이 작품은 국립 보건원 (ES07408 및 EB00208)에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. ECIS / 택시 전극 준비 <ol><li> ECIS / 택시 전극 배열 (슬라이드 당 8 방으로 구성된)의 금색 표면이 먼저 무균 조건 하에서 실온에서 15 분 대한 탈이온수 (DH 2 O)의 멸균 10 밀리미터 시스테인과 사전 치료에 의해 ​​안정화된다. </li><li> 각 전극 챔버에서 시스테인 솔루션을 대기음, 멸균 DH 2 O로 3 회 씻어, 그리고 완전한 매체 250 μl (RPMI 1640 10 % FBS, 25 밀리미터 HEPES 완충액)으로 바꿉니다. </li><li> 전극 검사를 수행하기 위해 악기 배열 홀더의 핀에 연락을 전극 배열을 연결합니다. </li><li> 제대로 연결되어 챔버 스가 컴퓨터 화면에 녹색으로 강조 표시됩니다. 챔버 스는 빨간색으로 강조되어있다면, 그들은 연결되어 있지 않으며 전극은 모든 챔버에 대한 연락처를 설정하는 배열의 홀더에 다시 배치해야합니다. </li><li> 모든 챔버가 연결되면, 억제하기 위해 소프트웨어 컨트롤러에 &#39;확인&#39;버튼을 클릭각 챔버의 초기 저항 및 커패시턴스 값을 내꺼야. 저항 값은 1600 사이 및 2000 ohms 있어야하고, 커패시턴스 값은 8 챔버 어레이 5 사이와 6 nanofarads 있어​​야합니다. 실로이 허용치 안에 있지 않다면, 각각의 챔버는 데이터를 수집하는 데 사용해서는 안됩니다. </li><li> 개별 아가로 오스의 챔버를 준비하는 배열 자의 전극 연결을 끊습니다. 챔버에서 미디어를 기음과 멸균 DH 2 O를 사용하여 각 챔버에게 3 회 ​​씻어 </li></ol> 2. 아가로 오스 챔버 준비 <ol><li> 멸균 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브에서 측정 0.03 Seakem GTG 아가로 오스의 G와 1 ML 멸균 PBS를 추가합니다. 느슨한 튜브 뚜껑을 교체하고, 2 분 액체주기 위해 압력솥에서 아가로 오스를 (전자 레인지에 녹는이 분석을 위해 효과적이지 않을 것입니다) 용융. 이 짧은 시간은 원뿔 튜브를 용융하지 않습니다. (예 : Dictyostelium의 discoideum) 0.5 %, 문화 혈청 필요하지 않습니다 덜 까다로운 세포에 대한아가로 오스는 적절한 매체를 만들어 전자 레인지에 녹인 수 있습니다. 전자 레인지에 녹인 경우가 변성되므로 압력솥은 혈청이 필요 세포가 필요합니다. </li><li> 물 목욕으로 예열 완료 RPMI 매체의 5 ML 추가 (55 ° -60 ° C)에 직접적으로 뜨거운 아가로 오스로, 0.5 % 아가로 오스와 pipet 최대의 최종 농도로 아래로 부드럽게 섞는다하기. </li><li> 각 챔버로 녹인 아가로 오스 매체 Pipet 300 μl는 ECIS / 택시 배열 덮개를 교체하고 실온에서 젤 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스의 겔화을 평가하기 위해 15 ML 튜브의 뚜껑에 아가로 오스 남은 Pipet. 이 과잉 아가로 오스는 부분 4도 사용됩니다 : 아가로 오스로 우물을 절단. </li></ol> 3. 그럼 절삭 공구를 건설하고 정맥을 선명하게 <ol><li> , 64분의 5 &#39;비트. 느린 속도 훈련과 각 정맥 개구부의 드릴 비트의 팁을 회전을 사용하는 드릴 비트는 각 정맥 조합의 전체 내부 가장자리를 깎는 특정 만드는 두 개의 14 게이지 뭉툭한 끝 캐뉼러를 선명하게날카로운 커팅 에지 (그림 4A)를 형성 ening. </li><li> 드릴 프레스의 비트 1 &quot;X 2&quot;X ¼ &quot;64분의 5와 플렉시 글라스 (그림 4B-D) &#39;을 통해 구멍을 드릴 다운합니다. 이는 각 플렉시 글라스 구멍을 통해 동등한 거리를 protrudes 있도록 각 둘레에 14 게이지 정맥을 삽입합니다. </li></ol> 4. 아가로 오스로 웰스를 절단 <ol><li> 가볍게 팁을 불타는하여 14 게이지 캐뉼러를 소독. 이전 ECIS 챔버에 우물을 절단하기 캐뉼러는 실내 온도에 냉각 허용하거나, 15 ML 튜브의 뚜껑에 아가로 오스를 만지고하여 캐뉼러 진정해. 정맥의 온도가 너무 높으면 챔버 우물이 절단되면서, 아가로 오스는 우물이 결함 및 결함 렌더링, 용융 것입니다. </li><li> 각 챔버의 대상 전극 (그림 2C 및 5)을 둘러싼 두 골드 도트 위에 정맥 쌍을 맞춥니다. 정맥 사이의 부드러운 접촉시 중지, 모든 수평 움직임없이 정맥 세로를 삽입전극 표면. 조심스럽게 모든 수평 움직임없이 다시 정맥을 제거하십시오. 그라디언트에 반대에 대한 추가 우물의 위치는 정맥의 지그의 재구성과 함께도 가능합니다. </li><li> 부드럽게 아가로 오스 폐기물을 잡으면 진공 트랩으로 낮은 진공 압력에 연결된 멸균 9 &quot;파스퇴르 피펫을 사용하여, 정맥으로 남아 아가로 오스 플러그를 기음. </li><li> 아가로 오스를 포화 위해 2 분 동안, 37 각 챔버의 표면 ° C로 완벽한 RPMI 미디어 300 μl를 추가한 다음 부드럽게 아가로 오스를 방해하지 않고 표면과 우물에서 미디어를 기음. </li></ol> 5. 웰스로드 <ol><li> 각도 7 μl의 볼륨을 들고이 가능합니다. 각 침실에 잘하려면, 셀 서스펜션 7 μl를 추가합니다. Jurkat T 세포의 경우, 2 개의 x10 7 셀 / ML을 사용합니다. 이러한 세포는 200 혈청 부족 불완전 RPMI로 희석 NG / ML SDF-1α, 7 μl에 응답할 것입니다. 부정적인 cont로 혼자 완벽한 미디어를 사용rol. </li><li> 우물이로드되고 나면, 모든 우물을 중단하고 적절하게 가득 차 있었다되도록 거꾸로 현미경과 함께 배열의 각 챔버를 볼 수 있습니다. 세포가 잘의 경계의 범위 내에서에 있어야합니다. 그들이 우물에 모두 볼 수있다, 또는 셀 아니라 테두리 넘어서 퍼져있다면 큰 차이가 아가로 오스 아래 형성 하였다. 데이터가 안정적으로 그 챔버에서 해석할 수 없으므로, 부적절하게 설정 우물을 적어 둡니다. </li></ol> 6. 데이터 수집 <ol><li> 배열 홀더에 전극을 배치하고 소유자의 용수철 포고 핀에 전극 배열에 금색 패드를 다시 연결하고 &quot;설정&quot;을 클릭합니다. 제대로 연결되어있는 우물은 녹색으로 강조 표시됩니다. 우물 빨간색으로있다면, 그들은 연결되어 있지 않으며 전극이 배열 보유자로 재지정해야합니다. </li><li> 배열 구성을 표시하는 소프트웨어 패널의 드롭 다운 메뉴에서 &quot;8WE1&quot;을 (8 아니라 한 전극)을 선택합니다. </li><li> 소프트웨어 contr에서 &quot;확인&quot;을 선택각도에 대한 초기 저항 및 정전 용량 값을 결정하는 마셨다 패널. 커패시턴스 값이 5와 6 사이 nanofarads이어야하는 동안 저항 값은, 1600 사이 및 2000 ohms 있어야합니다. </li><li> 여러 주파수에서 저항을 측정하는 여러 주파수를 선택합니다. 주파수를 사용자 정의하거나 권장 주파수의 집합을 사용하는 선택이있다. 표준 다중 주파수 인수 설정은 8 우물 / 분 속도로 11 미리 설정된 주파수 (52.5, 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000, 8,000, 16,000, 32,000 및 64,000 Hz에서)에서 데이터를 캡처. 측정 사이의 시간 간격도 사용자 정의할 수 있습니다. 여러 주파수 데이터를 수집하는 것은 정전 용량, 임피던스, 그리고 저항의 분석을 허용합니다. 4,000 Hz에서에서 저항 값을 수집하는 것은 포유 동물 세포 chemotaxis 연구를 위해 일반적으로 충분하지만, 추가 주파수가 다른 문맥 12,13에 정보를 제공할 수 있습니다. </li><li> 총 실험 기간은 오른손에 설정할 수 있습니다패널이나 실험은 세포가 전극에 도착 지표 저항을 제작하시면 &quot;Finish&quot;를 클릭하여 수동으로 중지 할 수 있습니다. 세포가 전극에 도달하는 데 걸린 시간은 사용된 전지 종류에 따라 다릅니다. </li><li> 데이터 수집을 시작하려면 &#39;시작&#39;을 클릭하십시오. </li></ol> 7. 데이터 관리 <ol><li> 데이터를 Excel로 내보낼 수 있지만, ECISθ 시스템을 함께 ECIS 1600R 소프트웨어는 ECIS / 택시 데이터를 분석하기위한 가장 효율적인 방법입니다. </li><li> 소프트웨어 데이터 분석 도구 막대가 라디오 버튼 Z, R 및 C. 이들은 각각 임피던스, 저항 또는 커패시턴스는, X 축 (경과 시간)에 대한 수직 축에 꾸몄다 여부를 확인 포함되어 있습니다. </li><li> ECIS / 택시 데이터를 가장 효율적으로 4,000 Hz에서에서 시간에 따른 저항으로 표시됩니다. 신속한 저항의 변동, 또는 microtransients (그림 1) 전극 위에 세포 운동의 증거입니다. O를 컴파일,R의 binning는 데이터 포인트가 있으므로 모든 포인트가 그래프로 나타납니다 것으로, ECIS / 택시 권장하지 않습니다 그것이 데이터의 평균 microtransients을 때문에. </li><li> 그래프가 ECIS1600R 소프트웨어로 만든되면, 그것은 파일 메뉴에서 &quot;수출 그래프&quot;를 선택하고. TIF 또는. JPG 파일로 저장하여 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 셀룰러 chemotaxis은 4,000 Hz에서에서 저항의 증가로 표시됩니다. 대상 전극에 대한 세포의 도착도 OPP 동부 표준시에 설명된대로 microtransients, 또는 micromotion라는 저항의 급격한 변동의 모양으로 표시됩니다. 알., 2009 (그림 1) 14. 부정적인 결과는 일관된로 표시하거나, 그림 1에 빨간색으로 볼 수 4,000 Hz에서에서 저항이 약간 감소,있다. microtransients의 부재 또한 전극의 세포 운동의 부재의 표시이다. 저항의 증가는 직접적으로 프로입니다전극 10 건너 숫자 셀 portional. G 단백질 결합 수용체를 방해하는 것으로 알려져 단클론 항체의 추가는 chemoattractant에 대한 특정 또는 독소가 chemotaxis 11을 차단할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" /> 1 그림. SDF1α. 인간의 Jurkat T 세포 (2.0x10 6 세포 / ml) 쇼핑에 대한 반응으로 인간의 Jurkat T 세포의 Chemotaxis은 SDF-1α의 구배에 노출되었다 부정적 컨트롤이나 RPMI 1640 (농도 펴기 100 NG / ML부터). 4,000 Hz에서에서 표준 저항 그래프되었다. 아무런 움직임은 RPMI 1640에 대한 노출로 본적이있는 동안 인간의 Jurkat T 세포는 같은 저항 및 microtransients의 증가에 의해 입증, SDF-1α에 대한 응답으로 옮겼습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" /> 그림 2. ECIS / 택시 위로보기 withou를 전극t 아가로 오스. 각 ECIS / 택시 전극은 8 각 방으로 구성되어 있습니다. 각 챔버 대형 전극 () 공유 및 개인 대상 전극 (B)가 포함되어 있습니다. 각 챔버는 또한 캐뉼러와 아가로 오스의 우물을 절단했을 때 가이드로 사용되는이 금색 동그라미를 (다)이 있습니다. 황금 사각형 (D)는 전극에 교류 전류를 적용하기 위해 포고 핀에 연결 접촉 패드입니다. 개별 대상 전극은 큰 카운터 전극 (E)와 각 회로에 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" /> 그림 3. 두 웰스는 각 아가로 오스-채워진 챔버로 침입한다. chemoattractant 잘 하나 추가하면 그것이 잘 chemoattractant에 가장 가까운 chemoattract 가장 높은 농도로, 아가로 오스의 그라디언트를 만들 diffuses. 세포 chemoattractant 높은 농도쪽으로 아가로 오스 아래 여행하고 대상 전극을 통해 전달할 수 있습니다. 으로세포가 대상 전극을 건너, 저항의 증가는 ECIS 1600R 소프트웨어에 의해 기록됩니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" /> 4 그림. 플렉시 글라스 둘이 14 게이지 캐뉼러의 삽입. ) 64분의 5 &quot;드릴 비트가 정맥 팁을 선명하게하는 데 사용됩니다. B) 두 개의 구멍이 배치 장면에 따라 14 게이지 캐뉼러을 수용하기 위해 플렉시 글라스로 뚫고는되어야한다. C)에 구멍을 보장하기 위해 드릴 프레스를 사용하여 수직 위치 pleixglass 표면. D)에 두 날카롭게 캐뉼러는 ¼ &quot;플렉시 글라스, 간격 2mm (안쪽 가장자리에서 측정)를 통해 삽입됩니다. 이 날카롭게 캐뉼러 신중 우물를 잘라 아가로 오스에 삽입됩니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" /> 그림 5. ECIS / 택시 챔버의 황금 점 캐뉼러를 정렬. 우물을 잘라내려면 날카롭게 캐뉼러가 있어야합니다ECIS / 택시 챔버의 바닥에 대상 전극 측면을 노릴 골드 도트로 정렬됩니다. 캐뉼러은 어떤 수평 움직임없이 수직으로 삽입하고, 같은 방식으로 제거해야합니다.

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데이비드 Knecht와 마이클 Lynes은 응용 생물 물리학, 주식 회사로 코네티컷의 대학에 의해 라이센스가되어 ECIS / 택시 기술에 대한 발행된 특허를 가지고

ECIS / 택시 분석의 소설 특성은 세포의 chemoattractant에 반응으로 실시간 데이터 수집을 자동화하는 기능을 포함합니다. 이 기술의 가장 일반적인 응용 프로그램이 개별 chemotactic의 그라디언트로 세포 반응을 측정하거나, chemotaxis의 agonists 및 antagonists의 혼합물로 구성되어 그라디언트로하는 반면, ECIS / 택시 접근도에서도 상당히 도움이 될 수있는 이러한 구성으로 유사 의무가있다 세포 반응 평가. ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> 응용 생물 물리학 </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS 전극 배열 </td><td> 응용 생물 물리학 </td><td> 8W Chemotaxis </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG 아가로 오스 </td><td> BioWhittaker 분자 응용 </td><td> 50,070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone 태아 소 혈청 </td><td> 써모 과학 </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> PEnicillin / 스트렙토 마이신 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 1,670,049 </td><td> 페니실린 5,000 IU / ML, 스트렙토 마이신 5 밀리그램 / ML </td></tr><tr><td> HEPES 버퍼 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 1,688,449 </td><td> 1M 용액, 세포 배양 등급 </td></tr><tr><td> 14 게이지 스테인레스 스틸 정맥 (2) 4 인치 </td><td> 일반 실험실 공급 </td><td> 5-8365-1 </td><td> 무딘 지점 </td></tr></tbody></table>

measurement of cellular chemotaxis with ecis/taxis

외부 자극에 대한 반응으로 세포 운동은 상처 치유, 염증 및 감염에 대한 응답을 포함하여 많은 세포 과정에 필수적입니다. chemotaxis를 측정하기위한 일반적인 방법은 세포 chemoattractant는 다공성 막에 의해 분리되는 Boyden 챔버 분석이다. 세포 chemoattractant 향해 막 통해 마이 그 레이션함으로써, 그들은 멤브레인, 또는 기본 미디어에 가을의 아래쪽을 준수하고, 이후 물들일 시각 1 포함됩니다. 이 방법에서는 세포 조직이 발견 그라디언트의 가난한 표현이 될 것으로 생각됩니다 가파른 및 과도 chemoattractant 그라데이션에 노출됩니다. 또 다른 분석 시스템, 세 이하 아가로 오스 chemotaxis 분석, 3, 아가로 오스 층 아래에 형성 얇게 수성 영화에서 고체 기판에 걸쳐 네 대책 전지 운동. 아가로 오스에서 개발하고 기울기는 얕은이며 애플 리케이션이 될 것으로 생각된다자연스럽게 그라디언트를 발생의 표현을 ropriate. Chemotaxis은 여행 거리 미세한 영상으로 평가할 수 있습니다. Boyden 챔버 분석과 세 이하 아가로 오스 분석 모두는 일반적으로 끝점 assays로 구성됩니다. 자동 ECIS / 택시 시스템은 전기 세포 기질 임피던스 감지 (ECIS) 5, 6 세 이하 아가로 오스의 접근 방식을 결합한 제품입니다. 본 분석에서는 대상 전극은 8 실 각에 위치해 있습니다. 대규모 반대 전극은 8 실 (그림 2) 각을 통해 실행됩니다. 각 챔버는 아가로 오스 가득한 두 개의 작은 우물이 대상 전극의 양쪽에있는 아가로 오스의 상처가있다. 다른 diffusing chemoattractant의 소스 (그림 3)을 보유하면서 하나가 아니라, 테스트 셀 인구들로 가득 차 있습니다. 시스템을 통해 전달되는 전류는 세포가 대상 전극을 통해 전달로 발생하는 저항의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 표적 세포는 electrod전자 시스템 6 저항을 증가시킵니다. 또한, 저항의 급속한 변화는 전극 표면과 세포의 상호 작용의 변화를 나타내며 지속적인 세포의 형태 변화는 지표. ECIS / 택시 시스템은 장시간 동안 실시간으로 세포 인구의 움직임을 측정할뿐만 아니라 대상 전극에 단일 세포의 도래를 감지 정도를 구분하실 수 있습니다. Dictyostelium discoidium는 엽산 그라디언트 7, 8 및 chemotactic 응답을 정확하게 ECIS / 택시 9 측정할 수의 면전에서 마이 그 레이션하는 것으로 알려져 있습니다. 백혈구 chemotaxis은 SDF1α 및 chemotaxis의 antagonists에 대한 응답도 ECIS / 택시 10, 11로 측정되었습니다. SDF1α에 백혈구 응답의 ​​예제는 그림 1에 표시됩니다.

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Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

ECIS / 택시 시스템은 세포 chemotaxis를 측정하는 자동화된 실시간 분석이다. 본 분석에서는 세포 표적 전극에 도착하는 아가로 오스의 레이어 아래로 이동합니다. 세포 운동은 AC 전류를 0으로 저항의 발병에 의해 측정됩니다.

ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.7K 조회수.  University of Connecticut. ECIS / 택시 시스템은 세포 chemotaxis를 측정하는 자동화된 실시간 분석이다. 본 분석에서는 세포 표적 전극에 도착하는 아가로 오스의 레이어 아래로 이동합니다. 세포 운동은 AC 전류를 0으로 저항의 발병에 의해 측정됩니다.

비디오: Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Microfluidics를 사용하여 세균 Chemotaxis의 연구 - 인터뷰

연구

생물학

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades. Today, such pipettes are made from glass capillaries using a programmable puller. Such instruments heat the capillary using either a metal filament or a laser and draw out the glass using gravity, a motor or both. Pipettes for patch-clamp recording are formed using only heat and gravity, while sharp electrodes for intracellular recording use a combination of heat, gravity, and a motor. The procedure used to make intracellular recording pipettes is similar to that used to make injection needles for a variety of applications, including cRNA injection into Xenopus oocytes. In general, capillary glass &lt;1.2 mm in diameter is used to make pipettes for patch clamp recording, while narrower glass is used for intracellular recording (outer diameter = 1.0 mm). For each tool, the puller is programmed slightly differently. This video shows how to make both kinds of recording pipettes using pre-established puller programs.

This video shows how to use a programmable puller to make patch pipettes and sharp electrodes for electrophysiology. The same procedure can be used to make a variety of glass tools, including injection needles.

프로그래밍 풀러와 패치 - pipettes와 샤프 전극을 만들기

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

의 수명 측정<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...