이 작품은 잭슨 연구소에서 시작 기금에 의해 지원됩니다.

1. Neuronal 문화 컨디셔닝을 위해 마우스 Glia 문화 준비 <ol><li> T75 플라스크는 콜라겐 솔루션 (ddH 2 O의 Purecol의 1시 3분 희석)로 코팅되어 있습니다. 플라스크는 수직으로 설정하고 조직 문화 후드에서 하룻밤 건조 남아 있습니다. </li><li> 해부 버퍼 (aCSF : 119 MM NaCl, 5 MM KCl, 1 MM MgCl 2, 30 MM 덱스 트로 오스, 25 밀리미터 HEPES, 칼슘없이 산도 7.4)과 glia 미디어 (DMEM 10 % FBS, 10 단위 / ML 페니실린, 10과 보충 μg / ML의 스트렙토 마이신, 그리고 Glutamax)는 ° C 사용을위한 준비가 될 때까지 준비 및 4에 저장됩니다. </li><li> glia 문화의 날, glia 미디어는 마우스 뇌의 해부하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 최소 30 분 동안 데워 있습니다. 배아 또는 신생아 쥐들이 빠른 목 베기에 의해 euthanized 있습니다. 뇌성 cortexes은 해부 현미경 아래에서 해부하고 있습니다. </li><li> 해부하는 뇌 조직은 37 papain 솔루션 (100 ML papain, 2 ML의 해부 버퍼 20 μl 1% DNase I)에 소화 ° C 구경R 20 분. </li><li> papain을 소화 따라, 뇌 조직은 10 ML 미리 예열 glia 미디어로 헹구어 있습니다. 신선한 glia 미디어 (2 ML)은 다음 소화 뇌 조직에 추가되고, 조직은 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 triturated 있습니다. </li><li> 신선한 glia 미디어 (8 ML)는 dissociated 조직에 추가됩니다. 70 μm 셀 스트레이너는 dissociated 조직 정지를 필터링하는 데 사용됩니다. 셀은 다음 T75 플라스크 (보통 2-3 배아 수있는 씨앗이 한 T75 플라스크)에 놓는과 37 ° C 세포 배양 인큐베이터에 배치됩니다. </li><li> 다음 날은 T75 플라스크에서 미디어가 흡입된다. 플라스크는 10 ML PBS로 헹구어 있습니다. 신선한 glia 미디어 (10-15 ML)는 다음 각 플라스크에 추가됩니다. </li><li> 10-12일 내에 T75 플라스크에 glia이 합류해야합니다. Glial 세포는 PBS로 헹구어되며, 0.05 % 트립신의 5 ML은 각 T75 플라스크에 추가됩니다. </li><li> 5 분에 대한 ° C 37 번 트립신의 부화 후, glial 세포가 각각 T75 플라스크에서 dissociated와 glial 세포가 두 개로 분할 아르다른 콜라겐 - 코팅 T75 플라스크. </li><li> 문화 삽입 (Millipore PICM03050)는 6 잘 접시, 콜라겐 코팅을하고, 하루 아침에 공기 건조에 붙여 넣어 준비가되어 있습니다. Glia 미디어 (2 ML 각) 각 문화 삽입 아래에 배치됩니다. </li><li> 합류 T75 플라스크에서 Glia는 trypsinized (6 - 잘 접시 당 하나의 T75 플라스크, 2 ML 각 삽입) 문화 삽입에 놓는 있습니다. 이 glia 문화 삽입은 조건 neuronal 문화를하는 데 사용됩니다. </li></ol> 2. Neuronal 문화 <ol><li> neuronal 문화 유리 coverslips은 70 %에 최소 하루 아침에 HNO 3 몸을 담글 수에 의해 청소됩니다. Coverslips 그 다음 ddH 2 O 적어도 3 번과 세척, 그리고 (&gt; 200 ° C) 밤 Isotemp 오븐에서 건조됩니다. </li><li> 청소 coverslips는 6 잘 플레이트, 잘 당 하나의 coverslip에 배치됩니다. Coverslips는 폴리-L-라이신 솔루션 (100 MM 붕산 2 ML, 0.1 %, 산도 = 8.5) 37 ° C 배양기에서 하룻밤으로 코팅되어 있습니다. </li><li>폴리-L-라이신 솔루션은 coverslips에서 제거되고 coverslips는 autoclaved ddH 2 O.으로 3 번 씻어 아르 Coverslips 그런 다음 37 incubated 아르 (Neurobasal 5 % 열 inactivated 말 혈청, 10 단위 / ML 페니실린, 10 μg / ML 스트렙토 마이신, Glutamax로 보​​충 도금 미디어에서 밤새 ° C 배양기, 도금 매체에 추가됩니다 2퍼센트 B27 보충 하루에)이 사용됩니다. </li><li> B-27와 다음 날, 도금 미디어가 제거되고 신선한 도금 매체 2 ML은 유리 coverslip이 각 잘에 추가됩니다. </li><li> 임산부 마우스 (E15-18)은 CO 2 euthanized되며, 배아 쥐들이 목 베기에 의해 euthanized 있습니다. 해마 나 striatum은 뇌 조직에서 해부하는 각각 hippocampal 뉴런 또는 striatal 중간 가시의 뉴런의 문화 얼음처럼 차가운 분해 버퍼와 15 ML 원뿔 튜브에 배치됩니다. </li><li> 단계 1.4) 및 1.5)에 설명 된대로 해부하는 뇌 조직은 papain과 dissociated 있습니다. </li><li> 에프해리 따르게 각 neuronal 정지 세포의 수는 hemocytometer로 계산됩니다. 뉴런은 다음 6 잘 접시의 당 잘 0.4 X 10 6 세포의 밀도 각 coverslip에 놓는, 그리고 37 ° C 배양기 새벽에 배양합니다 (뉴런이 DIV 0아르). </li><li> 에어컨 neuronal 문화에 대한 glia 문화 삽입을 준비하려면, glia 미디어는 glia 문화 삽입에서 제거하고 신선한 도금 매체는 (삽입 아래에 삽입 2 ML 2 ML) 추가됩니다. </li><li> 다음 날 (DIV 1), 뉴런과 coverslips는 glia 문화 삽입, 각도에 한 coverslip 아래에 배치됩니다. </li><li> 그들은 transfection 및 이미징 실험을위한 준비가 될 때까지 뉴런은 신선한 미리 데워 먹이 미디어 (B-27 포함) 모든 3~4일의 절반 볼륨으로 공급하고 있습니다. </li></ol> 3. Transfection <ol><li> Neuronal transfection은 Lipofectamine 2000을 사용하여 수행됩니다. 각 neuronal 문화 (coverslip 당 하나의 문화), 2 μlLipofectamine 2000 및 DNA 1 μg이 사용됩니다. 더 보충과 신선한 Neurobasal 매체가 Lipofectamine와 DNA를 희석하는 데 사용됩니다. </li><li> DNA와 Lipofectamine은 혼합 후 실온에서 20 분에 incubated 수 있습니다. </li><li> 각 삽입 내에서 각 glia 문화 삽입 아래에서 미디어 1 ML, 1 ML을 저장하고 원추형 튜브로 미디어를 전송합니다. 37 번 저장 매체와 배양 ° C.에 먹이 미디어의 같은 볼륨 + B27를 추가합니다 이 매체는 transfection 후 neuronal 문화에 사용됩니다. </li><li> 20 분 Lipofectamine / DNA 부화 후, glia 문화 삽입은 6 잘 플레이트에서 일시적으로 제거됩니다. 200 μl Lipofectamine / DNA 혼합물은 뉴런 각 coverslip에 추가됩니다. glia 문화 삽입은 다음 뉴런 위의 각도에 반환됩니다. 문화 삽입의 멤브레인에 따라 거품의 생성은 피해야합니다. 뉴런은 2-4 시간에 37 ° C에서 Lipofectamine / DNA 혼합물에 incubated 수 있습니다. </li><li> 일 후전자 2-4 시간의 잠복기는 glia 삽입 다시 제거됩니다. Lipofectamine / DNA을 담은 문화 미디어는 각도에서 제거됩니다. 단계 3.3)에 저장된 미디어는 뉴런 (2 ML 잘 당)에 추가됩니다. Glia 문화 삽입은 각도에 반환되며, 각각의 삽입에서 glia 미디어가 제거되며, 단계 3.3)에서 미디어의 2 ML은 각 삽입에 추가됩니다. </li><li> 뉴런은 TIRF 영상 전에 transfected cDNA의 표현은 이러한 뉴런에 수행 수 있도록 추가 24-72 시간에 배양되어 있습니다. </li></ol> 4. TIRF 영상 <ol><li> 인공 뇌척수 (aCSF : 119 MM NaCl, 2.5 MM KCl, 30 MM 포도당, 2 MM CaCl 2, 1 MM MgCl 2, 25 MM HEPES, = 7.4 산도)는 실시간 영상 실험에 사용됩니다. 우리 TIRF 영상 시스템은 여기에 100 MW 청록색 레이저로 맞춤 설정이며, 전자 배가 요금은 검출기에 대한 장치 (EMCCD) 카메라를 결합. </li><li> 이미징 실험에 앞서, aCSF은 37 &amp; D에 경고합니다예를 들어, 최소 30 분을위한 C 물 목욕. 라이브 영상에 대한 가열 삽입은 현미경 스테이지에 배치되며, 가열 삽입, 레이저, 카메라가 이미징 실험을 시작하기 전에 최소 30 분 동안 따뜻하게합니다. </li><li> transfected 뉴런과 coverslip은 라이브 이미징 챔버로 조립된다. 챔버가 조립 한 후 미리 예열 aCSF은 챔버에 배치됩니다,이 단계는 가능한 한 빨리 완료해야합니다. </li><li> 챔버는 현미경 무대에서 가열 삽입에 배치되면, transfected 뉴런은 시각적으로 에피 형광 이미징 모드에서 확인할 수 있습니다. </li><li> 건강 transfected 뉴런은 (그림 1과 2 참조) 확인 후 플라즈마 막에 pHluorin - 수용체가 매우 높은 형광 수준의 때를 같이, 우리는 일반적으로 플라즈마 막에 기존 pHluorin의 형광을 제거하는 사진 표백제의 1 분을 수행 TIRF 영상이 처음 시작되어있는 개별 기능의 시각화를 방해ertion 이벤트. </li><li> photobleach 후, EMCCD 카메라의 전자 증 배기의 게인 설정이 최대로 설정되어 있으며, 녹화 10 Hz에서 1 분을 위해 수행됩니다. </li><li> 각 기록은 600 이미지가 포함됩니다. 개인 삽입 이벤트는 ImageJ를 사용하여 녹화를 다시 재생하여 확인할 수 있습니다. 개인 삽입 이벤트가 수동으로 ImageJ를 사용하여 분석하고 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 일관성 neuronal 문화는 성공적으로 라이브 영상 실험의 핵심입니다. 그림 1은 마우스 hippocampal 뉴런이 18 사업부하기 위해 DIV 11 일부터 우리의 프로토콜을 사용하여 배양 보여줍니다. 그것은 뉴런이 광범위한 프로세스를 개발하고 있다는 한 이미지에서 수지상 프로세스가 수지상 쪽이 뉴런이 문화에 건강하다고 징후와 밀도가 덮여 분명하다. 우리의 문화 프로토콜은 뇌의 뉴런의 다른 유형을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 최근의 문화에이 프로토콜을 사용교양 마우스 striatal 중간 가시의 뉴런 9 도파민 D2 수용체 (DRD2) 삽입을 시험하는 연구 striatal 중간 가시의 뉴런. 그림 2는 마우스 striatal 매체 가시의 뉴런이 DIV 8시에 우리의 프로토콜을 사용하여 배양 보여줍니다. 또한, 우리는 성공적으로 신경이 유형의 superecliptic pHluorin 태그 DRD2s의 TIRF 영상을 수행했습니다. 그림 3의 표현을 보여줍니다 pHluorin 태그이 신경 세포에서 산도 - DRD2 삽입 중간 가시의 뉴런 및 시각화에 DRD2 (산도 - DRD2). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> 인터페이스의 문화 방법을 사용하여 그림 1. 마우스를 hippocampal 문화. DIV : 체외의 일, 문화의 날은 DIV 0으로 간주됩니다. 이미지에서, 그것은 분명입니다 DIV 11 DIV 15 일까지 문화의 유형의 성숙한 hippocampal 뉴런. DIV 11 13, neuronal 수석은 filipodia와 미숙 한 쪽으로 덮여 있습니다. DIV 15시18, neuronal 수석은 큰 쪽과보다 성숙한 뉴런의 표시를 적용하고 있습니다. 왼쪽 패널 : 낮은 배율 다른 연령대에 마우스를 hippocampal 뉴런의 이미지. 오른쪽 패널 : 높은 배율의 이미지 (왼쪽 패널의 neuronal 수석을 확대) 다른 연령대에서 수지상 쪽과 neuronal 수지상 프로세스. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> 인터페이스의 문화 방법을 사용하여 그림 2. 마우스 striatal 중간 가시 뉴런 문화. 이미지의 뉴런은 DIV 8 이용하실 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> 그림 3. 슈퍼 황도 pHluorin 태그 도파민 D2 수용체 (산도 - DRD2)와 transfected 마우스 striatal 중간 가시의 뉴런. 왼쪽의 이미지는 시간 경과 기록의 최대 강도 투사 (600 이미지, 이미지 당 100 밀리 초)입니다. 화이트 화살촉은 산도-D의 개별 기공을 갖는 삽입을 나타냅니다RD2. 이 이미지는 XY 치수에 삽입 정보를 유지하지만 시간 정보를 잃는다. 오른쪽 이미지는 xyt 스택이 y 축 중심으로 회전 90도이며, 각각의 X 축 라인의 최대 픽셀이 하나의 y 축 픽셀에 투영되는, YT 최대 강도 투영을 보여줍니다. 이 이미지는 YT 축을 따라 삽입 정보를 유지하지만 X 축 정보를 잃는다.

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	<li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+by+DHHC5/8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking.">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li><li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic.">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li><li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

알 수없는 이유로, 마우스 뉴런은 항상 쥐 뉴런보다 문화에 더 어렵습니다. 우리의 경험에서, 뉴런과 glia의 혼합 문화는 기본 교양 마우스 뉴런에 적합합니다. neuronal somata 및 TIRF 현미경의 범위 이외의 수지상 프로세스를 situating, glia 세포의 상단에 성장하는 경향이 문화 뉴런과 프로세스의이 유형에서와 같이 그러나, 이러한 혼합 문화, TIRF 영상 실험에 적합하지 않습니다. 따라서 coverslip에 몇 glia...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong시약의&gt; 이름</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;<td<strong&gt; 코멘트</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 정화 소 콜라겐 솔루션 (Purecol)</td&gt;<td&gt; 고급 Biomatrix</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 패 혈성)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 나트륨 pyruvate</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM 높은 혈당</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 태아 소 혈청 (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GlutaMAX</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; papain</td&gt;<td&gt; 워싱턴 생물 화학 주식회사</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td소 췌장에서&gt; Deoxyribonuclease I (DNase I)</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; DN25-10MG</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dulbecco의 인산은 (DPBS) 식염 버퍼</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0.05 % 트립신</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 폴리-L-라이신의 브롬화 수소산</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 붕산</td&gt;<td&gt; 피셔 - 과학</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal 중</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 세럼 - 무료 보충</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 열 비활성 말 혈청</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofectamine 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11,668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; 피셔 - 과학</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 문화 삽입</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

imaging phluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons

플라즈마 막 (PM)와 세포 내 구획 사이의 수용체 거래에 관한 메커니즘의 이해 뛰어난 공간과 시간적 해상도와 실험 방법이 필요합니다. 또한, 이러한 접근은 또한 세포 내 구획에있는 사람들의 PM에 지역화 수용체를 구별 할 수있는 능력이 있어야합니다. 각 소포는 수용체 만 소수를 운반 때문에 가장 중요한 것은, 하나의 소포에 수용체를 감지하는 것은, 뛰어난 감지 감도를 필요로합니다. 와 세포의 화학적 고정을 필요로 immunolabeled 표면 수용체의 형광 현미경 검사, 따라서 충분한 시간적 해상도 1-6 부족, 수용체 거래를 검사에 대한 표준 접근 방식은 필요한 공간과 시간적 해상도를 모두 부족 생화학 감지, 다음 표면 biotinylation이 포함되어 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리와 다른 사람들은 개발하고 새로운 stra을 고용했습니다7-17 뛰어난 공간과 시간적 해상도 PM에 수용체의 동적 삽입 시각화 수 있습니다 tegy 그. 방법은 수용체의 N-터미널 세포 도메인에 산도에 민감한 GFP, superecliptic pHluorin 18의 태그를 포함하고 있습니다. Superecliptic pHluorin은 산성의 pH를 중성 산도의 비 형광 (산도 &lt;6.0)에서 형광 것의 고유 한 속성이 있습니다. 따라서 태그 수용체가 아닌 형광 때 세포 거래 소포 나 endosomal 구획의 산성 루멘 내에 있으며, 그들은 PM의 외부 표면에 세포 중성 pH의 환경에 노출 한 경우에만 쉽게 시각화된다. 우리의 전략은 결과적으로 우리는 세포 거래 소포 내에 이러한에서 PM 표면 수용체를 구별 할 수 있습니다. 충분한 공간과 시간적 해상도뿐만 아니라 수용체의 동적 인신 매매를 연구하는 데 필요한 감도를 달성하기 위해, 우리는 고용 반영 내부 전체우리는 광학 이미징 (~ 170 nm 정도)의 최적의 공간 해상도를 달성하기 위해 활성화 이온 형광 현미경 (TIRFM)는, 비디오 속도 현미경 (30 프레임 / 초), 그리고 감도의 시간 해상도는 단일 GFP의 형광 검출 방법 분자. 영상으로 TIRFM에 따라 수용체, 우리가 직접 각각의 수용체 삽입 행사 교양 뉴런의 PM에를 시각화 할 수 있었다 pHluorin는 태그. 이 영상 접근법은 잠재적으로 superecliptic pHluorin로 표시 될 수 세포 도메인으로 모든 막 단백질에 적용 할 수 있으며, 다른 막 단백질 (수용체, 이온 채널, 운반 등)의 삽입을 위해 운영 주요 자세한 메커니즘 절개를 수 PM.

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Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

태그를 추가하여 superecliptic pHluorin와 막 수용체의 세포 외 도메인, 및 이미징에 의해 배양 된 마우스 뉴런에서 이러한 퓨전 수용체, 우리는 직접 플라즈마 막에 수용체의 개별 기공을 갖는 삽입 이벤트를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 플라즈마 막에 수용체 삽입에 관한 분자 메커니즘을 elucidating에 도움 될 것입니다.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K 조회수.  The Jackson Laboratory. 태그를 추가하여 superecliptic pHluorin와 막 수용체의 세포 외 도메인, 및 이미징에 의해 배양 된 마우스 뉴런에서 이러한 퓨전 수용체, 우리는 직접 플라즈마 막에 수용체의 개별 기공을 갖는 삽입 이벤트를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 플라즈마 막에 수용체 삽입에 관한 분자 메커니즘을 elucidating에 도움 될 것입니다.

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Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

연구

신경과학

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

교양 공감 뉴런의 돌기 성장을 유도

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

마우스 기본 Hypothalamic 뉴런 Deconvolution 현미경을 사용 하 여 매매 GLUT4 단백질의 라이브 이미지

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...