우리는 초기 프로토콜을 속에에 레 사노의 공헌을 인정합니다. Ad&#39;A. 유전 및 유전자 치료에 의자를 부자 어린이 (JFC)의 보석상을 보유하고 있습니다. 이 작품은 NIH 보조금 GM60905, DK52025 및 CA021764, 그리고 미국의 레바논 시리아 관련 자선 단체 (ALSAC)에 의해 부분적으로 재정 지원을했습니다.

<html> 다음 프로토콜은 마우스 뇌에서 MAMs과 보석의 절연 및 정화를위한 것입니다 솔루션은 미토콘드리아, MAMs와 보석의 절연이 필요 분류 원유 mitochondrial 준비를 얻기 위해 : 솔루션 A : 0.32 M의 자당, 1 MM NaHCO 3, 1 MM MgCl 2, 0.5 MM CaCl 2 + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가) 솔루션 B : 0.32 M의 자당, 1 MM NaHCO 3 + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가) MAMs 절연 : 절연 매체 : 250 MM 마니 톨, 5 밀리미터 HEPES의 산도 7.4, 0.5 MM EGTA, 0.1 % BSA 그라디언트 버퍼 : 225 MM 마니 톨, 25 밀리미터 HEPES의 산도 7.5, 1 ㎜ EGTA, 0.1 % BSA (최종 농도) 보석 절연 : 내용 &quot;&gt; GEM 추출 버퍼 : 25 MM HEPES 산도 7.5, 0.15 M NaCl, 1 % 트리톤 X-100 + 프로테아제 저해제 (필요한 경우, 신선한 추가) GEM Solubilising 버퍼 : 50 MM 트리스 - HCL, pH를 8.8, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가). 1. 첫 번째 단계 Subcellular 분류 : 핵의 제거, Unlysed 세포와 세포 파편 <ol><li> CO 2 챔버에 마우스를 안락사시켜야. </li><li> 즉시 뇌를 제거 절반, 얼음에서 2 ML 튜브에 넣고 무게. </li></ol> 참고 : 전체 절차를 통해 뇌 절반은 별도의 유지. 다음은 하나의 뇌의 절반의 치료에 적용됩니다. <ol start="3"><li> 한 ML 차가운 솔루션 A.이 큰 통관 유봉의 15 총 스트로크와 균질화가 포함 된 사전 차가운 두 ML 유리 다운스 호 모지 조직 분쇄기의 장소 반 뇌. </li><li> 얼음에 15 ML 팔콘 튜브에 전송하고 희석10 권 w / V, 예를 들어 0.225 g에 2.25 ML까지 homogenates. </li><li> 4에 10 분에 1,400 XG에서 샘플을 원심 분리기 ° C. </li><li> 조심스럽게 얼음에 표면에 뜨는과 30 ML 둥근 바닥 유리 원심 분리기 튜브로 전송을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오. </li><li> 솔루션 같은 10 권의 펠렛을 Resuspend. 작은 통관 유봉, 한 번에 1 ML의 3-6 뇌졸중과 같은 그라인더에 균질화. </li><li> 4에 10 분 ° C.에 710 XG에 신선한 15 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기로 전송 핵 및 세포 파편의 펠렛에있는이 결과. </li><li> 주의 단계 1.6에서 저장 한 표면에 뜨는있는 표면에 뜨는과 수영장을 제거합니다. </li></ol> 2. 두 번째 단계 : 조잡 미토콘드리아 절연 <ol><li> 4에 10 분에 13,800 XG에서 supernatants을 원심 분리기 ° C. </li><li> 얼음에 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브를 표면에 뜨는 전송 </li><li> Resuspend 펠릿 10 권 솔루션에. 작은 통관 유봉, 한 번에 1 ML의 3-6 뇌졸중과 같은 그라인더에 균질화. </li><li> 단계 2.1로 원심 분리기. </li><li> 단계 2.2-2.4를 반복합니다. </li><li> 그 결과 펠렛은 풍부한 mitochondrial 분수입니다. 풀 supernatants (세포 기질 및 ER), parafilm으로 커버하고 얼음 계속. </li><li> 작은 통관 유봉 6 획으로 펠렛을 Resuspend, 4.8에 ML / g는 신선한 homogeniser에 솔루션 B의 (g는 원래 뇌의 무게라고합니다). </li><li> 유리 파스퇴르 피펫 사용하여, 신중하게 다음과 같이 관의 맨 ​​아래에이어서 추가 더 거품이 형성되지 않습니다 보장 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브에서 불연속 자당의 그라디언트를 준비 : Resupended 펠렛 (0.32 M의 자당) 3 ML 850 밀리미터 자당 (1 MM NaHCO 3) 3 ML 1 M의 자당 (1 MM NaHCO 3) 3 ML 1.2 M의 자당 (1 MM NaHCO에서3) </li><li> 4 ° C.에서 2 시간에 82,500 XG에 원심 분리기 그라디언트의 끝에서 그 결과 분리는 세 밴드와 펠렛 생산합니다 : - 2) ER, Golgi, 플라즈마 멤브레인 (0.85 M - 1 M 인터페이스) 0.85 M 인터페이스) 1) myelin 및 기타 막 오염 물질을 (0.32 M, 3) synaptosomes (1 M - 1.2 M 인터페이스), 4) 미토콘드리아 원유 (펠렛) 이후 정화 단계에 사용되는 </li></ol> 3. 미토콘드리아 - 관련 ER 막의 절연, MAMs <ol><li> 갓 추가 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 두 ML 절연 매체에 하나의 뇌 절반에서 미토콘드리아 갓 고립 된 원유를 Resuspend. </li><li> 그라데이션 버퍼 8 이분의 일 뇌 당 ML, 그리고 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브의 장소와 30 % Percoll 기울기를 준비합니다. </li></ol> * 참고 : D 후 정확한 최종 농도를 달성하기 위해 (1.43 배) 기울기 버퍼가 더 집중하기30 % Percoll을 iluting. <ol start="3"><li> 준비된 기울기 상단에 레이어 mitochondrial 정지는 천천히 모든 거품을 방지합니다. </li><li> 30 분, 4 ° C.에 95,000 XG에 원심 분리기 </li><li><ol class="lroman"><li> 유리 파스퇴르 피펫으로 FIRST 중공업 비율 (낮은 밴드)를 제거하고 신선한 왕복 아래 유리관에 전송, 얼음. </li><li> 또 다른 유리 파스퇴르 피펫 두 번째는 빛 분수 (위 밴드)를 제거하고 얼음에 별도의 신선한 왕복 아래 유리관에 전송할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 4에 10 분에 6,300 XG에서 10 ML 절연 매체와 원심 분리기와 단계 3.5 수집 된 두 분수 ° C.를 희석 </li><li> 단계 3.6에서 얻어진 중공업 비율의 표면에 뜨는 폐기하십시오 다른 10 ML 절연 매체로 펠렛을 resuspend과 단계 3.6로, 다시 원심 분리기. 그 결과 펠렛은 순수 mitochondrial 분율 될 것입니다. </li><li> 빛 Frac에서 표면에 뜨는을 전송기가 얼음에 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브에 단계 3.6에서 얻은. 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 1 시간, 4 ° C.에 100,000 XG의 튜브와 원심 분리기를 작성 단계 3.8에서 얻어진 표면에 뜨는에 충분한 절연 매체를 추가 그 결과 펠렛은 MAMs 분수됩니다. 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거하고 폐기합니다. </li></ol> 참고 :이 단계에서, 여러분은 또한 1 시간, 4 십만 XG에 원심 분리기 수 있습니다 ° C 단계 2.6에서 저장 한 표면에 뜨는. 펠렛은 ER 분수이어야하며 Cytosolic 일부를 표면에 뜨는 것입니다. 4. Glycosphingolipid 강화 Microdomains, 보석 추출 <ol><li> 얼음에 20 분에 추출 버퍼 500 μl-1 ML에 순수 미토콘드리아 및 / 또는 이맘 분수를 Lyse. </li><li> 4에서 2 분에 15,300 XG에 lysates을 원심 분리기 ° C. </li><li> supernatants (트리톤 X-100 수용성 물질)와 다시 원심 분리기 알약을 수집2 분에 용해 물질을 남아 제거합니다. (트리톤 X-100은 미토콘드리아 추출 및 / 또는 트라이 튼 X-100 추출 MAMs). </li><li> 버퍼 Solubilising에서 알약을 Solubilize. 이 solubilized 자료는 GEM의 분수를 상징하며 추가적인 분석을 위해 사용할 수 있습니다. </li></ol>

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	<li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2++signaling+in+smooth+muscle:+why+two+membranes+are+better+than+one.">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li><li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+(SOCE.">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li><li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum:+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues.">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li><li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca(2+)-dependent+mitochondrial+apoptosis.">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li><li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot:+The+mitochondria-associated+membrane+(MAM).">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li><li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum.">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li><li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response.">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death.">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+with+high+Ca2++close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria.">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li><li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane.">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li><li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria.">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li><li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+interface:+the+social+network+of+cell+death.">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria.">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Pizzo, P., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+lipid+rafts:+structure+and+function.">Lymphocyte lipid rafts: structure and function.</a> Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).</li></ol>

저자는 모두 신고 할 관심의 충돌이 없습니다.

세포 멤브레인 간 또는 세포 소기관과 세포의 플라즈마 막 사이의 접촉의 사이트는 기본 세포 프로세스에 동적 신호 플랫폼을 나타냅니다. 생리학 및 병리학 조건 모두에 따라 자신의 기능과 구성의 정확한 특성은 안정적이고 재현 정화 프로토콜이 필요합니다. 여기에 설명 된 방법은 특별히 성인 마우스의 뇌에서 MAMs와 해당 보석의 절연 및 정화를 위해 우리 실험실에서 최적화되었습니다. 이 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 분류 </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> 염화 마그네슘, Hexahydrate </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘 염화물, 이수화 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 이맘 </td></tr><tr><td> D-마니 톨 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, 분수 V, 열 충격은 Lyophilizate </td><td> 로슈 </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T9284-500 ML </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 로슈 </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCL </td><td> 피셔 과학 </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Dodecyl의 황산 (SDS) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 공통의 </td></tr><tr><td> 전체 단백 분해 효소 저해제의 태블릿, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 </td><td> 로슈 </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 2 ML 조용한 전체가 유리로 조직 분쇄기 </td><td> 킴블 체이스 </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔형 원심 분리기 튜브, BD 매 </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ML 라운드 - 하단 유리 원심 분리기 튜브 </td><td> 킴블 체이스 </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 라운드 - 하단 유리 Centrifuge 튜브 </td><td> 킴블 체이스 </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuge 튜브, 울트라 클리어, Thinwall, 14x89 mm </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> 콜 - Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> 일회용 붕규산 유리 파스퇴르 (Pasteur) Pipets, 9 &quot; </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-678 - 20C </td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondria-associated er membranes (mams) and glycosphingolipid enriched microdomains (gems): isolation from mouse brain

세포 세포 소기관은 모양과 셀 별 고유 및 외부 신호를 받게 아르 구성을 변화와 고도의 동적 구조입니다. 그들의 멤브레인은 종종 신호 분자와 막 구성 요소 1,2,3,4의 교환을위한 허브가 정의 연락처 사이트에서 juxtaposed 있습니다. endoplasmic 소포체 (ER)와 + 채널이 미토콘드리아 관련-ER 멤브레인 또는 MAMs 4,5,6로 알려져 있습니다 IP3에 민감한 칼슘 2 개구에서 미토콘드리아 사이에 형성되는 간 organellar 막 microdomains. 단백질 / 지질 조성과 이러한 멤브레인 연락처 사이트의 생화학 특성을 광범위하게 특히 세포 내 칼슘 2 + 4,5,6을 조절에서의 역할과 관련하여 연구되었습니다. ER은 +,이 용량에서 칼슘이 세포의 하류 공정의 무수한을 조절 세포 칼슘 (2)의 기본 저장소 역할을 + 신호, incl포스트 병진 단백질 접힘, 단백질 maturation7을 uding. 미토콘드리아, 다른 한편으로,이를 통해 하류 칼슘 2 + 불균형 4,8의 apoptotic 경로의 개시를 방지 cytosolic 칼슘 2 + 농도를 버퍼링하여 칼슘 2 + 항상성을 유지하고 있습니다. MAMs의 동적 특성은 그들에게 이상적인 사이트는 칼슘 2 + 신호와 mitochondrial 칼슘 2 + 농도, 지질 생합성 및 수송, 에너지 신진 대사와 세포 생존 4,9,10,11,12 규제 등의 기본적인 세포 메커니즘을 해부 할 수 있습니다. 여러 프로토콜은 간 조직 및 배양 세포 13,14에서 이러한 microdomains의 정화에 대한 설명되었습니다. 계정에 이전에 다음 ID로 출판 방법을 복용, 우리는 성인 마우스의 뇌에서 미토콘드리아와 MAMs의 절연을위한 프로토콜을 적응하고 있습니다. 이 절차에 우리는 추가 정화 단계, 즉 트리톤의 X100 추출을 추가하는 전자nables MAMs의 glycosphingolipid 강화 microdomain (GEM) 분수의 고립. 이러한 GEM의 준비가 플라즈마 막 나 다른 세포 세포막에서 유래 caveolae과 지질 보트와 여러 단백질 구성 요소를 공유하고 수용체 단백질의 클러스터링에 대한 포인트를 수집처럼 단백질 단백질 상호 작용 4,15에 대한 작동하도록 제안하고 있습니다.

우리가 안전하게 MAMs, 보석 및 마우스의 뇌에서 mitochondrial 분수의 절연 및 정화를 위해 추천 할 수 있습니다이 프로토콜을 사용하여와의 경험을 바탕으로. 명시된 절차는 매우 재현과 일치합니다. 그림 1에서 우리는 Percoll 기울기 (단계 3.4)의 방법으로 순수 미토콘드리아와 MAMs 층의 대표 이미지를 보여줍니다. 이맘 분율은 미토콘드리아 위의 확산과 폭 넓은 대역을 구성하는 동안 포?...

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Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

이 절차는 성인 마우스 뇌 미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 또는 MAMs 및 MAMs과 mitochondrial 준비에서 glycosphingolipid 강화 microdomain 분수에서 분리하는 방법을 보여줍니다.

미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 (MAMs)와 Glycosphingolipid 강화 Microdomains (보석) : 마우스 뇌에서 절연

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

mitochondria-associated-er-membranes-mams-glycosphingolipid-enriched

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

24.2K 조회수.  St Jude Children's Research Hospital. 이 절차는 성인 마우스 뇌 미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 또는 MAMs 및 MAMs과 mitochondrial 준비에서 glycosphingolipid 강화 microdomain 분수에서 분리하는 방법을 보여줍니다.

비디오: Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

연구

신경과학

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with immunostaining and unbiased automated image analysis, this model allows for the analysis of the effects of drugs and genetic manipulations on &#945;-synuclein aggregation in neuronal cultures. Primary midbrain cultures provide a reliable source of bona fide embryonic dopamine neurons. In this protocol, the hallmark histopathology of Parkinson&#8217;s disease, Lewy bodies (LB), is mimicked by the addition of &#945;-synuclein pre-formed fibrils (PFFs) directly to neuronal culture media. Accumulation of endogenous phosphorylated &#945;-synuclein in the soma of dopamine neurons is detected by immunostaining already at 7 days after the PFF addition. In vitro cell culture conditions are also suitable for the application and evaluation of treatments preventing &#945;-synuclein accumulation, such as small molecule drugs and neurotrophic factors, as well as lentivirus vectors for genetic manipulation (e.g., with CRISPR/Cas9). Culturing the neurons in 96 well plates increases the robustness and power of the experimental setups. At the end of the experiment, the cells are fixed with paraformaldehyde for immunocytochemistry and fluorescence microscopy imaging. Multispectral fluorescence images are obtained via automated microscopy of 96 well plates. These data are quantified (e.g., counting the number of phospho-&#945;-synuclein-containing dopamine neurons per well) with the use of free software that provides a platform for unbiased high-content phenotype analysis. PFF-induced modeling of phosphorylated &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons provides a reliable tool to study the underlying mechanisms mediating formation and elimination of &#945;-synuclein inclusions, with the opportunity for high-throughput drug screening and cellular phenotype analysis.

Studying Pre-formed Fibril Induced &amp;#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Here, we present a detailed protocol to study neuronal &#945;-synuclein accumulation in primary mouse dopamine neurons. Phosphorylated &#945;-synuclein aggregates in neurons are induced with pre-formed &#945;-synuclein fibrils. Automated imaging of immunofluorescently labeled cells and unbiased image analysis make this robust protocol suitable for medium-to-high throughput screening of drugs that inhibit &#945;-synuclein accumulation.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent infarction size and location, precipitation of platelet:fibrin intermixed blood clots similar to those in patients, and an adequate sensitivity to fibrinolytic treatment. The rose bengal (RB) dye-based photothrombotic stroke model meets the first two requirements but is highly refractory to tPA-mediated lytic treatment, presumably due to its platelet-rich, but fibrin-poor clot composition. We reason that combination of RB dye (50 mg/kg) and a sub-thrombotic dose of thrombin (80 U/kg) for photoactivation aimed at the proximal branch of middle cerebral artery (MCA) may produce fibrin-enriched and tPA-sensitive clots. Indeed, the thrombin and RB (T+RB)-combined photothrombosis model triggered mixed platelet:fibrin blood clots, as shown by immunostaining and immunoblots, and maintained consistent infarct sizes and locations plus low mortality. Moreover, intravenous injection of tPA (Alteplase, 10 mg/kg) within 2 h post-photoactivation significantly decreased the infarct size in T+RB photothrombosis. Thus, the thrombin-enhanced photothrombotic stroke model may be a useful experimental model to test novel thrombolytic therapies.

Traditional photothrombotic stroke (PTS) models mainly induce dense platelet aggregates of a high resistance to tissue plasminogen activator (tPA)-lytic treatment. Here a modified murine PTS model is introduced by co-injecting thrombin and photosensitive dye for photoactivation. The thrombin-enhanced PTS model produces mixed platelet:fibrin clots and is highly sensitive to tPA-thrombolysis.

피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 광혈전 뇌졸중 모델

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

유세포분석을 사용한 마우스 뇌 히스톤 변형 정량화

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

저자 스포트라이트: 유전자 발현 조절 연구의 개선 사항

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...