이 작품은 XAC와 AFP에 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다

1. 추출을위한 자료의 작성 <ol><li> 셀의 준비 <ol><li> 실험하기 전에 최소한 하나의 일에 대한 산 처리 coverslips에 씨 조직 문화 세포. 이 두 세포 라인이 분비 단백질의 강력한 생산을 전시하고 잘 정의 된 ER을 가지고 우리는 COS-7 또는 U2OS을 사용합니다. 높은 추출 효율을 달성하기 위해, 세포 실험 당일 coverslip에 confluency 80 %를 초과 할 수 없습니다합니다. </li><li> 특정 외인성 mRNA가 조사하는 경우, 전지가 표준 transfection 프로토콜을 사용하여 관심있는 유전자를 포함하는 plasmids과 퍼 뜨리고 마치면 하루 종일 transfected 수 있습니다. 세포 그런 다음 이전에 추출 최소 18 시간의 mRNA를 표현 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 번역 억제제로 세포 치료 <ol><li> ER과 mRNAs 협회의 유지 보수에 그대로 리보솜의 효과를 테스트하려면 전지 협회를 중단 번역 억제제로 치료 될 수있다mRNA 11 리보솜의. </li><li> (4 - 메틸-2, 6 dinitroanilino) - - 같은 homoharringtonin (HHT), pactamycin, 또는 2와 같은 번역 개시의 억제제를 동시에 약혼 리보솜을 허용하면서 N-methylpropionamide (MDMP)는 성적 증명서와 연결에서 새 리보솜을 방지 번역 12-14를 완료합니다. 포유류의 세포에서 대부분의 단백질에 대한 번역 속도에 관계없이 코돈 사용 또는 mRNA의 길이 15 초당 5 아미노산이기 때문에, 30 분의 치료 27000 세포핵 (단백질에 대한 코딩하는 한 열린 독서 프레임과 메시지의 리보솜을 삭제해야합니다 ) 9,000 아미노산 가능한 한 오래. </li><li> 같은 puromycin 등 억제제는 초기 체인의 조기 배출을 촉진하므로 polysomes 12 중단. 그러나 완전히 mRNA와 puromycin - 처리 리보솜의 연결을 방해하는 등 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 같은 마그네슘 chelators는 digitonin 추출 버퍼 11 추가해야합니다. </li> &lt;리&gt;이 실험에서 세포는 200 μM의 puromycin, 5 μM의 HHT 또는 추출하기 전에 30 분을위한 제어 매체 처리됩니다. </li></ol></li><li> Digitonin 추출 버퍼의 작성. 무료 (즉 세포질, 비 ER-관련) 성적 증명서의 방해없이 ER-지역화 mRNAs를 시각화하기 위해, 우리는 선택적으로 digitonin, 3β-hydroxysterols을 우선적으로 상호 작용 스테로이드 glycoside있는 셀을 permeabilize. 낮은 농도에서 digitonin 선택적으로 &#39;leakiness&#39;16 발생, 플라즈마 막의 일부를 permeabilizes. 대조적으로, 콜레스테롤의 가난한 ER 막과 핵 봉투, 16,17 그대로 남아 있습니다. <ol><li> Digitonin (시그마 알드리치) 분말 5 % 중량 / 부피에 증류수에 용해되며,이 주식 솔루션은 작은 볼륨으로 aliquoted되어 있으며 -20 ° C.에 저장 우리의 경험에서 여러 동결 - 해동주기는 해산 digitonin의 효율성을 낮 춥니 다. </li><li> 의 주식 솔루션10X CHO 버퍼는 (1X 작업 솔루션 농도 : 115 MM KAC, 25 MM HEPES 산도 7.4, 2.5 MM MgCl 2, 2 MM EGTA 150 밀리미터 자당) RNase 무료 시약을 준비 -20 ° C.에 저장됩니다 작업 솔루션은 (1X CHO 버퍼) RNase 무료 물과 주식 솔루션을 diluting에 의해 준비가되어 있습니다, 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li></ol> 2. Digitonin 추출 <ol><li> 추출 솔루션을 준비 <ol><li> 평평한 표면과 가열 블록은 사전 가열 40 ° C 및 추출에 동안이 온도에서 유지. </li><li> RNase 무료입니다 평면 작업 표면을 형성하기 위해 가열 블록 parafilm M (Bemis 회사, 주식회사)의 새로운 조각을 물과 겹쳐로 moistened 있습니다. parafilm 시트 및 난방 블록 사이의 기포는 RNase 무료 장갑과 kimwipes (VWR)를 사용하여 밖으로 부드럽게 있습니다. </li><li> 1X CHO 버퍼는 물 목욕에 잠복기가 37 ° C로 예열합니다. </li><li> 6 잘 플레이트는 씻어하는 데 사용됩니다그리고 세포를 해결할 수 있습니다. 세 우물의 각 행은 하나 커버 슬립에 사용됩니다. 행의 처음 두 우물까지 따뜻하게 CHO 버퍼의 2 ML이 추가됩니다. 마지막으로 잘까지 고정 솔루션 2 ML은 (PBS + 4 % paraformaldehyde (전자 현미경 과학))이 추가됩니다. 세포 추출을위한 준비가 될 때까지이 트레이는 37 ° C 배양기에 저장 할 수 있습니다. </li><li> Digitonin 추출 솔루션은 단지 사용 전에 따뜻한 CHO 버퍼와 0.025 %로 주식 digitonin 솔루션을 diluting에 의해 준비가되어 있습니다. 다시 puromycin - 처리 세포에 대해 추출 버퍼가 추가로 효율적으로 리보솜 11 방해하는 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 포함해야합니다. 추출 솔루션 100 μl의 방울 추출하기 전에 즉시 parafilm 덮인 가열 블록에 게재됩니다. </li></ol></li><li> Digitonin 추출 및 세포 고정 <ol><li> 37 ° C 배양기에서 세포를 제거합니다. </li><li> 추출 과정 coverslips는 jewler의 포셉의 도움으로 조작됩니다. 과포셉은 coverslip을 선택하고 성장 매체의 세탁 할 수있는 잘 포함 된 두 번째 한 후 첫 번째와 CHO 버퍼에 떨어 뜨릴. </li><li> 신속하게 kimwipe로 coverslip의 뒷면에서 초과 버퍼를 가릴 즉시 추출 솔루션을 아래로 직면하고있는 coverslip, 셀 측을 배치합니다. </li><li> 10 초 후, 포셉으로 coverslip을 수령 즉시 세포면이 잘 포함 된 4 % paraformaldehyde 고정 버퍼에 최대 직면하고, 그것을 전송할 수 있습니다. </li><li> 상온에서 최소 15 분 동안 정착액의 예제 길러 보자. </li></ol></li><li> Unextracted 제어 셀의 작성. 이 unextracted 제어 샘플을 준비하는 것이 좋습니다 세포질에서 mRNA의 총 양을 결정합니다. <ol><li> coverslips에 성장 세포는 digitonin 추출 단계 (2.2.3)이 생략되는 경우를 제외하고 (2.2 절 참조) 위와 같이 준비가되어 있습니다. </li><li> 고정 후 취소 - 압축을 푼 세포는 PBS에 permeabilized 할 필요가 + 0.1 % 튼을X-100 실온에서 15 분에. </li></ol></li></ol> 3. 생선 착색 <ol><li> 원위치 하이브리드 화에 형광을위한 프로브를 설계 <ol><li> 관심의 mRNA의 주요 순서는 해당 RNAstructure 5.0 18와 같은 RNA 차 구조 예측 소프트웨어를 사용하여 통합되어 있습니다. mRNA의 주름은 시각적으로 주요 이차 구조 무료입니다 약 50 세포핵의 영역을 식별하기 위해 평가됩니다. </li><li> 이 지역의 역 보완는 프로브의 5 &#39;끝 (통합 DNA 기술에서 구입)에 부착 Alexa546 형광으로 합성된다. </li><li> 프로브는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 100 μm의 주식 농도에 RNase 무료 물을 희석되어 </li></ol></li><li> 생선 프로브로 얼룩 <ol><li> digitonin - 압축을 푼 세포가 더 permeabilization을 필요로하지 않지만, 0.1 %의 2 ML과 함께 고정 된 샘플을 치료합니다 트리톤 X-100에 희석PBS는 생선 착색하기 전에 상온에서 15 분 동안 배경 신호를 감소하는 데 도움이됩니다. </li><li> 슬라이드 그런 다음 잔여 paraformaldehyde 또는 트라이 튼 X-100을 제거하는 PBS로 두 번 세척하고 있습니다. </li><li> 세포는 다음 1X 나트륨 구연산 버퍼 (150 MM NaCl, 15 MM 나트륨 시트르산) 25 % 60 % 포름 아미드로 두 번 세척하고 있습니다. 일반적으로, 길이 50​​-60 세포핵 구체적인 생선 프로브에 대해 60 %의 포름 아미드가 사용되지만, oligo (DT) 생선 프로브와 폴리 (A) mRNA의 착색을 위해 포름 아미드의 수준은 25 % 아래로 감소된다. </li><li> 착색 챔버를 준비하려면, 150mm 페트리 접시의 바닥이 물로 덮여 있으며, parafilm의 한 부분이 물에 떠내려 수 있습니다. 물은 따라서 parafilm는 접시​​의 바닥을 준수 할 수 있도록, 요리를 통해 돌려 제거됩니다. 기포를 수동으로 kimwipes으로 제거됩니다. </li><li> 각 coverslip을 물들 일하기 위해서는 파에 관심 물고기 프로브를 포함하는 하이브리드 솔루션의 100 μl 드롭 피펫착색 챔버에 afilm. 재고 생선 프로브의 작동 농도에 하이브 리다이 제이션 버퍼 25 % 60 % 포름 아미드 (1X SSC, 100 MG / ML dextran 황산염, 1 MG / ML 효모 tRNA, 5mM vanadyl riboside 단지, 25~60% 포름 아미드)로 희석합니다 0.2 μM. 포름 아미드의 양이 사용되는 특정 프로브에 대해 최적화되어 있으며 SSC 세척 버퍼에 같은 농도 (단계 3.3.3 참조)에 존재해야합니다. </li><li> coverslip이 같은 조직 문화 인큐베이터로 humidified 챔버에 37 ° C에서 착색 챔버에서 생선 솔루션에 셀 사이드 얼굴을 아래로 배치하고 5-24 시간에 대한 incubated 수 있습니다. </li></ol></li><li> 스테인드 샘플을 세정 장착 <ol><li> RNase 무료 세탁 영역을 준비하려면 이러한 실험실 벤치와 같은 수준의 평평한 표면에 parafilm의 스트립은 바칠 것이다. parafilm는 수준의 표면 서부 유럽 표준시, 평면인지 확인하려면, 상단에있는 parafilm을 배치하고 수동 kimwipes과 아무런 기포를 제거합니다. </li><li> 착색 챔버는보육에서 제거 및 평면 수준의 표면에 위치. coverslips는 다음 각 coverslip의 가장자리 근처에 물고기 세척 버퍼의 약 500 μl를 pipetting하여 떠내려 수 있습니다. 솔루션은 모세관 작용을 통해 coverslip과 parafilm 인 사이에 그려집니다. </li><li> 각 coverslip를 들어, 세탁 버퍼 1 ML (1X SCC 25-60%의 포름 아미드로, 3.3.3 단계를 참조하십시오)은 세탁기 지역 parafilm (단계 3.4.1 참조)에 pipetted 있습니다. </li><li> 집게를 사용하여 coverslips는 착색 챔버에서 제거됩니다 및 각 세척 버퍼의 드롭에 위치하며 5 분 동안 실온에서 incubated. 세척 과정은 3 번 반복됩니다. </li><li> 유리 슬라이드는 70 % 에탄올로 세척하고, kimwipes로 건조됩니다. </li><li> 각 coverslip를 들어, 마운트 솔루션 (DAPI Fluoromount G, 남부 생명 공학)의 25 μl은 슬라이드에 pipetted 있습니다. 이 솔루션 4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI), 얼룩의 DNA를 포함하고 핵의 시각화를 허용합니다. </li><li> UsiNG 포셉 및 kimwipes는 coverslip의 뒷면은 건조하고 초과 물고기 세척 버퍼는 샘플을 건조하지 않고 해제 blotted 있습니다. 각 coverslip 그런 다음 설치 솔루션의 드롭에, 아래에 직면 세포 측에 저장됩니다. </li><li> 마운트 샘플 그런 다음 표시되며, 4시에 저장 할 수 있습니다 ° C. </li></ol></li></ol> 4. 이미징 및 정량화 <ol><li> 영상 <ol><li> epifluorescence 현미경은 이미지 생선 착색 따라 셀을하는 데 사용됩니다. transfected 세포는 적절한 채널에 밝은 형광 신호로 untransfected 세포에서 차별화 할 수 있습니다. 이상적으로, 각 인수 필드는 또한 정량화의 배경 형광을 결정하는 데 사용되는 untransfected 셀을 포함합니다. </li><li> 를 들어 생선과 DAPI 채널의 각 필드 이미지가 획득됩니다. 세포 단백질 마커와 공동 묻은 경우 또한, immunofluorescence 채널의 이미지도 취득하고 있습니다. digitonin 추출도 사용할 수 있습니다ER-바운드 리보솜과 단백질 11 시각화합니다. </li><li> 분야 사이의 형광 강도를 비교할 수 있도록하려면 각 채널에 대한 노출 시간은 실험의 각 집합에 대해 일정하게 유지해야합니다. </li><li> 다시 다른 coverslips에 세포 사이의 형광 강도를 비교할 수 있도록, 물고기 신호의 epiluminescence 강도 나 부식에 매일 변경 이미징 하나의 좌석에 coverslips의 모든이 최소화되어야합니다. </li></ol></li><li> 정량화. ER에 지역화 mRNA의 양을 정량화하기 위해, 우리는 니콘 NIS 요소 소프트웨어를 사용합니다. 그러나 이러한 ImageJ와 같은 다른 이미지 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. <ol><li> 니콘 NIS 요소 이미지 분석 도구 사용, 셀 주변 및 핵은 관심 분야 (ROIs)의 별도의 지역으로 설명되어 있습니다. </li><li> 각 투자 수익 (ROI), 형광 강도 (I T 전체 셀 강도 및 내 용 N에 대한핵 강도)과 지역 (A T 및 A N) 기록하고 Excel 스프레드 시트에 수출하고 있습니다. </li><li> 각 이미지를 들어, 배경 형광 강도 (I B)가 아닌 transfected 세포의 강도를 기록에 의해 결정됩니다. 폴리 (A) mRNA 수준을 분석하는 경우, 셀 - 무료 지역이 선택됩니다. </li><li> 총 ER의 양 (추출 셀) 또는 세포질은 (unextracted 세포에서) 형광이 공식에 의해 계산됩니다 : [A T] [I T - I B] - [A N] [I N - I B] </li><li> 핵 염색 강도도 계산 및 다양한 트리트먼트를 사이에 내부 통제으로 사용할 수 있습니다. 핵이 digitonin 치료 17 ribosome 파괴 11에 의해 영향을받지 않기 때문에 핵 mRNA의 양이 트리트먼트를 각각의 사이에 일정하게 유지해야합니다. 다음 수식을 사용 핵 형광을 계​​산하려면 : [A N] [I N - IB] </li><li> ER 타겟이 세포질 mRNA의 비율은 30-40 unextracted 세포 (다시 4.2.4 참조)의 평균 세포질 형광으로 나눈 30-40 추출한 세포의 평균 ER의 형광을 (4.2.4 참조) 복용에 의해 계산 될 수있다 . 이 추출 unextracted 세포가 준비 묻은와 병렬로 이미징하는 것이 중요합니다. </li></ol></li></ol>

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다양한 subcellular 사이트에 mRNAs의 현지화는 mRNA의 현지화 단백질과 성적의 상호 작용을 통해 subcellular의 로컬 요구 사항에 대한 그들의 최종 목적지 단백질의 적절한 정렬을위한, 그리고 유전자 표현의 미세 조정에 중요한 널리 현상입니다 지역 19,20. 검정을 사용하면 여기에 설명 된, 우리는 분비 단백질을 인코딩 mRNAs는 리보솜 또는 번역의 유무에 ER에서 유지 될 수 ?...

eukaryotes에서 mRNA 인코딩 번역 3,4 동안 리보솜과 translocons 사이의 직접 상호 작용을 통해 분비와 막 단백질은 공동 translationally 신호 인식 입자 1,2에 의해 응급실로 타겟팅 할 수 있으며, ER에서 유지 관리 할 수 있습니다. 그러나, mRNAs가 타겟팅하고 리보솜 또는 번역 중의 ER 독립을 유지 할 수 있는지 여부 것은 매우 최근까지 불분명했다. 이전 연구는 세포 분획 기법을 사용하여 ER로 번역 독립적 인 mRNA 협회가 있는지 해결하기 위해 시도했습니다. 거친 화학 조건이 잠재적으로 민감한 mRNA-ER 협회가 바뀐다 ER 파생 소포에서 리보솜을 해제해야 되었기 때문에,이 연구는 5-8에 대한 증거를 제공하고, 결정적이었고 9,10에 대한 ribosomal 독립적 인 mRNA의 응급실로 고정 . 이러한 문제를 회피하기 위해 우리는 proto을 개발했습니다콜 분리 및 이미지 ER-바운드 mRNAs를합니다. 이 절차를 동시에 ER 형태와 관련 분자의 모든을 유지하면서 효과적으로 세포 (비 ER-바운드 mRNAs 포함)의 모든 세포질 내용을 제거 가벼운 추출 치료를하는 것입니다. 이 프로토콜 사용 우리는 mRNAs의 일부 타겟팅하고 독립적으로 리보솜 또는 번역 (11)의 ER에 유지하는 증명하고있다.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

eukaryotes에서 분비와 막 단백질이 소포체 endoplasmic (ER)의 표면에 지역화 아르 인코딩 메신저 RNAs (mRNAs)의 대부분. 그러나 이러한 mRNAs의 시각화가 도전 할 수 있습니다. 이것은 mRNA의 일부만이 ER-관련 될 때 특히 사실이다이 세포 기관과의 배포가 아닌 타겟 (예 : &quot;무료&quot;) 성적 증명서에 의해 가려합니다. 동시에 ER의 무결성을 유지하면서 ER-관련 mRNAs을 모니터링하기 위해, 우리는 세포가 선택적으로 플라즈마 멤브레인을 permeabilizes digitonin 추출 솔루션에 대한 짧은 노출로 치료되는 방법을 개발하고, 따라서 세포질 내용을 제거했습니다 . 이 방법은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광와 결합 될 때, 하나는 분명 형광 현미경으로 ER-바운드 mRNAs를 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 대량 폴리 (A) 성적 증명서 또는 특정 mRNAs 중 하나에 ER-협회의 정도를 평가 할 수 있습니다심지어 정량. 이 과정에서, 하나는 mRNA-ER 상호 작용의 특성을 조사하기 위해이 분석을 사용할 수 있습니다.

ER-연결되어있는 mRNA의 비율, 태반 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (ALPP) 또는 시토크롬 P450-8B1이 (CYP8B1) 또는 digitonin로 추출 후 수정, 또는 직접 수정되었습니다를 포함 plasmids와 transfected 된 COS-7 세포를 확인하려면 (그림 1 참조, 비교 &quot;Ctrl 키를 추출&quot;을 &quot;Ctrl 키를 Unextracted&quot;). 비 핵 형광은 샘플 및 ER-관련 mRNA의 분율은 (그림 2) 계산에 모두 정량화되...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

여기 포유류의 조직 배양 세포에서 endoplasmic 소포체 - 관련 mRNAs을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 형광등에 이어 세포질 내용을 제거 할 digitonin과 플라즈마 막의 선택적 permeabilization을 포함<em&gt; 현장에서</em어느 대량 폴리 (A) mRNA 또는 특정 기록을 검색 할 수&gt; 하이브리드.

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

visualization-endoplasmic-reticulum-localized-mrnas-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K 조회수.  University of Toronto. 여기 포유류의 조직 배양 세포에서 endoplasmic 소포체 - 관련 mRNAs을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 형광등에 이어 세포질 내용을 제거 할 digitonin과 플라즈마 막의 선택적 permeabilization을 포함 현장에서 하이브리드.

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Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

포유 동물 세포를 Trypsinizing 및 Subculturing

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

연구

생물학

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

자기편 및 비 점착 성의 포유 동물 세포의 현장 Subcellular 분별 (분리)에서

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized near the mitochondria. Support for this possibility is derived from recent studies, in which many mRNAs encoding mitochondrial proteins were shown to be localized to the mitochondria vicinity. Together with earlier demonstrations of ribosomes&#8217; association with the outer membrane, these results suggest a localized translation process. Such localized translation may improve import efficiency, provide unique regulation sites and minimize cases of ectopic expression. Diverse methods have been used to characterize the factors and elements that mediate localized translation. Standard among these is subcellular fractionation by differential centrifugation. This protocol has the advantage of isolation of mRNAs, ribosomes and proteins in a single procedure. These can then be characterized by various molecular and biochemical methods. Furthermore, transcriptomics and proteomics methods can be applied to the resulting material, thereby allow genome-wide insights. The utilization of yeast as a model organism for such studies has the advantages of speed, costs and simplicity. Furthermore, the advanced genetic tools and available deletion strains facilitate verification of candidate factors.

Many mRNAs encoding mitochondrial proteins are associated with the mitochondria outer membrane. We describe a subcellular fractionation procedure aimed at isolation of yeast mitochondria with its associated mRNAs and ribosomes. This protocol can be applied to cells grown under diverse conditions&#160;in order to reveal mechanisms of mRNA localization and localized translation near the mitochondria.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...