이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 수상 (0953583) 및 건강 NCI / R21-CA116102의 국립 연구소, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에서는 하나의 올리고 뉴클레오티드 (RBMB1)는 CF640R 기자 염료와의 5&#39;-끝 부분에 표시하고, 순서를 가지고 : 5&#39; mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC 뮤 mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC mUmU-3 &#39;. 머리 핀의 자형 구조의 형성을 구동 자체 보완 도메인은 굵게 표시되어 있습니다. 둘째 올리고 뉴클레오티드 (RBMB2)는 아이오와 블랙 RQ-SP 거제와 &#39;말단에 표지와 순서가되었다 : 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3&#39;. RBMBs의 1 준비 <ol><li> RBMB1 및 RBMB2 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 튜브의 빠른 스핀을 수행 건조 올리고 뉴클레오티드는 100 μM의 최종 농도의 DNase와의 RNase가없는 물에 튜브의 바닥 및 재현 탁입니다 보장합니다. 예를 들어, 올리고 뉴클레오티드의 10 nmol을 샘플을 물 100 ㎕에 재현 탁한다. </li><li> MEAS우레 UV-VIS 분광에 의해 RBMB1 및 RBMB2 재고 샘플의 정확한 농도. <ol><li> microcentrifuge 관에서 (칼슘과 마그네슘없이) 117 μL의 DPBS로 RBMB 샘플 3 μl를 섞는다. </li><li> DPBS 빈 분광 광도계는 200 ~ 800 nm의에서 흡광도를 측정한다. 참고 : 피크가 260 nm에서 흡광도 650 nm의가 볼 수 있어야합니다. </li><li> 식을 이용하여, 260 나노 미터 (또는 650 nm의 RBMB1)에서의 흡광도에 기초 RBMB 샘플 스톡 농도를 계산 스톡 농도 (M)는 260 (260) nm에서 흡광도 및 희석 배수가 40 인 260 * 희석 팩터 / 흡광 계수 =. 주 : RBMB 대한 흡광 계수는 올리고 뉴클레오티드 제조업체에서 제공 사양서에서 찾을 수있다. 650 nm에서 CF640R의 흡광 계수는 103000이다. </li></ol></li><li> 100 μM의 RBMB1의 20 μL, 100 μM의 RBMB2의 30 μl를, 혼합 6 ㎕의 10 배, 인산염 완충액 (10 배 인산염 완충액 : 480 밀리미터 K 2 HPO 4, 45 mM의 KH 2 PO 4, 140 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 산도 7.2) 4 μL의 DNase의와의 RNase없는 물입니다. 30 분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. 주 : 이것은 일반적으로 약 50 연구에 충분하다. </li><li> 모든 unhybridized RBMB2 올리고 뉴클레오티드를 제거하기 위해 75 학년 준비하고, Superdex를 사용하여 액체 크로마토 그래피 컬럼을 준비합니다. 혼합 된 프로브의 작은 볼륨을 정화 ~ 4 ml의 침대 볼륨과 8 ㎖ (0.7 × 20cm) 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용합니다. </li><li> 세척은 0.6 ㎖ / 분의 유속으로 유동 실행 주사기 펌프를 사용하여 ~ 1X 인산 완충액 50 ㎖를하고, Superdex을 평형화하고. 유체가 모두 베드 부피로 진입하기 전에, 주사기 펌프를 정지하여 분리하고 남은 액체는 중력에 의해 열을 가자. </li><li> 크로마토 그래피 컬럼 상에 RBMB 혼합물 (60 μl를) 넣습니다. <ol><li> RBMB 샘플은 완전히이 후베드 입력 천천히 전체 샘플을 완전히 열 진입했음을 확인하기 위해 베드의 상부에 1X 인산 완충액 250 ㎕를 또 다른 추가. </li><li> 1X 인산 버퍼 림에 열을 채 웁니다. 상단을 닫고, 주사기 펌프를 시작 - 주사기가 충전되어야 ~ 50 mL의 PBS 1X 및 0.6 ml / 분의 유속으로 실행. </li><li> RBMB 컬럼의 하단에 가까워지면 - RBMB 시료 전형적 용이 프로브에 혼입 염료의 색으로 인해 가시화 될 수있다 - microcentrifuge 관 당 2 방울 (1.5 ㎖)에 흐름을 통해 수집한다. 마이크로 원심 튜브 내에서 색이 분명해진다 일단 샘플을 수집 중지합니다. </li></ol></li><li> 일반적으로 5 ~ 6 튜브 - - 컬러 RBMB 샘플이 들어있는 튜브를 결합하고 원심 필터 장치 (10,000 MW 컷오프)로로드합니다. 20 분 동안이나 원하는 볼륨까지 10,000 RCF에서 샘플을 원심 분리기. 주 :이 속도와 시간은 것입니다 일반적으로~ 30 μL의 최종 부피를 수득 하였다. </li><li> UV-VIS 스펙트럼에 의해 정제 RBMB 샘플의 정확한 농도를 측정한다. <ol><li> 농축 RBMB 샘플 3 μl를 타고 microcentrifuge 관에 117 μL의 DPBS와 혼합. </li><li> DPBS 빈 분광 광도계는 200 ~ 800 nm의에서 흡광도를 측정한다. 참고 : 피크가 260 nm에서 흡광도 650 nm의가 볼 수 있어야합니다. </li><li> 식을 이용하여, 650 nm에서의 흡광도에 기초하여 혼성화 RBMB의 스톡 농도를 계산 스톡 농도 (M)는 650 (650) nm에서 흡광도가 650 * 희석 팩터 / 소멸 계수 = 희석 인자는 40이다. 주 :하는 650nm에서 CF640R 대한 흡광 계수가 103000이고 아이오와 블랙 RQ 대한 흡광 계수가 20,000 ~. 흡광 계수는 첨가제 아르와 하이브리드로 구분하지 않습니다. 따라서, 주식 RBMB 샘플 approximatel의 조합 흡광 계수가650 nm에서 Y 123000. </li></ol></li><li> 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 이름과 농도 및 저장 적절하게 튜브를 레이블을 지정합니다. </li></ol> 8 잘 챔버 커버 글라스 코팅 폴리-D-라이신의 2 준비 <ol><li> 무균 환경에서 멸균 물 25 ㎖ 중의 폴리-D-라이신 (동결 건조 분말, g-조사) 5mg을 용해시켜 폴리-D-라이신의 0.2 ㎎ / ㎖ 용액을 준비한다. </li><li> 무균 환경에서, 8 잘 챔버 커버 글라스의 각 웰에 0.2 ㎎ / ㎖ 폴리-D-라이신 용액 200 μl를 추가합니다. </li><li> 세포 배양 후드에서 16 ~ 18 시간 동안 실온에서 품어. </li><li> 폴리-D-라이신을 대기음 멸균 증류수로 잘 3 번 씻는다. 참고 : 코팅 챔버 슬라이드가 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3 프로브 배달 주 : 적어도 4 연속 바인드 RNA를 발현 통합 유전자 구조를 포함해야 사용 전지 시스템3&#39;-비 번역 영역 (UTR)의 RBMB에 대한 사이트를 보내고. 표적 서열은 RBMB의 루프 보완해야한다. 이는 음성 대조군으로서, 동일 세포주가 동일한 유전자 구조를 표현할 수 있도록 설계되는 것이 권고되지만 탠덤 반복하지 않고있다. 이 프로토콜에서, 인간 섬유 육종 세포주는 HT1080, 3&#39;-UTR에서 RBMB 표적 서열의 96 탠덤 반복으로 GFP의 RNA를 발현하도록 설계 하였다. 제어 세포주가 야생형 GFP의 RNA를 발현하도록 설계 하였다. <ol><li> 일일 프로브 배달 전에 40~50%의 포화 상태에서 T25 플라스크에 플레이트 세포. 농경 1 % 펜 / 패 혈성 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM 매체와 세포 및 5 % CO 2에서 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 다음 날, microporator 켜고 950 V,이 펄스, 25 밀리 초에 microporation 매개 변수를 설정합니다. 이러한 매개 변수는 HT1080 세포에 최적화 된,하지만 그들은 의존 세포의 유형과 adjus가 될 수 있습니다테드는 다른 세포 유형에 대한 제조업체의 지침에 설명 된대로. </li><li> 4 ML 전해 버퍼 microporation 튜브를 입력하고 microporation 역에 놓습니다. </li><li> 정제 RBMB의 주식 샘플을 꺼내서 해동. 1X 인산 완충액 12 μM의 최종 농도로 몇 마이크로 리터를 희석. 1 ㎕를 각 microporation 필요합니다. </li><li> 피펫 FBS와하지만 microcentrifuge 관으로 항생제가없는 배지 1 ㎖. 주 :이 당분간 microporation 장치 근처 microporation 직후 세포를 중단하는 데 사용되며, 별도로 설정 될 수있다. 배양 배지에서 항생제의 포함은 microporation 후 세포 생존율을 감소한다. </li><li> 한 번 1 ㎖의 칼슘 및 마그네슘 2 + - 무료 DPBS로 세포를 씻어 설계 HT1080 세포 (60-80% 합류)에서 세포 배양 배지를 제거하고 1-2 분 동안 한 ML 트립신을 품다. </li><li> trypsinizatio 중지항생제와 페놀 레드없이 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 DMEM 1 ㎖의 매체를 추가하고,이 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포를 전송함으로써 N. </li><li> 5 분 동안 200 XG에서 마이크로 원심 튜브에 세포를 스핀 다운. 상층 액에 resuspend를 제거하고 1 ML의 DPBS의 최종 볼륨 세포 펠릿을 결합한다. </li><li> 잘 혼합 된 세포 현탁액에서 10 μl를 가지고 세포를 계산합니다. </li><li> 확실히 그들은 잘 분산하고 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 DPBS 30 만 셀을 전송하고 5 분 동안 200 XG에 스핀 다운 위아래로 여러 번 세포를 피펫. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 상층 액을 제거합니다. 세포가 잘 분산되도록 11 μL의 재 부상 버퍼와 피펫 위아래로 여러 번에 펠렛을 재현 탁. 공기 방울을 생성하지 않도록해야합니다. 참고 : 공기 거품이 microporation 동안 스파크의 원인이 가난한 RBMB 전달 및 세포 사멸 발생합니다. </li><li> 희석 RBMB (12 μM) 1 μl를 추가로 pipetting에 의해 여러 번 아래로 잘 섞는다. 다시 공기 방울을 생성하지 않도록주의하십시오. </li><li> 기음 RBMB 세포 혼합물의 10 μL, microporation 피펫을 사용하고 microporation 튜브에 피펫을 삽입합니다. microporation을 시작하려면 시작 버튼을 누릅니다. 참고 : 끝에서 눈에 보이는 기포가 없어야합니다. </li><li> microporator의 화면이 완료가 표시되면, FBS와하지만, 항생제없이 1 ml의 배지와 함께, 이전 제조 하였다 microcentrifuge 관에 10 ㎕의 혼합물을 배출, 역에서 피펫을 제거합니다. 튜브 좌우 수회 부드럽게 흔들어 섞는다. </li><li> 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀과 세포로 전달되지 않은 모든 RBMBs을 제거하기 위해, FBS와 함께하지만, 항생제없이 1 ml의 페놀 레드 무료 배지에서 세포를 두 번 이상 세척. FBS은 있지만없이 400 ㎕의 페놀 레드 무료 문화 매체와 재현 탁항생제. </li><li> 플레이트 잘 당하거나 원하는 자랄 200 μL에서 8 잘 챔버 커버 글라스 코팅 된 폴리-D-라이신에 microporated 세포. </li><li> 선택적 : 그것이 핵이 화상에 바람직한 경우, 0.01 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 세포에 Hoescht 33,342 추가. </li><li> 세포 배양 인큐베이터로 챔버 커버 글라스를 놓습니다. 세포를 커버 글라스의 표면 상에 정착 할 충분한 시간을 가질 수 있도록, 종래 촬상 1-2 시간 동안 세포를 배양한다. 주 : 이미징을 30 분 포스트 - microporation 자마자 수행 될 수있다. </li></ol> 4 이미지 인식 <ol><li> 라이브 세포 단계 상위 배양 시스템을 켭하고 37 ° C, 5 % CO 2, 75 %의 습도에 도달 할 때까지 그것을 평형. </li><li> 현미경과 형광 광원의 전원을 켜고 MetaMorph로부터 소프트웨어를 엽니 다. 주 : 현미경 제어 및 이미지 획득을위한 다른 유사한 소프트웨어 패키지가 또한 사용될 수있다. </li><li> 에 Immersol 오일을 적용목적. </li><li> 라이브 세포 단계 상위 배양 시스템에 microporated 세포와 챔버 커버 글라스를 전송합니다. 온도가 될 때까지 무대 위에 시스템을 품어 CO 2 농도는 안정된다. </li><li> MetaMorph로부터 소프트웨어에서 획득 탭​​을 엽니 다. 필드를 찾기 위해, 라이브 버튼을 클릭하여 흰색 빛 아래 초점을 조정하고 중지 라이브 버튼을 클릭합니다. </li><li> 획득 탭에서 클릭하고 스트림 인수 팝업 버튼을 열고 원하는 영화 인수 매개 변수를 설정합니다. Cy5에 / CF640R 필터를 사용하여 150 프레임을 획득하고 하드 드라이브에 이미지를 저장합니다. </li></ol>

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	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Dictenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+fluorescent+RNA+ensures+a+bright+future+for+visualizing+nucleic+acid+dynamics.">Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics.</a> Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).</li><li>Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+pulsing+of+a+developmental+gene.">Transcriptional pulsing of a developmental gene.</a> Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).</li><li>Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+nascent+RNA+dynamics+reveals+distinct+types+of+transcriptional+pulse+regulation.">Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).</li><li>Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+endogenous+RNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila.">Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).</li><li>Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+bicoid+mRNA+in+late+oocytes+is+maintained+by+continual+active+transport.">Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport.</a> Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).</li><li>Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+beta-actin+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+a+living+cell.">Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell.</a> Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).</li><li>Fusco, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mRNA+molecules+demonstrate+probabilistic+movement+in+living+mammalian+cells.">Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).</li><li>Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+endogenous+mitochondrial+RNA+in+single+living+cells.">Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells.</a> Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).</li><li>Daigle, N., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LambdaN-GFP:+an+RNA+reporter+system+for+live-cell+imaging.">LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging.</a> Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).</li><li>Bogaard, P. T., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+beacons+to+study+dispersal+of+mRNPs+from+the+gene+locus.">Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus.</a> Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).</li><li>Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+transport+in+the+nucleus.">Mechanism of mRNA transport in the nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).</li><li>Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+bimolecular+beacons+for+the+sensitive+detection+of+RNA+in+single+living+cells.">Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells.">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+shared-stem+and+conventional+molecular+beacons.">Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).</li><li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridization+kinetics+and+thermodynamics+of+molecular+beacons.">Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).</li><li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction.">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells.">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).</li><li>Ainger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+and+localization+of+exogenous+myelin+basic+protein+mRNA+microinjected+into+oligodendrocytes.">Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes.</a> J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li><li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells:+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs.">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).</li><li>Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+visualization+in+live+bacterial+cells+using+fluorescent+protein+complementation.">RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation.</a> Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Chen, A. K., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+RNA+in+living+cells+with+molecular+beacons:+current+perspectives+and+challenges.">Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+FRET+molecular+beacons+for+mRNA+detection+in+living+cells.">Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).</li><li>Altman, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

닥터 마크 Behlke 박사 링 황는 원고에 기술 된 화합물의 일부 유사한 판매 올리고 뉴클레오티드를 제공하는 IDT에 의해 사용된다. IDT는 그러나, 상장 회사, 그리고 그들은 개인적으로 IDT의 / 자기 지분을 보유하고 있지 않습니다.

기존의 넓은 필드 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체 할 수있는 능력은 각 RNA 전 사체 언 바운드 형광 프로브로부터 나오는 낮은 형광 배경에 관련 지을 수있는 밝고 광 안정성 형광 신호를 필요로한다. 이 방법에서, 밝은 형광 신호는 각각의 RNA 전 사체 상에, (96까지) 다중 올리고 뉴클레오티드 계 형광 프로브, 즉 RBMBs 혼성화함으로써 달성된다. 그러나, ?...

RNA 전 사체의 발현 및 조절은 세포의 행동과 운명을 제어하기위한 주로 담당하는 복잡하고 역동적 인 과정이다. 지시 된 세포 기능의 RNA의 중요성이 얼마 동안 알려져 있지만,이 가장 RNA 분석 도구는 전사 붕괴 중요 규제 이벤트를 캡처하기 위해 필요한 공간 및 시간 해상도가 부족하기 때문에, RNA 들간의 연결을 그리는 힘들다 인신 매매 및 지역화 된 RNA 처리. 이것은 각각의 RNA 전 사체가 실시간 1에 살아있는 세포에 시각화 할 수 있도록 여러 기술의 출현하게되었다. 아마,이 기술의 가장 눈에 띄는는 3&#39;-UTR 2,3에 MS2 결합 부위의 탠덤 반복을 포함하도록 설계되었습니다 RNA를 대상으로 GFP-MS2 융합 단백질을 이용한다. 가까운 거리에 여러 GFP 분자를 제공함으로써, 각각의 RNA 전 사체는 밝은 형광 점으로 나타나는형광 현미경을 통한. GFP-MS2 시스템은 직접 시각화 및 전사의 측정 4,5 분출 독특한 서브 셀룰러 지역화 및 처리 6-9의 검출, 및 RNA 수송층 (10)의 실시간 영상을 포함한 RNA 동작으로 전례 통찰력을 제공하고있다. 그러나, GFP-MS2 시스템의 엄청난 잠재력에도 불구하고, 언 바운드 GFP-MS2 융합 단백질이 기술의 다양성과 동적 범위를 제한하는 높은 배경 형광 신호를 생성 할 수 있습니다. 몇몇 접근법은 세포 내 비 결합 GFP-MS2 (10)의 구획화, 단백질 단편 상보성 (11), 및 대체 RNA 결합 단백질을 포함하여, 이러한 배경 신호를 제한하기 위해 개발 및 12을 표적으로되었다. 그러나 이러한 접근 방법은 모든 RNA 표적과 MS2-GFP 융합 단백질의 상대적 총 발현에 민감한 남아있다. 로GFP-MS2 시스템에 lternative, 분자 비콘은 3&#39;-UTR 13,14에 상보적인 결합 부위의 탠덤 반복으로 조작 된 RNA 전 사체를 검출하기 위해 사용되어왔다. 분자 비콘은 소광 한 끝에 형광 리포터와 함께 타단 개는 헤어핀 - 형성 올리고 뉴클레오티드 프로브이다. 소광 RNA에게 형광 기자를 대상으로 바인딩하지 않을 경우 낮은 형광 상태의 결과로, 가까이에 남아있다. 하이브리드시, 형광 기자와 소광 떨어져 강제로 형광이 복원됩니다. GFP-MS2 시스템, 형광 현미경으로 식별 할 수있는 밝은 형광 반점의 단일 RNA 전 사체의 결과로 여러 분자 표지의 결합에 유사; 그러나, 배경 형광 인해 비 결합 분자 비컨 켄칭 구성으로, 훨씬 낮은 것으로 예상된다. 불행하게도, 영리 활성화 메커니즘에도 불구하고 그 m에 통합olecular 표지 디자인, 살아있는 세포에 도입 할 때 머리 핀의 자형 형태를 유지하지 않는 분자 비콘을 unhybridized 성장 증거가 지금있다. 결과적으로, 그들은 훨씬 신호대 배경을 감소 위양성 신호를 생성한다. 15, 16,이 단점을 극복하기 위해, 우리는 최근 살아있는 세포, 비율 계량 생체 분자 비콘 (그림 1A RBMBs)에 영상 RNA에 대한 새로운 합성 프로브를 개발했다. RBMBs 짧은 헤어핀 RNA (shRNA를) 및 분자 비콘 모두의 기능을 가진 복합 구조체를 형성하는 두 개의 2&#39;-O-메틸 가닥 올리고 뉴클레오티드로 구성된다. 3&#39;-오버행과 UU 긴 이중 가닥 도메인 shRNA를 더 특징 인 반면 루프 및 형광 활성화 메커니즘, 분자 비콘 유사하다. shRNA를 기능은 최소한의 관찰 저하 우리는&gt; 24 시간으로 증가에게 세포 수명을 발견 핵 수출을 구동하도록 설계되어루프의 비 특정 개방을 방지 할 수 있습니다. 결과 RBMBs 분자 비콘보다 훨씬 높은 신호 대 배경을 나타내고있다. RBMBs가 RNA 기반 프로브와 같은 핵 수출 기능을 소유하지 않은 DNA 프로브 기반하기 때문에, DNA 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 제조 할 수 없다는 것을 또한 주목해야한다. 구조적 RBMB 루프는 일반적으로 RNA 혼성화시 특이성 및 선택성 사이의 균형을 만들기 위해, 길이 (15) 및베이스 (21) 사이에있을 수 있도록 설계된다. 이 자체 보완 도메인에서 형성하는 짧은 줄기는 보통 4 기지가 될 수 있도록 설계되었습니다. 이상 줄기가 선택된 경우 RBMB 루프와 표적 RNA와 혼성화 속도는 상당히 17,18 둔화된다. 줄기 짧은 시퀀스가​​ 선택되면 반대로, 용융 온도가 높은 백그라운드 신호 선도, 37 ° C에서 스템 - 루프 구조를 유지하기 위해 종종 너무 낮다. RBMB의 특이성은 빨간색입니다줄기 길이를 짧게 같이 uced. 또한 RBMB 성능에 영향을 미칠 수 RBMB 스템 - 루프의 서열 때문에, 조심스럽게 19을 선택한다. 특히, 이상적인 루프 서열은, 최소한의 이차 구조를 가져야 최소한 이차 구조와 RNA 서열에 혼성화, 단백질 결합 부위를 방지하고, 바인딩 표적 이탈 방지. RBMB 및 RNA 이차 구조 모두의 예측은 mfold (20)와 같은 소프트웨어를 사용하여 얻을 수있다. 보완 오프 대상 사이트는 염기 기본 지역 지정 검색 도구 (BLAST)를 사용하여 식별 할 수 있습니다. 그러나, 모델 예측과 단백질 기다리고 사이트를 식별하는 데 어려움 불일치의 모든 RBMBs의 특이도는 궁극적으로 실험적으로 검증되어야합니다. 바람직한 경우, 혼성화 상태에 민감하다 unquenched 기준 염료 RBMB (15)에 첨가 될 수있다. 기준 염료의 추가 홍보 할 수 있습니다프로브 배달 마커 ovide 총 형광 세포의보다 정확한 측정이 요구되는 경우, 비율 적 촬상에 사용될. 기준 염료 측정 배달 세포 간 차이로 인해 배경에서의 차이에 대해 조정될 수있다. 그러나, 개개의 RNA를 묘화 할 때 참조하면 염료가 필요하지 않다 사체. 특히, 일부 참조 염료는 핵에 약간 더 높은 배경 신호로 이어지는 핵에서 RBMBs의 수출을 방해 할 수 있습니다. 적절하게 설계하면 표적 RNA는 적어도 네 RBMB 결합 부위 (도 1b) (16)를 포함하도록 설계된다면, RBMBs는 단일 살아있는 세포에서 개별 이미지 RNA 전 사체에 사용될 수있다. RBMBs 효율적으로 세포 생존율 (21)에 아무런 영향이 거의, microporation 통해 세포 유형의 넓은 범위로 제공 될 수 있으며, 유전자 발현의 정량적 인 측정을 할 수있다30 분 이내에 취득했다. 바인드 RBMBs부터 형광을 효율적으로 급냉되기 때문에 더욱이, 방법은, RBMB 농도와 표적 RNA 수준에 비교적 둔감하다. 여기서 우리는 RBMBs을 제조하고 정제하는 데 사용되는 방법의 상세한 설명뿐만 아니라 microporation 통해 라이브 세포로 RBMBs의 전달을위한 일반 절차와 실시간 단일 RNA 전 사체의 화상을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="977">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease-free Water</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">AM9932</td>
			<td style="width:244px;">no DEPC-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DPBS</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No Ca2+ and Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:207px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P284-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">S381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;">22364111</td>
			<td>1.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Chromatography Column</td>
			<td style="width:207px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:220px;">420400-0720</td>
			<td>0.7x20cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Superdex 75 Prep Grade</td>
			<td style="width:207px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:220px;">17-1044-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:207px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:220px;">BS-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe</td>
			<td style="width:207px;">BD</td>
			<td style="width:220px;">301035</td>
			<td>60mL, Luer-lok tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">UFC501096</td>
			<td>Mw 10,000 cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifuge 5418</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">P7280-5MG</td>
			<td>lyophilized powder, g-irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">8-well chambered coverglass</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">155409</td>
			<td>Working volume 0.2-0.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HT1080</td>
			<td style="width:207px;">ATCC</td>
			<td style="width:220px;">CCL-121</td>
			<td>Human Fibrosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">430639</td>
			<td>25cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">11965084</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM without Phenol Red</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">21063029</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F2442-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Penecillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Trypsin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Neon transfection system</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon transfection system kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">02-671-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoescht 33342</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IX-81 Inverted fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Olympus</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">SOLA light engine</td>
			<td style="width:207px;">Lumencor</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metamorph</td>
			<td style="width:207px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td>Software controlling microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol oil 518F</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">12-624-66B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

두 유전자 발현의 시공간적 규제 세포 기능에 중요한 영향을 미칠 수 성장 실현 단일 살아있는 세포에서 개별 RNA 전 사체를 시각화하기 위해 다양한 기술이 개발되었다. 최근에 설명 된 한가지 유망한 기술은 3&#39;-비 번역 영역 RBMB 표적 서열의 적어도 네 탠덤 반복을 포함하도록 설계되었다 RNA 전 사체를 검출 올리고 뉴클레오타이드 기반의 광학 탐침, 비율 적 이분자 비컨 (RBMB)를 이용한다. RBMBs 구체적으로 보완 RNA에 혼성화에 따라 밝은 형광 신호를 방출하도록 설계되어 있지만, 그렇지 않으면 침묵 상태로 유지됩니다. 이 방법에서는 프로브의 합성 사용 적색 편이, 광 안정성 허용하고, 높은 발광 유기 염료는 촬상을 위해 사용된다. 넓은 필드 형광 현미경으로 볼 때 개별 형광 명소의 설계 RNA 전 사체 결과에 여러 RBMBs의 결합. 결과적으로, 각각의 RNA 전 사체의 이동이 용이 형광 화상의 시계열을 촬영하여 실시간으로 시각화 될 수있다. 여기에서 우리는 microporation에 의해 세포로 제조 및 정제 RBMBs의 배달을 설명하고 살고 셀 단일 RNA 전 사체의 이미지를.

넓은 필드 형광 현미경 (도 2)에 의해 촬상 할 때 곧 RBMBs의 존재 HT1080 세포 microporation 따라, 조작 된 개별 RNA 전 사체들이 3&#39;-UTR에서 여러 RBMB 결합 부위를 포함 할뿐만 밝은 형광 점으로 나타나는. 적은 네 RBMB 결합 부위 개별 RNA 전 사체는 라이브 세포 이미징 될 수 있지만, 3&#39;-UTR에 결합 부위보다 RBMB, 강한 형광 신호. 신호 인해 photobleaching에 손실되기 전에 또한, 이상 각 증명서에 ?...

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

비례 생체 분자 비콘 (RBMBs)는 살아있는 세포에서 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체로 사용할 수 있습니다. 여기서 우리는 RBMBs, microporation 실시간으로 단일 RNA 전 사체의 형광 이미징에 의해 세포로 RBMBs 전달의 준비 및 정제에 대해 설명합니다.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Research

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Biology

11.7K 조회수.  University of Pennsylvania.  비례 생체 분자 비콘 (RBMBs)는 살아있는 세포에서 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체로 사용할 수 있습니다. 여기서 우리는 RBMBs, microporation 실시간으로 단일 RNA 전 사체의 형광 이미징에 의해 세포로 RBMBs 전달의 준비 및 정제에 대해 설명합니다. 

비디오: Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

연구

생물학

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 Lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

하나 나노 미터의 정확도와 형광 이미징 (피오나)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&amp;#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&amp;#8226; Signals in Single Cells

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

유전자 인코딩 된 형광 산화 질소의 응용 프로그램 (• NO) 단일 세포에서 NO • 신호의 실시간 이미징을위한 프로브의 geNOps,

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

라이브 셀의 형성 FRET 바이오 센서를 사용하여 오로라 키나아제 활성화의 실시간 모니터링

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...