이 작품은의 &quot;ERA - NET 뉴런 &#39;의 프레임에있는 생명 보험 회사&quot;Novalis - Taitbout &quot;가르슈 DES Neurosciences 드 파리 (ENP), 회사 직원 Nationale 드 라 공들인&quot;ANR - 09 - NEUR - 004 &quot;에 의해 지원되었다 유럽​​위원회에 의해 FP7 프로그램, &quot;재단 부어 라 공들인 Medicale&quot;Letten 재단과 파스퇴르 재단.

1. Stereotaxic 주사 <ol><li> 이러한 실험에 사용되는 바이러스는 Channelrhodopsine2 - YFP (노란색 형광 단백질)을 표현할 수있는 HIV 바이러스에 따라 복제 - 결함 lentiviral 벡터는 퓨전 synapsin업자 6 기반 구축. 플라스미드는 넉넉한 K. Deisseroth의 연구 그룹 (에서 제공한 <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html</a> ). Lentiviruses 설립 프로토콜 7에 따라 실험실에서 상용 소스에서 얻은 또는 생산 수 있습니다. 평균 벡터 titers은 10 10 도입 단위 / ML의 순서에 있었다. 바이러스성 aliquots는 -80 ° C에서 저장하고 피펫로드하기 전에 해동해야합니다. 복수 동결 / 해동 사이클은 피해야한다. 직접 드라이 아이스에 결코 노출 바이러스 솔루션입니다. </li><li> 표준 피펫 풀러 (셔터 P에 borosilicate 유리 모세관을 사용하여 유리 pipettes 준비-97 피펫 풀러). 당기 설정이 제대로 길고 까다로운 피펫을 양보하도록 조정해야합니다. 다음, 직경 30-40 μm의의 팁을 얻기 위해 가위를 사용하여 피펫의 끝을 잘라. 저장소가 먼지 무료 상자에 pipettes를 추출. </li><li> 50 NL의 제공을위한 제조 업체의 지침 Nanoject II microinjector를 설치합니다. 미네랄 오일과 함께 백업 작성하여 사출 피펫을 준비하고 microinjector 플런저에 그것을 넣습니다. stereotaxic 프레임에 microinjector을 첨부합니다. 바이러스 솔루션을 작성하기 전에 유리 피펫에서 부분적으로 비어있는 기름 </li><li> micropipette으로 Parafilm의 살균 조각에 바이러스 솔루션 2 μl를 전송합니다. 부드럽게 바이러스 솔루션의 드롭에 유리 피펫을 절감하고 1-2 μl로 피펫을 채울. 피펫에 기포가 없는지 확인합니다. </li><li> 100 MG / kg 케타민을 및 무균 식염수에 희석 10 밀리그램 / kg Xylazine와 마우스를 마취. 의 두피에서 머리카락을 제거쥐 면도기, 면도날, 가위, 또는 화학 depilitory 에이전트를 사용하여 동물. 70 % 에탄올과 betadine을 교대 세 응용 프로그램과 두피를 소독. 모든 수술 악기도 autoclaved하고 다음 70 % 에탄올로 소독한다. 머리가 안전하다는 확보, 귀 바 코 표시줄 stereotaxic 프레임에있는 동물을 놓습니다. 각막의 건조 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 메스와 눈 사이에서 귀 사이에 두피를 잘라. 두개골을 노출하고 클램프 한 쌍의로 피부를 앵커에 따로 피부를 당겨. 두개골의 표면을 청소합니다. stereotaxic 장치는 bregma에 유리 피펫의 끝에와 제로입니다. 다음 팁은 사출 사이트 (; 메디오 - 측면 모두 오른쪽과 왼쪽 반구에 대한 ± 0.82, 각각 Antero - 후부, 3.30)에 배치됩니다. 코 표시줄의 위치는 stereotaxic 좌표의 계산에 따라 조정되어야합니다. 우리의 실험에서, 코 표시줄이 U를 조정됩니다한패 bregma 및 사출 사이트는 동일한 높이로 정렬됩니다. </li><li> 사출 사이트를 식별합니다. 고속 수술 드릴을 사용하여 조심스럽게 두개골에 구멍을 드릴. 끝에서 만났 구부러진 주사기 바늘로, 경질의 mater을 폭로 얇은 뼈의 잔존물을 제거합니다. 구멍이 올바른 위치에 중심 있는지 확인합니다. 시추하는 동안 두뇌의 표면에 파열에 혈관 않도록 조심해. 혈관이 파열하는 경우에는 혈액의 흐름이 멈출 때까지, 부드럽게 몇 초 동안 작은 목화 꽃봉오리 또는 조직과 두뇌의 표면에 누르십시오. </li><li> 피펫을 절감하고 피펫의 끝이 두뇌의 표면을 접촉 때 Dorso - 복부 높이를 제로. 그런 다음 올바른 Dorso - 복부 깊이 (뇌 표면에서 2.9, Dorso - 복부)에 낮은 및 압력 평형 30 초 정도 기다리십시오. 200 NL 총 바이러스 4 회 50 NL 주사. 각 분사 사이에 30 초 정도 기다립니다. </li><li> 마지막 주사 후, 천천히 파이프를 철회 한 분TTE. 반복 다른 반구에 대한 1.6-1.8을 가리 킵니다. , stereotaxic 장치에서 동물을 제거 절개와 봉합 수술 스레드를 사용하여 자른 피부를 청소하십시오. 동물이 케이지로 돌아오기 전에 온난 패드에 복구할 수 있습니다. 또한, 동물은 즉시 비 steroidal 항염증성 진통제 (예 : Carprofen 4mg/kg)을 부여하고 3 일 수술을 다음 수 있습니다. </li></ol> 2. 후각 망울의 생체내의 optogenetic의 자극에 대한 만성 LED 주입 <ol><li> lentiviral 입자로 주입 동물은 양자 다음 만성 소형 블루 LED (Osram, LED CMS 4.6W 청색)을 심어됩니다. 커넥터는 LED의 반대쪽에 위치되도록 여성 소형 전기 커넥터 솔더는 LED 핀. 어떤 전기 지름길이 없다는 것을 확인하고 커넥터에 대한 긍정과 부정 핀 식별합니다. 적절한 케이블하지만 LED를위한 전류 컨트롤러에 연결하여 LED를 테스트합니다. </li><li> 측정 및 / 또는 LED의 절대 조명 전원을 설정하려면, 마운트 micromanipulator과 위치에 LED가 470 NM에서 최고 빛의 강도의 전원 측정기의 광검출기과 직접 접촉 하였다. 불투명한 PVC 보드에 3mm 직경의 핀홀을 드릴. 부착이 전원 미터에 핀홀 및 광학 전력 대 mm 2 당 전력을 계산하기 위해 전류 입력의 표준 곡선을 빌드합니다. </li><li> 두뇌를 통해 빛의 전파를 측정하기 위해 300 신선한 뇌 조직의 블록, 500, 1000, 1500 및 0-4에서 2,500 μm의 두께 ° C ACSF가 vibratome 14를 사용하여 잘라. LED 아래에 사는 생쥐에서 수행한 것과 동일한 craniotomy과 두개골 조각을 넣으십시오. 첫째, LED 중심 조직없이 빛을 전력을 측정합니다. 그렇다면 LED와 전원 측정기의 광검출기 사이의 조직의 각 블록을 배치하고, 전원을 측정합니다. 비율로 계산 조직의 두께 비교 상대 전송 분율의 곡선을 작성조직을 통하여 조직 않고 측정 전원 사이. </li><li> 100 MG / kg 케타민을 및 무균 식염수에 희석 10 밀리그램 / kg Xylazine와 마우스를 마취. 깨끗하고 70 % 에탄올로 LED를 소독. 동물의 두피에서 머리카락을 제거하고 70 % 에탄올과 betadine을 교대 세 응용 프로그램과 두피를 소독. 다음 stereotaxic 프레임에 동물을 배치. 각막의 건조 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. stereotaxic 홀더에 커넥터를 연결합니다. 후각 망울 위에있는 두개골의 표면이 완벽하게 수평과 미니어처의 표면에 평행하게 LED 때까지 코 막대의 위치가 조정되어야합니다. </li><li> 메스를 사용하면 귀가 사후 3mm로 눈 앞쪽에 3mm에서 두피를 잘라. 이외에도 피부를 당겨와 클램프의 한 쌍의로 앵커. 면도날을 사용하여 두개골의 표면에있는 세포막을 떨어져 다쳤어요. 청소와 두개골을 건조. 후속 광고를 허용하는 cyanoacrylate 접착제의 얇은 커버를 적용치과 아크릴의 hesion. </li><li> 후각 전구를 통해, 고속 수술 드릴을 사용하여 사각형 craniotomy (5.1 mm 꼬리를 중심으로, bregma에서 측면 0mm 꼬리 1mm과 측면 3mm)을 수행합니다. 신중하게 얇은 두개골,이 작업을 수행하려면 뼈를만을 얇은 레이어는 유지까지. 조심스럽게 구부러진 주사 바늘의 도움으로 남은 뼈를 제거합니다. 특별한주의가 경질 물질을 펑쳐링 두 반구 사이 후각 구근의 꼬리 국경에서 거짓말의 주요 혈관을 rupturing 않도록 주의해야한다. 뇌 표면에 혈액 축적과 응고 조직에 최적의 조명 침투하는 걸로. craniotomy 및 멸균 식염수에 두뇌의 표면을 씻어 다음 두개골을 건조. </li><li> 커넥터 LED 모형을 연결합니다. 후각 전구의 상단에있는 LED 모형을 낮춥니다. 미니어처 LED의 주요 축은, 살균 염분 및 D와 클린 마우스의 주동이의 - 꼬리 축에 평행해야스피 두개골. 그런 다음 보안 치과 아크릴의 두 번째 레이어에 이어 아크릴의 첫 번째 계층 (즉, polycarboxylate 시멘트)와 두개골되었다. 이 작은 나사의 추가는 LED를 수정해야 할 수 있습니다. 나사는 두개골에 삽입 (LED 위치 후부)와 두 acrylics으로 덮여 있어야합니다. 아크릴 여전히 액체이지만, 치과 아크릴의 표면에있는 두피의 자유 모서리를 뒤로 당겨 및 접착제. 커넥터에 대한 아크릴을 적용 안됩니다. 아크릴이 강화된 후 stereotaxic 장치에서 동물을 제거하고 케이지로 돌아오기 전에 그것이 온난 패드를 복구하자. 동물은 적어도 7 일 동안 수술에서 회복하기 위해 자신의 새장에 격리 남아 있습니다. 또한, 동물은 즉시 비 steroidal 항염증성 진통제 (예 : Carprofen 4mg/kg)을 부여하고 3 일 수술을 다음 수 있습니다. LED가 실험 주입 전 및 종료 후 테스트해야합니다. </li><li> 가벼운 electri칼 케이블은 LED의 타이밍과 강도를 제어하는​​ 펄스 발생기 (석사 - 8)에 결합하여 LED를위한 전류 컨트롤러에 밧줄 동물을하는 데 사용됩니다. 얇은 케이블은 운동의 완전한 자유를 허용합니다. 커넥터의 극성을 존중 조심해. 반전 극성은 LED을 깰 수 있습니다. </li></ol> 3. 대표 결과 : ChR2 - YFP은 약 48 시간이 주사 후 신경을 transduced로 표현하고, 몇 개월 7 안정 유지됩니다. 그림 1은 15 일 이후 사출 paraformaldehyde - 고정 동물의 화살 섹션의 대표 사진입니다. 밀도 라벨 및 RMS에 주입 사이트의 크기를합니다. 신생아의 세포 다수의 후각 망울 (그림 1)의 서로 다른 레이어를 식민지로 RMS 따라 마이 그 레이션했습니다. 융합 단백질은 소마, dendrites, 그리고 쪽이 포함한 모든 신경 세포의 구획에 표시됩니다. 미니어처 LED impla<html> ntation 큰 규모와 관심의 광범위한 지역의 저렴한 광학 자극 수 있습니다. 동물은 운동의 완전한 자유를 허용하는 가벼운 전기 케이블로 LED 컨트롤러에 곁에 있습니다. 두뇌 조직 및 ChR2 활성화의 문턱에서 빛을 확산을 특성화하여, 우리는 그 광학 활성이 LED의 표면 아래에 ~ 2mm (그림 2A)의 깊이에서 발생 될 수 예상하고있다. 의 기능 활성화를 모니터링하려면 ChR2은 - 표현 생체내에 신경을 C - fos,의 연결 활동의 마커의 표현은 반복적인 가벼운 자극 (그림 2B) 이후 분석하실 수 있습니다. 대안으로, 초점 가벼운 자극에 결합 ChR2 - 표현 뉴런의 체외 electrophysiological 녹음에 14을 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 두 광자 대상 느슨한 - 패치 녹음은 생체내 9 LED 유사한 모형에 의한 ChR2 - 표현 대뇌 피질의 뉴런의 기능 활성화를 연구하는 데 사용되었습니다. ntent &quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig1.jpg" /> 그림 1. 십오일 주동이의 RMS에 lentivirus의 주사 후 마우스의 후각 망울의 saggital 섹션 ChR2 - YFP 주동이의 철새 스트림에 lentiviral 주사의 표현. 대표 공촛점 이미지. RMS의 마지막에서 OB의 다른 레이어로 마이 그 레이션 흩어져 YFP 신생아 뉴런의 존재를합니다. 신생아 세포 (95 %)의 대부분은 과립 세포 레이어 (GCL)와 dendrites에서 소마의 거짓말은 외부 Plexiform 층 (EPL)에서 arborize 과립 세포입니다. 신생아 뉴런의 작은 인구 사구체 층에있는 OB의 가장 표면 계층 (GL)까지 마이 그 레이션. 스케일 바, 100μm. dendrites에서뿐만 아니라 쪽이에서 ChR2 - YFP의 멤브레인 표현을 보여주는 신생아 과립 세포의 삽입, 높은 배율. 스케일 바, 20μm. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig2.jpg" /&gt; 그림 2. 다이어그램의 새로운 과립 세포를 표현 ChR2 - YFP의 후각 망울 가벼운 - evoked C - fos 표현의 상단에 LED 심어. 이식 후각 전구 위의 LED의, 도식 그림. B, 보여주는 대표 공촛점 이미지를 두 번 표시 ChR2 - YFP + C - fos 일시간 후각 망울의 빛 자극 후 + 과립 세포. C - fos 표현은 토끼 반 C - fos 차 항체 (Calbiochem, 1:5000)와 A568 - 복합 백신 토끼 항체를 보조 (Invitrogen, 1:1000)를 사용하여 드러났습니다. 스케일 바, 10μm.

<ol>
	<li>Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Alonso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+astrocytes+from+the+rostral+migratory+stream+into+neurons:+a+role+for+the+olfactory+sensory+organ.">Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.</a> J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).</li><li>Mouret, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+survival+of+newly+generated+neurons:+when+time+matters.">Learning and survival of newly generated neurons: when time matters.</a> J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How,+when,+and+where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).</li><li>Haubensak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+an+amygdala+microcircuit+that+gates+conditioned+fear.">Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear.</a> Nature. 468, 270-276 (2010).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+Production.">Lentivirus Production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature protocols. 5, 247-254 (2010).</li><li>Huber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+optical+microstimulation+in+barrel+cortex+drives+learned+behaviour+in+freely+moving+mice.">Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice.</a> Nature. 451, 61-64 (2010).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2.">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 .</li><li>Albeanu, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy.">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).</li><li>Slotnick, B., Bodyak, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+Discrimination+and+Odor+Quality+Perception+in+Rats+with+Disruption+of+Connections+between+the+Olfactory+Epithelium+and+Olfactory+Bulbs.">Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs.</a> J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Affordable+LED+Arrays+for+Photo-Stimulation+of+Neurons.">Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Optogenetic 도구는 최근 후각 시스템에서 성인 태어난 뉴런의 연결을 포함하는 선택적 인구, 이상 우리의 통제를 증가하고있다. 여기 성인 태어난 뉴런의 특정 인구 ChR2 - YFP을 표현하는 lentiviral 벡터의 stereotaxic 주사를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 조심스럽게 기간 후 주사를 모니터링함으로써, 우리는 상대적으로 균일한 나이가 성인에서 태어난 뉴런의 일대의 활동을 분석하고 조작하실 수 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 자료 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 케타민을 </td><td> Merial </td><td> Imalgène 1000 </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 바이엘 건강 </td><td> Rompum 0.2 % </td></tr><tr><td> 피펫 풀러 </td><td> 셔터 </td><td> P - 97 </td></tr><tr><td> 유리 모세 혈관 (3.5 &quot;) </td><td> Drummond 과학 </td><td> 3 - 000-203 - G / X </td></tr><tr><td> Nanoject II Microinjector </td><td> Drummond 과학 </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> 고속 드릴 외과 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 18000-17 </td></tr><tr><td> 마이크로 드릴 철강 털은 0.7mm 팁 직경 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 19008-07 </td></tr><tr><td> LED 파란색 CMS 4.6 W </td><td> OSRAM </td><td> LBW5SN </td></tr><tr><td> 여성 전기 커넥터 (2.54 mm) </td><td> 피셔 Elektronik </td><td> BL5.36Z </td></tr><tr><td> LED를위한 전류 컨트롤러 (최대 : 1A) </td><td> A1W Electronik </td><td> HKO - KL50 - 1000 </td></tr><tr><td> 펄스 발생기 </td><td> AMPI </td><td> 마스터 - 8 </td></tr><tr><td> 광 파워 미터 </td><td> 토르 실험실 </td><td> PM100 </td></tr><tr><td> Cyanoacrylate 접착제 </td><td> Loctite </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Polycarboxylate 시멘트 (첫 번째 레이어 시멘트) </td><td> Septodont </td><td> Selfast (# 0068Q) </td></tr><tr><td> 메타 크릴 레이트 시멘트 (두 번째 레이어 시멘트) </td><td> GC InternationalCorp. </td><td> Unifast 트라드 - 리퀴드 (# 339292) Unifast 트라드 - 파우더 (# 339114) </td></tr><tr><td> Carprofen </td><td> 화이자 </td><td> Rimadyl </td></tr></tbody></table>

selective viral transduction of adult-born olfactory neurons for chronic in vivo optogenetic stimulation

지역 interneurons는 지속적으로 1-3 성인 설치류의 후각 망울에서 생성됩니다. 이 과정에서 측면 뇌실의 벽에서 신경 줄기 세포는 후각 망울에 도달하고 통합할 수있는 주동이의 철새 스트림 (RMS)을 따라 몇 밀리미터에 대한 마이 그 레이션 neuroblasts을 일으키다, 성인 neurogenesis했다. 다른 단계와 후각 회로 전부터으로 성인에서 태어난 뉴런 통합의 영향을 연구하기 위해서는 선택적으로 라벨과 뉴런의 특정 인구의 활동을 조작하는 것이 필요합니다. optogenetic 기술의 최근 발전은 정확하게 주위의 뉴런은 4,5 영향을주지 않고 뉴런의 특정 일대를 활성화하기 위해 조명을 사용하는 기회를 제공합니다. 여기, 우리들은 후각 망울에 도달하기 전에 RMS의 neuroblasts의 temporally 제한 일대에서 virally 표현 Channelrhodopsin2 절차의 시리즈 (ChR2) YFP를 제시하고 NE 성인 탄생이 될urons. 또한, 우리는 ChR2 - 표현 뉴런의 생체내 자극에 만성위한 LED 미니 이식해서 보정하는 방법을 보여줍니다.

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Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

후각 망울의 성인에서 태어난 뉴런은 optogenetically Channelrhodopsin2 - 표현 이식 미니어처와 함께 주동이의 철새 스트림과 만성 photostimulation에서 lentiviral 주사를 LED를 사용하여 조절할 수 있습니다.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

15.4K 조회수.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). 후각 망울의 성인에서 태어난 뉴런은 optogenetically Channelrhodopsin2 - 표현 이식 미니어처와 함께 주동이의 철새 스트림과 만성 photostimulation에서 lentiviral 주사를 LED를 사용하여 조절할 수 있습니다.

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

성인에서 태어난 뉴런의 통합을 공부

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

연구

신경과학

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

강한 감각 뉴런의 속눈썹에 갇힌 화합물의 플래시 광분해

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

뇌 조직의 만성 Optogenetic의 자극을위한 광섬유 주입

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

청각 신경의 자극 Optogenetic

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...