이 기술은 원래 스파르타 외., 2012 년까지 설명한 쉽게 우리가 실험실에서 사용하기 위해 적응 된 것을 인정하고 싶다.

각 제조업체 및 / 또는 공급 업체와 함께 * 모든 자료는 프로토콜 아래에 나열되어 있습니다. 1. 임플란트의 조립 <ol><li> 수지의 1g에 경화제의 100 밀리그램을 추가하여 열 경화 ​​광섬유 에폭시의 혼합물을 준비한다. </li><li> 측정 및 쐐기 팁 초경 서기로 골의 100 μm 코어와 광 125 μm 섬유의 약 35mm를 잘라. 단일 방향 운동에서 광 섬유 및 점수에 서기 수직를 배치합니다. 섬유를 절단하는 것은 완전히 섬유 코어가 손상됩니다. </li><li> 부회장에 구멍 127 μm로 물미 LC 세라믹을 삽입, 볼록면은 아래 지적했다. </li><li> 페럴에 광 섬유를 삽입합니다. 광 섬유 부드럽게 밀어과 영특 페럴 (그림 1a)의 볼록 넘어 돌출한다. </li><li> 에폭시는 검은 색 변까지 열 총을 평면 엔드와 열에 열 경화 ​​광섬유 에폭시 한 방울을 적용합니다. 에폭시는해야이 가열 및 이전 치료 될 때 페럴을 입력합니다. 에폭시는 일정한 열 응용 프로그램의 ~ 1 분 이내에 치료해야합니다. </li><li> 이 커플러와 인터페이스를 방해하므로, 페럴의 측면을 따라 모든 에폭시를 제거합니다. </li><li> 연마 패드의 알루미늄 산화물 연마 시트 (그림 1b)에 LC 광섬유 연마 디스크 (FOPD)를 사용 페럴의 볼록 끝을 폴란드어. 원형 회전 패턴을 확인하고 다음과 같은 순서로 네 개의 등급에 폴란드어 : 5, 3, 1 0.3 μm의 모래. </li><li> 가 관심 지역을 대상으로하는 등의 적절한 길이로 평면 끝 부분에 광 섬유를 잘라. 길이는 stereotaxic지도 책을 사용하여 결정될 수있다. </li><li> 아래에 설명 된 커플러 코드를 통해 레이저에 연결하여 임플란트를 테스트합니다. 임플란트의 광택 끝은 커플러의 슬리브에 삽입되고 반대 페럴과 연락해야합니다. 임플란트는 일의 끝에서 측정, 광 출력의 10 MW를 유지 할 수 있어야한다전자 주입 섬유. 나쁜 임플란트는 광 섬유의 끝 근처에 약한 초점을 갖게됩니다. </li><li> 사용까지 폼의 완성 이식을 (그림 1C) 저장합니다. </li></ol> 2. 광섬유 커플러 코드의 조립 <ol><li> 위와 같이 열 경화 ​​광섬유 에폭시의 혼합물을 준비한다. </li><li> 측정 및 쐐기 팁 초경 서기로 점수를하여 200 μm 코어와 광 220 μm 섬유의 적절한 길이를 잘라. 섬유의 길이는 마우스가 주택 주변에 자유롭게 이동할 수 있지만, 마우스가 섬유를 통해 씹을 할 수 없습니다. </li><li> 광섬유 길이보다 약간 긴 분기 관의 길이에 광 섬유를 삽입합니다. 튜브는 광 섬유보다 약간 큰 내부 직경이 있어야합니다. </li><li> 스트립 ~ 25mm 광학 섬유의 한쪽 끝에서와 멀티 FC의 MM의 금속 끝에 삽입은 멈출 때까지 230 μm는 지루한 회의를 페럴. 광 섬유 ferru을 통해 내밀다한다르 엔드 (그림 2A). </li><li> 금속 끝에서 (슈퍼 접착제) 시아 노 아세틸렌과의 연결을 고정합니다. 커넥터 부팅과의 연결을 커버하고 FC FOPD와 페럴 끝을 폴란드어. 5, 3, 1, 0.3 μm 그릿 (그림 2B) : 원형 회전 패턴 및 다음과 같은 순서로 네 개의 등급에 폴란드어를 확인합니다. </li><li> 말초 볼록 끝과 LC 세라믹 페럴 (230 μm ID 구멍)에 광 섬유의 다른 쪽 끝을 샅샅이 삽입합니다. 치유 될 때까지 평면 엔드와 열에 에폭시 한 방울을 적용합니다. </li><li> 위에서 설명한대로 알루미늄 산화물 연마 시트에 FC FOPD를 사용 페럴의 볼록 끝을 폴란드어. </li><li> 슬리브의 중간 지점까지 페럴의 볼록 끝으로 LC 페럴 슬리브를 슬라이드. </li><li> 장소 열 수축 분기 관과 연결합니다 (그림 2C)를 확보하고 보호하는 슬리브와 열을 통해 튜브를. </li><li> 레이저 소스에 연결하고 빛 outp를 측정하여 커플러을 테스트분광 광도계와 커플러를 통해 UT. 레이저 출력과 측정 된 커플러 출력 사이의 빛 손실이 30 %를 초과 할 수 없습니다. </li></ol> 3. 외과 이식 *이 팁 전용 절차입니다. 장비는 살균이지만 장갑 악기 및 장비 사이의 지속적인 조작으로 인해 할 필요가 없습니다. <ol><li> intraperitoneal 주사 케타민 / Xylazine 혼합 100 30 게이지 바늘을 사용하여 각각 10 밀리그램 / kg으로 마우스를 마취. </li><li> 가위로 두피를 면도. Betasept 번 반복, 두 분을 위해 (4 % Chlorhexidine 솔루션) 닦아 다음 70% 이소 프로필 알코올과 두피를 닦아주십시오. </li><li> sterotaxic 장비에 마우스를 놓고 두개골 레벨이되도록 머리를 보호합니다. 건조 및 수술 통증을 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용합니다. 산소가 MOU의 생리적 상태에 따라 희석 volatized isoflurane (1-3 %를 사용 마취를 유지계속 꼬리 핀치에 대응하여 모니터링해야 SE). </li><li> 람다에 눈 궤도에서 두개골을 노출, 두피의 중간 선을 통해 절개를합니다. 필요에 따라 결합 조직을 버리고 밀어 넣습니다. </li><li> 피부를 막아 Serafin 클램프를 사용하여 두개골 (그림 3A)에 대한 액세스를 유지합니다. </li><li> 치과 피크와 두개골의 표면에 걸쳐 엣지 바둑판 무늬로하는 패턴. 멸균 식염수에 떨어진 파편을 씻으십시오. 철저하게 말린다. </li><li> micropores를 만들려면 ~ 2-3 초에 면봉으로 노출 된 두개골에 과산화수소 (3 %)을 적용합니다. 여러 번 씻고 완전히 건조 시키십시오. 스파르타 외에 설명 된대로 또는 앵커는 두개골에 실수 할 수 있습니다. (2012). </li><li> 다시 말하지만, 에칭 바둑판 무늬로하는 치과 곡괭이로 두개골에 걸쳐 패턴과는 식염수에 파편을 씻어. 철저하게 말린다. </li><li> 회전 도구를 사용 멸균 드릴 비트와 함께 작은 버 구멍 craniotomy을 (직경 &lt;1 ㎜) 확인(autoclaved) 위의 bregma와 람다로 조정 stereotaxic지도 책에 의해 결정 관심 지역. 경질을 어기거나 조직을 손상하지 않도록주의하십시오. 쓰레기를 씻어 철저히 건조 시키십시오. </li><li> 프로브 홀더에 광섬유 페럴 (임플란트)을 삽입하고 stereotaxic 팔에 연결합니다. </li><li> 직접 stereotaxic 팔 (그림 3B)를 사용하여 관심 지역 위 자리에 임플란트를 배치합니다. 뇌 조직에 광섬유를 삽입하면 섬유 ~ 2 ㎜ / 분의 속도로 천천히 전진해야합니다. 페럴은 남아있는 두개골에 휴식을해야합니다. </li><li> 치과 시멘트의 혼합물을 준비한다. 혼합물은 쉽게 두개골에 걸쳐 적용 할 수있는 낮은만큼 점도가 있어야합니다. 혼합 2-4 분에 대해서는 사용이 될 것입니다. </li><li> 멸균 이쑤시개 사용하여 두개골에서와 임플란트의 하부로 치과 시멘트의 얇은, 심지어 레이어를 적용합니다. 로 치과 시멘트의 기본 층은 두개골에 많은 면적을 커버해야합니다수. 마우스의 피부와 접촉 치과 시멘트를 짓게하지 마세요. 이 증가 suturing에 어려움뿐만 아니라 마우스에 자극을 야기합니다. 치과 시멘트가 피부에 접촉 않는 경우, 부분적으로 시멘트의 전체 레이어가 설정되기 전에 벗겨 될 수 있도록 건조 할 수 있습니다. </li><li> 완전히 건조하도록 허용합니다. </li><li> 각 층 (그림 3C) 완전히 건조 할 수 있도록 두개골을 극복하고 임플란트 주위로 작은 마운드를 형성하기 위해 치과 시멘트도 층을 적용합니다. 부드러운, 탁 트인 연결을 할 수 있도록 시멘트의 깨끗한 페럴의 볼록 월말 ~ 3~5밀리미터 둡니다. </li><li> 치과 시멘트의 마운드 위에와 C22 바늘로 멸균, 단일 사용 실크 편조 봉합 (6-0)를 사용하여 임플란트 주변의 두피를 봉합 해. 7 일 후 제거합니다. 선택 사항 : suturing 이후 추가 바인딩을 사용 뇌려 본드. 최소한의 뇌려 본드를 사용하십시오. 초과는 긁힘으로 인해 심각한 피부 손상을 초래할 수 있습니다. </li><li> Immediatel수술 후 Y는 마우스 피하에 수술 통증을 줄일 Ketprophen (5 밀리그램 / kg)을 주입해야합니다. 이 24 시간 이상 반복해야합니다. 임플란트의 기초 봉합 피부와 주변 국소 진통제 (Bupivicaine)와 항생제를 (Neosporin) 적용됩니다. </li><li> 마취에서 회복을위한 난방 담요 새장에 마우스를 놓습니다. 멸균, 수술 후 회복 케이지에 마우스를 놓습니다. 복구 케이지 온도를 유지하고 질식을 방지하기 위해 모든 침구를 포함 할 수 없습니다. 마우스는 원래 케이지 또는 한 번 깨어 새로운 케이지에 반환 할 수 있습니다. </li></ol> 광원과 관심 지역의 광 섬유 끝 사이에 최소한의 광자 손실 광섬유 임플란트 및 커플러 결과의 적절한 조립. 잘 연마 광섬유는 단일, 동심 원에게 (그림 2D)에 빛을 전송해야합니다. 주의 주입 및 suturing으로 임플란트가에 눈에 띄는 자극을 발생하지 않습니다마우스와 광 섬유 또는 전송 빛의 양의 큰 저하없이 장기 연구 (그림 3D,&gt; 1 달되지 않은 관찰)에 장소에 남아있을 수 있습니다. 부적절한 주입 또는 suturing는 자극을 일으킬 수 있으며, 영구적 인해 조작에 치과 시멘트, 또는 치과 시멘트에서 페럴의 파손 노출의 두피를 긁는 마우스 될 수 있습니다. 조립 시스템의 개략도는 그림 4에서 볼 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> 그림 1. implantable 광섬유 조립. (A) 광섬유는 영특 화살촉으로 표시 볼록 넘어 돌출, 페럴에 삽입됩니다. (b)는 페럴의 볼록 끝을 연마 시트 점차적으로 미세한 성적에 FOPD를 사용하여 연마하고 있습니다. (C) 마감 implantable 섬유 선택집적 회로. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> 그림 2. 보형물로 테 더링 광섬유 로터리 조인트를하는 데 광섬유 커플러 조립. 페럴 어셈블리를 통해 (가) 광섬유 꽂 혔지. (b)는 어셈블리의 페럴 측면은 광택 용지를 사용하여 FOPD과 광택이 점진적으로 세밀한 등급으로 삽입됩니다. (C) 페럴 슬리브는 페럴 위에 장착 및 열 수축 튜브로 고정된다. (D) 완료 광섬유 커플러는 최소 광자 손실이있는 동심 빛을 생산해야합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> 그림 3. 외과 주입 섬유 광학. craniu의 (A)는 표면 전체m이 노출되어 있으며 결합 조직이 지워집니다. (B) 광섬유 보형물은 stereotaxic 팔 위치에 개최됩니다. (C) 치과 시멘트는 두개골에 광섬유 임플란트를 수정 적용됩니다. (D) 주입 후&gt; 1 월 피부는 임플란트 주변에 치유하고 염증의 흔적이 없습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> 그림 4. 기능 시스템의 개략도

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	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2.">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy.">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li><li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li><li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking.">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall.">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li></ol>

Optogenetics 특정 neuronal 하위 유형 통해 전례없는 제어를 할 수있는 강력하고 새로운 기술입니다. 전극을 통해 셀 타입 무차별 및 전기 자극의 침해 효과를 피하는 동안이는 해부학과 측두엽 정밀도와 신경 회로를 조절하기 위해 악용 할 수 있습니다. 섬유 광학의 주입은 조직에 최소한의 손상과 쥐 행동, 깨어에서 여러 세션을 통해 신경 회로의 일관성, 만성 자극 할 수 있습니다. 이 시스템은 원래 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약이나 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> LC 페럴 슬리브 </td><td> 정밀 섬유 제품 (PFP​​) </td><td> SM-CS125S </td><td> 1.25 mm의 ID </td></tr><tr><td> FC MM 사전 조립 된 커넥터 </td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230 μm은 페럴 </td></tr><tr><td> 밀러 FOPD-LC 디스크 </td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> LC ferrules에 대한 </td></tr><tr><td> 분기 관 </td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900 μm OD, 250 μm의 ID </td></tr><tr><td> MM LC 스틱 1.25 mm를 페럴 </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-1270 </td><td> 127 μm의 ID 보어 </td></tr><tr><td> MM LC 스틱 1.25 mm를 페럴 </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230 μmID 보어 </td></tr><tr><td> 열 경화 ​​에폭시, 경화제와 수지 </td><td> PFP </td><td> 동부 표준시 - 353ND-16OZ </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC와 SC / PC 커넥터 연마 디스크 </td><td> ThorLabs </td><td> D50-FC </td><td> FC ferrules에 대한 </td></tr><tr><td> 디지털 광학 전력 및 에너지 미터 </td><td> ThorLabs </td><td> PM100D </td><td> 분광 광도계 </td></tr><tr><td> 폴리싱 패드 </td><td> ThorLabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;X 13&quot;50 Durometer </td></tr><tr><td> 0.3, 1, 3, 5 μm 모래 : (폴리싱) 시트를 래핑 알루미늄 산화물 </td><td> ThorLabs </td><td> LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P </td><td></td></tr><tr><td> 표준 하드 Cladding 멀티 섬유 </td><td> ThorLabs </td><td> BFL37-200 </td><td> 낮은 OH, 200 μm 코어, 0.37 NA </td></tr><tr><td> 섬유 스트리핑 도구 </td><td> ThorLabs </td><td> T10S13 </td><td> 클래드 / 공동의 : 200 μm / 300 μm </td></tr><tr><td> 실리카 / 실리카 광섬유 </td><td> Polymicro 기술 </td><td> FVP100110125 </td><td> 높은-OH, UV 향상된, 0.22 NA </td></tr><tr><td> 1x1 Fiberoptic 로타리 조인트 </td><td> 도리스 식 렌즈 </td><td> FRJ_FC - FC </td><td></td></tr><tr><td> 모노 Fiberoptic Patchcord </td><td> 도리스 식 렌즈 </td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> 튜브, 1 / 8 인치를 축소 가열 </td><td> 연합 전자 </td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td> 열 총 </td><td> 연합 전자 </td><td> 972-6966 </td><td> 250 W, 750-800 ° F </td></tr><tr><td> 면화는 applicators 팁을 </td><td> 청교도 의료 제품 회사 </td><td> 806-WC </td><td></td></tr><tr><td> VetBond 조직 접착제 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td> 플래시 의치베이스 아크릴 </td><td> 예이츠 Motloid </td><td> ColdPourPowder + Liq </td><td></td></tr><tr><td> 본 미니 창포 가위 </td><td> Integra Miltex </td><td> 18-1392 </td><td> 3-1/2 &quot;(8.9cm), 직선, 15mm 블레이드 </td></tr><tr><td> 존스 홉킨스 불독 클램프 </td><td> Integra Miltex </td><td> 7-290 </td><td> 곡선 1-1/2 &quot;(3.8 cm), </td></tr><tr><td> 메가 토크 전기 모터 연구실 </td><td> 벡터 </td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td> 팬더 Burs - 볼 # 1 </td><td> 클락슨 연구소 </td><td> 77.1006 </td><td></td></tr><tr><td> 바이올렛 블루 레이저 시스템 </td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-O </td><td> 파장 : 473 nm의 </td></tr><tr><td> 레이저 전원 공급 장치 </td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 # 2 Laminectomy의 포셉 </td><td> 에프오프라인 과학 도구 </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> 탐침 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 10140-02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 &quot;스트레이트 Hemostat </td><td> Excelta </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td> 가중치 기반으로 바이스 </td><td> Altex 전자 </td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue

neuronal 연결의 Elucidating 패턴은 임상과 기초 모두 신경 과학에 대한 도전이었다. 전기 생리학은 시냅스 연결의 패턴을 분석 황금 표준 왔지만 짝 electrophysiological 레코딩 성가신와 실험적으로 제한을 모두 할 수 있습니다. optogenetics의 발달은 체외 1과 생체 2,3에서 모두 뉴런과 회로를 자극 할 수있는 우아한 방법을 도입하였습니다. 이산 neuronal 인구에 옵신 표현을 유도 세포 유형의 특정 발기인의 활동을 이용하여, 하나는 정확하게 구별 회로 4-6에서 유전자 정의 neuronal 하위 유형을 자극 할 수 있습니다. 전기 자극 및 / 또는 약리 조작 등의 뉴런을, 자극에 잘 설명 방법은 종종 침입 세포 유형의 무차별이고, 주변 조직에 손상을 줄 수 있습니다. 이러한 제한은 전형적인 시냅스 기능 및 / 또는 회로의 동작을 변경 수 있습니다. 또한, 인해조작의 성격에, 현재의 방법은 종종 급성 및 단말 있습니다. Optogenetics는 비교적 무해한 방식으로 뉴런을 자극하고, 유전자 타겟으로 뉴런에 할 수있는 능력을 갖게. 생체 optogenetics에 관한 연구의 대부분은 현재 주입 캐뉼라 6,7를 거치게 광학 섬유를 사용하지만,이 방법의 한계는 광섬유의 반복 삽입과 손상된 뇌 조직과 캐뉼라 내부의 섬유의 잠재적 인 파손이 포함되어 있습니다. optogenetics의 급성장 분야 감안할 때, 만성 자극의 더 신뢰할 수있는 방법은 최소한의 부수적 인 조직 손상과 장기 연구를 촉진 할 필요가 있습니다. 여기 효과적이고 우아 스파르타 외에 설명 된 방법을 보완하기 위해 비디오 기사 등의 수정 프로토콜을 제공합니다. 8 anesthetized 마우스의 두개골로 광섬유 이식 및 영구 고정의 제조뿐만 아니라의 조립에 섬유광 커플러는 광원에 임플란트를 연결. 고체 레이저를 광섬유로 연결 임플란트는 만성 적은 조직 손상 9 작은 분리, tethers을 사용하여 기능 neuronal 회로를 photostimulate 할 수있는 효율적인 방법을 할 수 있습니다. 광섬유 임플란트를 영구적으로 고정을 제공 일관 최소한의 조직 손상을 갖춘 10 개 깨어 행동 쥐 neuronal 회로의 생체 optogenetic 연구의 장기.

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Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

optogenetics의 개발은 이제 정확하게 유전자 정의 뉴런과 회로를 자극 할 수있는 방법을 모두 제공합니다<em&gt; 체외에서</em&gt;와<em&gt; 생체 내</em&gt;. 여기 뇌 조직의 만성 photostimulation에 광 섬유의 조립 및 주입을 설​​명합니다.

뇌 조직의 만성 Optogenetic의 자극을위한 광섬유 주입

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

44.6K 조회수.  Baylor College of Medicine (BCM). optogenetics의 개발은 이제 정확하게 유전자 정의 뉴런과 회로를 자극 할 수있는 방법을 모두 제공합니다 체외에서와 생체 내. 여기 뇌 조직의 만성 photostimulation에 광 섬유의 조립 및 주입을 설​​명합니다.

비디오: Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

연구

신경과학

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

청각 신경의 자극 Optogenetic

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, dystonia or tremor. DBS is based on the delivery of electrical stimuli to specific deep anatomic structures of the central nervous system. However, the mechanisms underlying the effect of DBS remain enigmatic. This has led to an interest in investigating the impact of DBS in animal models, especially in rats. As DBS is a long-term therapy, research should be focused on molecular-genetic changes of neural circuits that occur several weeks after DBS. Long-term DBS in rats is challenging because the rats move around in their cage, which causes problems in keeping in place the wire leading from the head of the animal to the stimulator. Furthermore, target structures for stimulation in the rat brain are small and therefore electrodes cannot easily be placed at the required position. Thus, a set-up for long-lasting stimulation of rats using platinum/iridium electrodes with an impedance of about 1 M&#937; was developed for this study. An electrode with these specifications allows for not only adequate stimulation but also recording of deep brain structures to identify the target area for DBS. In our set-up, an electrode with a plug for the wire was embedded in dental cement with four anchoring screws secured onto the skull. The wire from the plug to the stimulator was protected by a stainless-steel spring. A swivel was connected to the circuit to prevent the wire from becoming tangled. Overall, this stimulation set-up offers a high degree of free mobility for the rat and enables the head plug, as well as the wire connection between the plug and the stimulator, to retain long-lasting strength.

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

미세 전극은 장기 깊은 뇌 자극 쥐의 Subthalamic 핵에 전극의 주입을 가이드

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

일반적인 마모 셋에 전체 피 질 Electrocorticographic 배열의 만성 이식

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...