癌またはKATO III胃癌細胞と同様に、ErbB受容に向けた選択的阻害剤で細胞を処理するに関連付けられているリン酸化の減少を特徴づけるためにいずれかのリガンド刺激後のリン酸化の増加を測定するために用いたまたはFGF Rファミリーのメンバー。

プロテオームプロファイラ抗体アレイは、多数の免疫沈降（IP）西部劇を行うことなく、受容体チロシンキナーゼ（RTK）のリン酸化の変化をスクリーニングするための便利でコスト効率の良い方法です。 ARY001人間のRTKアレイは、化学発光検出を使用して、単一のサンプル中の複数のRTKの定性的な測定が可能になる。

抗体アレイを用いた受容体チロシンキナーゼリン酸化におけるプロファイリングの変更 - 広告

The dysregulation of receptor tyrosine kinase (RTK) expression and phosphorylation is frequently associated with the development and metastatic spread of ...

profiling-changes-receptor-tyrosine-kinase-phosphorylation-using

Without Section

Profiling Changes in Receptor Tyrosine Kinase Phosphorylation using Antibody Arrays - ADVERTISEMENT

11.5K ビュー.  R&D Systems, Inc.. プロテオームプロファイラ抗体アレイは、多数の免疫沈降（IP）西部劇を行うことなく、受容体チロシンキナーゼ（RTK）のリン酸化の変化をスクリーニングするための便利でコスト効率の良い方法です。 ARY001人間のRTKアレイは、化学発光検出を使用して、単一のサンプル中の複数のRTKの定性的な測定が可能になる。

ビデオ: 抗体アレイを用いた受容体チロシンキナーゼリン酸化におけるプロファイリングの変更 - 広告

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids 1-6, the unfolding of proteins 7, and binding affinity of different ligands 8. By coupling these nanopores to the resistive-pulse technique 9-12, such measurements can be done under a wide variety of conditions and without the need for labeling 3. In the resistive-pulse technique, an ionic salt solution is introduced on both sides of the nanopore. Therefore, ions are driven from one side of the chamber to the other by an applied transmembrane potential, resulting in a steady current. The partitioning of an analyte into the nanopore causes a well-defined deflection in this current, which can be analyzed to extract single-molecule information. Using this technique, the adsorption of single proteins to the nanopore walls can be monitored under a wide range of conditions 13. Protein adsorption is growing in importance, because as microfluidic devices shrink in size, the interaction of these systems with single proteins becomes a concern. This protocol describes a rapid assay for protein binding to nitride films, which can readily be extended to other thin films amenable to nanopore drilling, or to functionalized nitride surfaces. A variety of proteins may be explored under a wide range of solutions and denaturing conditions. Additionally, this protocol may be used to explore more basic problems using nanopore spectroscopy.

A method of using solid-state nanopores to monitor the non-specific adsorption of proteins onto an inorganic surface is described. The method employs the resistive-pulse principle, allowing for the adsorption to be probed in real-time and at the single-molecule level. Because the process of single protein adsorption is far from equilibrium, we propose the employment of parallel arrays of synthetic nanopores, enabling for the quantitative determination of the apparent first-order reaction rate constant of protein adsorption as well as and the Langmuir adsorption constant.

ソリッドステートナノ細孔を持つ監視タンパク質吸着

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Research

JoVE Journal

生物工学

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

臨床抗体サンプルの貪食活性を決定する

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

免疫・感染学

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

神経科学

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

ルシフェラーゼ免疫系による抗体のプロファイリング（LIPS）

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

生物学

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in adulthood 1,2,3. Inactivating mutations in KISS1R identified in patients have been associated with iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2 and precocious puberty 4. Functional studies of these mutants are crucial for our understanding of the mechanisms underlying the regulation of reproduction by this receptor as well as those shaping the disease outcomes, which result from abnormal KISS1R signaling and function. However, the highly GC-rich sequence of the KISS1R gene makes it rather difficult to introduce mutations or amplify the gene encoding this receptor by PCR.
Here we describe a method to introduce mutations of interest into this highly GC-rich sequence that has been used successfully to generate over a dozen KISS1R mutants in our laboratory. We have optimized the PCR conditions to facilitate the amplification of a range of KISS1R mutants that include substitutions, deletions or insertions in the KISS1R sequence. The addition of a PCR enhancer solution, as well as of a small percentage of DMSO were especially helpful to improve amplification. This optimized procedure may be useful for other GC-rich templates as well.
The expression vector encoding the KISS1R is been used to characterize signaling and function of this receptor in order to understand how mutations may change KISS1R function and lead to the associated reproductive phenotypes. Accordingly, potential applications of KISS1R mutants generated by site-directed mutagenesis can be illustrated by many studies 1,4,5,6,7,8. As an example, the gain-of-function mutation in the KISS1R (Arg386Pro), which is associated with precocious puberty, has been shown to prolong responsiveness of the receptor to ligand stimulation 4 as well as to alter the rate of degradation of KISS1R 9. Interestingly, our studies indicate that KISS1R is degraded by the proteasome, as opposed to the classic lysosomal degradation described for most G protein-coupled receptors 9. In the example presented here, degradation of the KISS1R is investigated in Human Embryonic Kidney Cells (HEK-293) transiently expressing Myc-tagged KISS1R (MycKISS1R) and treated with proteasome or lysosome inhibitors. Cell lysates are immunoprecipitated using an agarose-conjugated anti-myc antibody followed by western blot analysis. Detection and quantification of MycKISS1R on blots is performed using the LI-COR Odyssey Infrared System. This approach may be useful in the study of the degradation of other proteins of interest as well.

Mutations in the kisspeptin receptor (KISS1R) are associated with reproductive disorders in patients. Here we describe how to introduce mutations of interest in the GC-rich sequence of KISS1R as well as the use of KISS1R constructs to characterize the degradation pathway of the receptor by immunoprecipitation and western blot.

生殖障害を持つヒトで同定されたGC -リッチなKISS1受容体配列の遺伝的変異の変異導入と解析

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

多重ケモスタットアレイの設計および使用

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...