이 작품은 교육 및 연구 (Neurotechnology에 대한 번스타인 초점 T. 모저에 01GQ0810을 부여하고, MED-EL 독일)의 독일 연방 교육부에 의해 지원되었다; N. Strenzke 및 T. 모저에 독일 연구 나노 현미경과 뇌의 분자 생리학 센터를 통해 재단 (FZT 103, T. 모저)과 SFB889 통해).

본 연구에 제시된 모든 실험은 실험 동물의 보호 독일어 법에 의해 정의 윤리 기준으로 실시 하였다. 동물 복지에 대한 대학 괴팅겐의 보드 및 니더 작센의 상태의 동물 복지 사무소는 실험을 승인했다. μLED - 자극기의 1 준비 <ol><li> μLEDs를 들어, 첫번째 μLED - 자극기를 준비합니다. 200 μm의 활성 표면에 의해 200 블루 LED를 사용 (μLED, 재료 표 참조). </li><li> μLED에 솔더 와이어. 이어서, μLED 에폭시 접착제를 이용하여 연결을 캡슐화한다. 에폭시 경화 수 있도록 장치 하룻밤 둡니다. </li><li> 기계적 안정성 및 전기 절연성이 얇은 유리 모세관을 통해 와이어를 깔때기를 들어, 1mm 외경 보로 실리케이트 모세관을 사용하여 모세관 기계적 머니퓰레이터에 장착 될 수있다 (도 1D)되도록 에폭시 접합부를 밀봉. 참고 : T여기에 충분한 두께 (자극 유물을 피) 좋은 전기 절연을 얻을 수있는 캡슐을 만드는 트레이드 오프,하지만 LED가 수포 내에서 자유롭게 이동할 수 있도록하고 cochleostomy에 그것을 찾을 정도로 얇은입니다. 그것은 하나 이상의 LED를 준비하는 것이 좋습니다. </li><li> 좋은 전기 절연을 확인하려면 먼저 액체로 0.9 % 염화나트륨 및 딥 3 베어 종료 구리 와이어와 페트리 접시를 준비합니다. 이것은 ABR 전극과 동물을 시뮬레이션하는 역할을한다. ABR 앰프와 거기에서 오실로스코프에 전선을 연결합니다. </li><li> 이어서, 자극기에 연결하고 LED가 완전히 피복 될 때까지 용액으로 몰입. 이상 20 분 동안 최대 허용 전류에서 펄스 ​​(단계 3.1.1 참조) LED 자극 아티팩트 드라이브 검사. 나타나는 경우, LED를 폐기하고 새로운 시도. </li></ol> 2 수술 <ol><li> Thy1.2 프로모터에서 ChR2을 표현 4-10주 된 형질 전환 마우스 (9 호선을 사용하여왕의 등. 13). 수술을 동물을 조작하고 수행하려면, 항상 깨끗하고 잘 식별 된 수술 도구를 사용합니다. </li><li> 우레탄 (1.32 밀리그램 / kg), 자일 라진 (5 밀리그램 / kg)의 혼합물의 IP 주입하여 동물을 마취하고, 부 프레 노르 핀 0.1 μg / g 0.9 % 멸균 염화나트륨 용액으로 희석하고, 신체를 유지하기위한 가열 플레이트 상에 마우스를 배치 37 ° C의 온도. 이 용량으로, 일반적으로 마취 전체 실험 프로토콜에 대한 지속됩니다. <ol><li> 발 철수 반사에 의한 흥분의 흔적이 초기 마취 유도 검사 후 10 분 시작. 운동의 경우에, (자일 라진)없이 0.9 % 멸균 NaCl 용액에 희석 우레탄 (0.66 밀리그램 / kg) 및 부 프레 노르 핀 (0.05 μg / g)의 유지 투여 량을 적용한다. 다시 발 철수 반사를 확인하고 반사가없는 경우에만 진행합니다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 절개의 준비 retroauricular 영역을 면도. retroauricular을 사용하여수포 (공기 함유 중이강)에 도달하는 접근. <ol><li> 마이크로 포셉 신중하게 해부 및 / 또는 예를 들면 목 근육의 일부, 활 경근, 흉쇄 및 scalenes을 제거와 함께. </li><li> 찾아 수포 (그림 1A)를 노출합니다. 고막 (그림 1A)의 삽입을 나타내는 수포 표면에 반지와 특성 구형과 뼈 구조로 수포를 확인합니다. 바로이 반지 아래 인슐린 바늘의 끝이 구멍을 확인합니다. 달팽이관 promontorium은 (도 1b)에 노출되는 방식으로 미세 Rongeur (gnawer) 또는 microforceps과 수포 커버 뼈 제거가 시작. </li></ol></li><li> 그대로 막 미로 (그림 1B)를 떠나 돌보는 : cochleostomy를 들어, 부드럽게 작은 창을 엽니 다 (~ 500-800 μm의 cochleostomy를) 뼈 캡슐을 면도. 두 번째 인공 와우에 cochleostomy를 수행이 stapedial 동맥과 정점에서 충분히 그대로십시오. 정점을 열면 modiolus의 골절을 포함하여 달팽이관의 파열을 생성 할 수 있습니다. </li><li> 스칼라 고실 광섬유 또는 μLED 임플란트의 둥근 창을 삽입하는 경우, 조심스럽게 날카로운 메스의 끝이 뼈 틈새 시장을 긁어서 라운드 창 틈새 시장을 확대 (블레이드 번호 11은 좋은 선택이 될 것입니다). 항상 새로운 날 또는 메스를 사용합니다. stapedial 동맥 둥근 창 (그림 1B)에 매우 근접 실행될 때 매우주의해야합니다. </li></ol> 두 가지 방법을 사용하여 3 광 자극 <ol><li> transcochlear 자극, 사용 μLEDs 또는 섬유 결합 레이저하십시오. <ol><li> cochleostomy에 μLED의 위치를​​주의 깊게 기계 조작자에 μLED를 운반하는 모세 혈관을 마운트하고. 또는 위치를 최적화하기위한 수단으로서, 1-5 Hz에서 전류원 (2.7 V에서 통상적 5~40mA)에서 3-10 밀리 긴 자극에 의​​해 유발 사용 oABR,μLED의 ientation. </li><li> 레이저 자극의 경우, 473 nm의 연속파 레이저와 250 μm의 광섬유 (자료 참조)를 사용합니다. 커플 이상적 전력의 고속 아날로그 제어 (다른 광학 자극을 정의하는 음향 광학 소자 또는 빠른 셔터를 사용하여)를 제공 청색 레이저 광원에 광파이버. 미세 조작기를 사용하여, 직접 cochleostomy 상 섬유의 끝 부분을 찾아서 그 치과 용 시멘트 (transcochlear 자극)을 사용하여 해결할 수있다. </li></ol></li><li> intracochlear 자극의 경우, 스칼라 고실에 둥근 창을 통해 광섬유를 삽입합니다. 그런 다음 oABR을 유도하기 위해 1-5 Hz에서 10 ~ 30 mW의 (광 출력 전력)의 3-10 밀리 초 레이저 펄스를 사용합니다. oABR의 큰 진폭은 판독으로 oABR 진폭을 사용하여 이미 터의 위치와 방향 (μLED 또는 광섬유)를 최적화하기 위해 오실로스코프에 하나의 자극에 의​​해 유발 oABR을 관찰 할 수있는 실험을 할 수 있습니다. </li><li> 좋은 oABR이 달성되고 나면, cyanoacr와 섬유를 수정접착제 고체 때까지 ylate 접착제, 치과 시멘트 기다립니다. 참고 : 달팽이관에서 나오는 몇 가지 액체를 관찰하는 것은 정상입니다. 그러나 시멘트 중합 문제를 방지하기 위해서는, 미세한면 심지를 이용하여 영역을 건조하는 것이 바람직하다. </li></ol> oABR의 4 녹음 <ol><li> 정점과 다리 근처의 뒷면에, 귓바퀴 아래 바늘 전극을 삽입하고 앰프에 연결합니다. </li><li> 정점 차이 전위를 증폭 및 피하 주사 바늘을 유상 돌기. 50 kHz 및 필터 (1-10,000 Hz에서)의 비율로 샘플. 광 자극의 위치를​​ 최적화하기위한 녹화 설정 근처 이상적 오실로스코프 차분 전위 시각화. 신호 평균 (50-1,000x)를 사용하여 오프라인 분석을 위해 컴퓨터에 데이터를 저장합니다. </li></ol> 광학 유발 현지 필드 잠재력의 5 녹음 <ol><li> 정위 프레임에 동물을 배치합니다. 집게 센트를 사용하여집회는 두개골을 덮고 피부를 당겨 가위 대략 목 근육은 두개골에 연결 지점으로 눈 사이에서 연장과 중간 절개를 수행합니다. <ol><li> 측 방향으로 피부를 반영한​​다. 시상 봉합 길이 방향으로 골막을 잘라 조심스럽게 면봉으로 노출 된 두개골 뼈를 문질러 그것을 측방를 제거합니다. </li></ol></li><li> 접시와 람다의 꼬리 끝 사이의 약 1mm 공간을 남기고 노출 된 두개골에 사용자 정의 만든 금속판을 배치합니다. 0.7 mm 직경으로 조심스럽게 드릴 정수리 뼈에 구멍을 드릴. </li><li> 부드럽게 0.85 mm 직경 나사에 나사 - 열등한 둔덕에서 기록 된 전위에 대한 기준 역할을하는 (IC) - 한 나사가 단단히 고정되지 않는 집게로 고정 나사. 뇌를 관통하지 않고 나사와 경막 사이 좋은 접촉을 확인합니다. 나사와 시아 노 아크릴 레이트 접착제와 두개골 상에 금속 접시를 붙인다. </li><li> N을 풉니 다부드럽게 두개골에서 에크 근육. 하방 경 1-2mm에 목 근육을 잡아 당깁니다. 우수한 시상 동 (SSS) 및 횡 방향 동 (TS)의 교차점을 확인합니다. 필요한 경우, 생리 염화나트륨 용액으로 뼈를 가습하여 두개골의 투명성을 증가시킨다. <ol><li> SSS와 TS 교차로에 직접적으로 꼬리 거짓말로 쥐 IC를 식별합니다. 천천히 조심스럽게 IC의 위치를​​ 식별 한 후 공술 (Trepanation) 연장 약을 수행 0.5 mm rostrally TS에 하방 1.5 mm 및 횡 방향으로 약 3mm이다. </li><li> 성공적인 실험을 배제 할 이들과 같은 SSS와 TS에 부상을 피하십시오. 여기서, 구멍 뚫린 뼈가 부드럽게 밀어 넣어 느슨해 여부를 테스트합니다. 사용 집게 천천히 뼈를 들어 올립니다. </li></ol></li><li> 적절한 어댑터를 미세 조작기 상에 멀티 어레이와 headstage를 연결합니다. 경질를 꺼낼 때 조심스럽게, IC에 삽입하는 동안 멀티 채널 녹음 배열을 파괴 방지하기 위해작은 피하 주사 바늘의 구부러진 끝이 뼈 가장자리에 시작하는. <ol><li> 고정대에서 동물을 제거합니다. 정위 고정 남아 줄에 금속판을 고정합니다. IC를 통해 기록 프로브를 위치시키고 최상위 채널 표면에서 바로 볼 수 있도록 미세한 제어를 삽입합니다. </li></ol></li><li> 오프라인 분석을 위해 컴퓨터에 32 kHz의 로우 패스 필터 (300 Hz에서)과 상점의 속도로 기록 어레이와 정수리 뼈 기준 나사, 샘플의 개별 채널의 차이 전위를 증폭한다. </li><li> 모든 동물을 인도적으로 안락사 이전에 관련 지침에 따른 마취 회복 과정의 끝에 안락사한다. 안락사의 적절한 방법은 자궁 경부 전위 또는 CO 2 흡입을 포함 할 수있다. </li></ol>

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R., Peca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Transgenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2.">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).</li><li>Tomita, H., Sugano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Properties+of+Transgenic+Rats+Harboring+the+Channelrhodopsin-2+Gene+Regulated+by+the+Thy-1.2+Promoter.">Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter.</a> PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).</li><li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

설명한 실험 SGNs의 optogenetic 자극을 입증하고, 원칙적으로, 또한 내측 및 / 또는 외측 유모 세포를 자극하는 데 사용될 수 opsins의 발현을 제공 하였다. 이 실험은 많은 인내와 배려가 필요합니다. 앞서 언급 한 바와 같이, 가장 중요한 단계는 광원의 좋은 cochleostomy / 라운드 창 삽입뿐만 아니라 적절한 위치 자세이다. ChR2를 사용 optogenetic 자극과 제한 사항이 있습니다. 자극의 ?...

세계 보건기구 (WHO)에 따르면, 3억6천만명는 전 세계적으로 청력 상실로 고통. 청각 장애인 대상에서 CI에 의해 SGNs 직접 전기 자극 그들 1,2,4,5-의 대부분에서 열려 음성 이해를 할 수 있습니다. 비록 CI에 따라서는 가장 성공적인 neuroprosthesis되고, 20 만 명 이상에 이식되어, 현재 인공 와우 이식에 의해 구동 사운드 인코딩이 제한됩니다. CI에 각 하나가 청각 신경 따라서 달팽이관에 코르티 역기능 감각 기관을 우회 tonotopic 영역을 활성화 전극의 특정 번호에 의해 전기 자극을 기반으로합니다. 정상 청력 청취자 그러나 오늘날의 CI는 최대 12-22 주파수 채널 4에 사용, 2,000 개 이상의 주파수를 구별 할 수 있습니다. 이는 많은 다른 소리 주파수 8,15 SGNs을 나타내는 다수의 활성화 전극 7,9 각 자극에서 널리 전류 흐름이다. 이제한 다극 자극을 ​​사용하지만 높은 소비 전력 16,17의 비용을 개선 할 수있다. 소리 강도에 대한 그들의 출력 동적 범위는 일반적으로 6-20dB 4,18 이하로 제한된다. 이러한 이유로, 개선 빈도와 강도 해상도는 시끄러운 환경, 운율 이해와 음악 인식에서 음성 인식을 개선하기 위해 CI 성능을 향상시키기위한 중요한 목표입니다. 청각 신경을 자극하는 다른 옵션은 광 자극이다. 빛은 편리하게, 더 나은 공간 감금을 약속 주파수 해상도를 증가시키고 또한 더 나은 강도 해상도의 결과로, 동적 범위를 확대, 작은 SGN 인구를 대상으로 집중 될 수있다. 실제로, 적외선 빛을 가진 인공 와우 자극은 동물 모델 10,11,19 우수한 주파수 해상도를 보여 주었다. 자극이 종류의 한 단점은 전기 자극보다 높은 에너지를 필요로한다는 것이다 <sup&gt; 10, 11. 또한, 직접 청신경을 자극하는 방법의 능력에 대한 우려는 12,20 제기되어왔다. 적외선 자극에 대한 대안으로, 우리는 SGNs 민감한 빛을 렌더링하는 optogenetics를 사용합니다. Optogenetics 비 침습적으로 유전 및 광학 기술을 결합하고 특히 높은 시간 정밀도 (리뷰 21 - 23)와 세포를 제어하는 새로운 접근 방법이다. 현재 가장 많이 사용되는 양상은 인 Chlamydomonas reinhardtii에서의 미생물 channelrhodopsin 2 (ChR2) 유전자의 발현을 고용하고 빛 게이트 양이온 채널 24을 인코딩, 이들의 변종. ChR2는, 뉴런으로 형질 도입 및 청색 광에 의해 활성화 될 때, 이와 같이 세포를 24 - 27 탈분극 같은 비 선택적 양이온 채널을 작용 7 - 막 관통 나선 단백질이다. ChR2 잘 특징되었습니다 24,28- 31 많은 변종이 actio을 수정하기 위해 개발되었습니다n 개의 스펙트럼, 게이트 및 투과성 특성 (32, 33). 우리 연구의 목적은 청각 경로의 활성화를 위해 인공 optogenetics을 확립하는 것이다. 우리는 청각 신경을 자극하는 optogenetic 접근 방식은 channelrhodopsin의 발현에 나선 신경절의 유전자 조작을가 있어야한다는 사실을 명심해야합니다. 마우스 및 쥐와 함께 작업하는 것은 tonotopic 축을 따라 동물 36에서 약간의 변화와 함께 channelrhodopsin의 발현을 제공 사용할 수 형질 전환 동물 13,34,35의 사용을 할 수 있습니다. 적절한 Cre 호텔 라인과 조건부 대립 유전자 37을 결합하여 세포 고유의 표현을 제공한다. 다른 동물의 나선 신경절에 유전자 전달은 optogenetics 38 표준 방식 인 아데노 - 연관 바이러스와 같이 우리가 마우스 (36)에서 잘 작동하는 것을 보여 주었다 바이러스의 사용을 필요로한다. 유전자 조작과 같은 글로불린 등의 부작용에 ​​대한 외국인 단백질에게 곰 위험을 코딩하는 유전자의 발현북동 응답 및 / 또는 증식, 손상 상태 나 유 전적으로 조작 된 세포의 죽음. 이 데모의 목적을 위해 우리는 광학적으로 청각 경로를 자극하는 네-1 프로모터 13에서 나선 신경절 신경 세포에 ChR2을 표현 형질 전환 마우스를 사용합니다. 우리는 우리가 SGNs 39로 변형 캐치 14의 바이러스 매개 전송을 사용하여 설명 된대로 다른 channelrhodopsin 변종이 같은 목적을 위해 이용 될 수 있습니다. 인공 optogenetics는 유전자 조작을 필요로하지만, 최적화 SGN 자극 분자에 대한 튜닝을 제공하고 전기 자극에 비해 약속 주파수 및 세기 해상도를 향상시켰다. 청각 경로의 Optogenetic 자극은 연구 청각에 매우 관련이있다. 예를 들어, 사운드의 스펙트럼 localizat 통합 요구 분석, 개발 중에 tonotopy의 활성에 의존하는 정제의 연구 발전을 약속이온 및 중앙 청각 시스템의 주파수 별 심성 돌기 사이의 상호 작용의 정도.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U2500-100G</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl</td>
			<td>RXV</td>
			<td></td>
			<td>Sedative and analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td></td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Only to be used to hold soft tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>To open the skin and help with the muscle dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lempert Rongeurs&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16004-16</td>
			<td>They are very useful to easily remove the bone from the bulla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473-nm laser&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>MLL-III473</td>
			<td>100 mW solid state 473 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser driver&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>DPSSL MLL 100 mW</td>
			<td>TTL operated laser driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;m optical fiber</td>
			<td>Any comercial ; e.g. Thorlabs</td>
			<td>M42L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>PCAOM VIS</td>
			<td>Control the amount of light coupled into the fiber from the laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>160T1-8SAR-24-0.8</td>
			<td>Control the acousto-optic modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solo2 laser power &#38; energy meter</td>
			<td>Gentec-EO</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue &#181;LED</td>
			<td>Cree</td>
			<td>C470UT200</td>
			<td>It is necessary to build several &#956;LED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDT System&#160;</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td>RZ6-A-P1</td>
			<td>It can be used any system for stimulus generation&#160; presentation and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-shank, 16-channel silicon probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&#160;</td>
			<td>These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill Steel Burrs</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19007-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self tapping bone screw</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19010-10</td>
			<td>Reference screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis</td>
			<td></td>
			<td>Positioning of recording probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic stimulation of the auditory nerve

인공 와우 (CI에)에 의해 나선 신경절 신경 세포 (SGNs) 직접 전기 자극을 이식 청각 장애인 과목 1-6 대부분의 오픈 음성 이해를 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 현재의 CI와 사운드 코딩으로 인해 달팽이관 7-9의 tonotopic 축을 따라 SGNs의 큰 숫자를 활성화하는 각 전극 접촉에서 폭 넓은 전류 확산 가난한 빈도와 강도의 해상도를 가지고있다. 광 자극은 공간적으로 더 따라서 SGNs의 활성화를 밀폐과 약속 전기 자극, 부호화 높은 주파수 해상도의 대안으로서 제안되었다. 최근, 달팽이관 직접 적외선 조명 청신경 (10)에 응답을 연상하는 데 사용되어왔다. 전기 자극 10, 11 및 불확실성이 기반이되는기구 12로 남아보다 그럼에도 불구하고 더 높은 에너지를 필요로한다. 여기에서 우리는 SGNs을 자극하는 optogenetics를 기반으로하는 방법을 설명channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 ChR2 변종 캐치 14의 바이러스 매개 표현의 신경 식으로 형질 전환 마우스를 사용하여 낮은 강도 푸른 빛과 함께. 우리는 작은 인공 개구부 (cochleostomy) 또는 둥근 창을 통해 ChR2 - 표현 SGNs을 자극하는 다이오드 (μLEDs) 및 광섬유 결합 발광 레이저 마이크로 빛을 사용했습니다. 우리는 빛을 유발 전위 (optogenetic 청성 뇌간 반응 : oABR)의 두피 녹음하여 응답을 정량 또는 청각 경로에서 미세 전극 기록에 의해 음향 및 전기 자극으로 그들을 비교했다.

<html> 최적 cochleostomy은 중요하고 성공적인 실험의 확률을 증가시킨다.이 윈도우가 일정한 작은 것을 의미하고, 내부 인공 구조물의 어떠한 손상도 없다. 예를 들어, 출혈은 강선 vascularis의 손상 될 수 있음을 나타냅니다. 좋은 예는 그림 (b)에 표시됩니다. ChR2 - 형질 전환 마우스를 사용하여, ChR2은 달팽이관 (그림 1C) 내에서 SGNs 표현된다. ,...

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Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

인공 와우 (CI를) 청각 신경에 직접 전기 자극으로 청각 수 있습니다. 그러나 가난한 빈도와 강도 해상도의 CI와 청각의 품질을 제한합니다. 여기에서 우리는 청각 연구와 미래의 CI 개발을위한 대안 전략으로 생쥐에서 청각 신경의 optogenetic 자극을 설명합니다.

청각 신경의 자극 Optogenetic

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

optogenetic-stimulation-of-the-auditory-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.5K 조회수.  University Medical Center Goettingen.  인공 와우 (CI를) 청각 신경에 직접 전기 자극으로 청각 수 있습니다. 그러나 가난한 빈도와 강도 해상도의 CI와 청각의 품질을 제한합니다. 여기에서 우리는 청각 연구와 미래의 CI 개발을위한 대안 전략으로 생쥐에서 청각 신경의 optogenetic 자극을 설명합니다. 

비디오: Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS : 연약한 X 증후군 및 자폐증과 개인의 소성의 Mechasnism를 탐험하는 세타 - 버스트 프로토콜을 사용하여

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

연구

신경과학

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

NeuroStar TMS 장치 : FDA를 실시는 우울증 치료 프로토콜을 승인

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

뇌 조직의 만성 Optogenetic의 자극을위한 광섬유 주입

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

조류 배아 Vestibulocochlear 신경 청각 섬유의 선택적 추적

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

경피적 전기 신경 자극을 사용하여 신경 근육 기능의 평가

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.