이 작품은 약물 남용 (NIDA) 부여 R01 DA24040 (DCC), 콜로라도 대학의 혁신적인 씨 그랜트 (DCC) 및 NIDA 교육 교부금 T32 DA017637 (MVB)에 대한 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 바이러스의 저장 및 준비 <ol><li> 쥐의 뇌에 옵신 유전자를 전달하기위한 복제 무능한 AAV 벡터의 사용은 바이오 안전성 레벨 1 (BSL-1)에 대한 승인과에서 사용할 수있는 미국 정부 간행물, 미생물학 및 생물 의학 연구소에서 바이오 안전성에 설명 된대로 적절한 보호 및 취급 절차가 필요합니다 (의 질병 통제의 웹 사이트를위한 센터 <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> -80 ° C의 냉동고에있는 클래스 II 바이오 안전성 내각과 저장소에있는 작은 작업 분주로 제조 업체의 유리 병에서 반복 동결 - 해동 사이클, 피펫 바이러스를 방지하기 위해. </li><li> 이전 정위 주사로 나누어지는 얼음에 해동 한 후 잠시 벤치 톱 원심 분리기와 스핀 다운 할 수 있습니다. </li><li> 천천히 해밀턴 유리 주사기 및 실리콘이나 미네랄 오일 소량의 바늘을 백필.확인 주사기 배럴에 보이는 기포가 없는지 확인하십시오. microinjector 펌프에 주사기를 삽입하고 수직 정위 팔 (즉, 정위 조작)에 직접 펌프를 연결합니다. </li><li> 바늘의 선단이 바이러스 분취 튜브의 바닥에 닿을 때까지 정위 아암을 하향 조정한다. 바이러스의 원하는 볼륨 (1 ㎕를 주입 1.5 μl를) 철회 microinjector 펌프 컨트롤러를 사용합니다. </li><li> 바이러스와 접촉 모든 재료와 표면은 염소 표백제 (10 %) 등의 소독제로 소독해야한다. </li></ol> 2. 수술과 바이러스 주입 <ol><li> 마취제와 동물을 마취 (쥐, 125 ㎎ / kg, IP) - 자일 라진 (쥐, 10 ㎎ / kg, IP) 칵테일. 마취의 효과를 측정하기 위해, 발가락 핀치에 반사 응답을 확인하고 필요한 경우 마취제의 보충 용량을 제공합니다. 표준 무균 수술 방법을 사용하여, 정위 장치 (데이비드 KOPF에서에 동물을 배치인스투르먼트). </li><li> 작은 외과 용 가위 또는 메스와 동물의 두개골의 상단에 피부를 통해 중간 선 절개를합니다. 부드럽게 결합 조직을 분리하고 작은 뼈 스크레이퍼와 두개골의 상단을 청소합니다. </li><li> 동물의 머리가 z는 브레 그마 및 람다 좌표 있도록이 동일 수준인지 확인합니다. 이러한 정위 좌표에있는 쥐의 두뇌 (조지 팍시 찰스 왓슨, 대학 출판부, 2007) 또는 마우스 뇌 정위 좌표 (키스 BJ 프랭클린과 조지 팍시, 학업 부담으로 뇌지도 책에서 대상 뇌 영역의 정위 좌표를 결정 , 2007). 수술 펜 주사의 의도 된 사이트를 표시합니다. </li><li> 조심스럽게 얇은 휴대용 드릴을 사용하여 대상 지역에 두개골과 드릴 비트는 두개골의 바닥에 도달 할 때 중지합니다. 극세 포셉의 쌍을 사용하여, 경막을 노출시키기 위해 얇게 뼈를 제거한다. </li><li> 대상에 주사기 바늘은 위치그것은 경질에 닿을 때까지 바늘을 낮추고 Z 좌표 계산이 점을 사용합니다. 적당한 Z 위치에 도달 할 때까지 매우 느리게 뇌에 주사 바늘을 낮출. 이 프로토콜에서, 내측 전두엽 피질의 prelimbic 지역이나 지느러미 subiculum의 브레 그마하기 (-6.0 mm 전방 (브레 그마 2.7 mm 전방은, 중간 선 및 경막에서 -2.2 mm의 측면 0.5 mm를 ±), 측면 3.0 mm는 ± 중간 선 및 경질)에서 -2.0 mm로 성인 수컷 Sprague Dawley 쥐 (약 275g)의 대상으로합니다. </li><li> 0.1 μL / 분의 속도로 바이러스를 주입한다. 주입이 완료된 후에는 뇌 표면에 바이러스의 역류를 방지하기 위해 바늘을 인출하기 전에 10 분 동안 기다린다. </li><li> 피부를 봉인하고 상처에 항생제를 적용 부착 바늘로 꿰매는 봉합사를 사용합니다. </li><li> AAV 벡터에서 ChR2 및 NpHR 기능 발현의 시간 과정은 실험 설계 및 바이러스 역가에 따라 달라질 수 있습니다. 이 실험, 생체 </eM&gt; 녹음은 18-21일 포스트 분사를 실시 하였다. </li></ol> 3. 빛 배달 및 ChR2 또는 NpHR 발현하는 신경 세포의 생체 내 녹음 <ol><li> 최고 접착제를 사용하여 유리 모세관 튜브 (피셔 과학)에 텅스텐 전극 (~ 1.5 MΩ, MicroProbes)를 연결합니다. </li><li> 에탄올로 멀티 모드 광섬유 (200 ㎛ 직경의 코어 THORLABS) 깨끗한 섬유 팁의 맨 끝을 노출 섬유 벗기는 도구 (THORLABS)를 사용합니다. 아주 가볍게 쐐기 모양의 다이아몬드 나이프 (THORLABS)와 섬유 팁 점수를 조심스럽게 (미세 집게로 예를 들면) 초과 섬유를 제거합니다. 섬유는 점수에 쉽게 절단해야합니다. </li><li> 200 mW의 하나의 다이오드 레이저 (출력 포트의 PC 커넥터에 섬유의 FC의 끝을 연결 <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> 원하는 파장). 레이저 작업시 적절한 보호 안경을 항상 착용되어 있는지 확인합니다. </li><li> L을 측정광 파워 미터 (하여 광섬유의 끝 ASER 강도 <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">를 www.Lumiphy.com</a> ). 생체 녹음의 경우, 20 ~ 100 mW의 / ㎟ 한 작은 빛의 강도가 안정적으로 연결 활동의 각각 ChR2 또는 NpHR 매개 활성화 또는 침묵을 보여주고 있습니다. </li><li> 모세관에 광섬유를 삽입. 약 500 μm의 텅스텐 전극의 끝 위의 섬유 팁을 배치하고 전극과 섬유가 직선이되도록 끝 근처의 몇 가지 포인트에 두 번가는 봉합 실을 맨다. 전극의 끝과 가장 가까운 매듭 사이의 거리가 대상 영역에 삽입을위한 충분한 시간이 있는지 확인합니다. </li><li> 단계 2.1 이상 2.2에서와 같이 동물을 준비합니다. optrode (위치의 두개골에 새로운 깨끗한 작은 창을 만들기 위해 가이드로 초기 개두술을 사용 <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com을</a> ). D에 작은 절개를합니다우라는 미세 바늘을 사용. </li><li> 조심스럽게 미세 조작기 (Narishige)를 사용하여 형질 영역으로 두개골 창을 통해 뇌에 optrode을 낮 춥니 다. 그런 다음 빛에 반응 세포의 출현까지 10 ~ 50 μm의 단계에서 천천히 optrode를 진행. </li><li> 사용자 정의 소프트웨어 사용자 인터페이스 (NeuroLux 프로 <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> 의 LabVIEW (내쇼날 인스트루먼트)로 작성)은 하나의 다이오드 레이저를 제어하고 지속적인 신경 활동을 시각화하고 기록하는 데 사용됩니다. 녹음 된 신호를 필터링 ExAmp-20K (KATION 과학) 앰프의 대역 통과 (0.3-8 kHz에서), 디지털 보드 (NI의 USB-6009)에 대한 내쇼날 인스트루먼트의 아날로그로 촬영됩니다. NeuroLux 프로 사용자 인터페이스는 아날로그 입력의 선택 및 디지털 출력 (신경과 TTL 신호에 대한 두 개의 채널을 선택) 할 수 있습니다. 사용자는 샘플링 레이트 (20 KHZ), 기준 기간 (프리 라이트), 및 사후 점등 기간을 정의 할 수있다. 사용자는 TTL 레이저 stimulati를 정의 할 수도펄스 폭, 주파수와 자극 기간 (주파수가 20 Hz에서 자극 기간은 500 밀리 초입니다 경우, 정의 된 펄스 폭 (10) 레이저 펄스가 전달)에 대한 것입니다. 사용자는 또한 지속적으로 빛 배송을 선택 (예를 들어, 그림 1). 수 있습니다 반복 기록을 위해, 사용자는 또한 펄스 트레인의 개수 및 기차 간의 간격을 정의 할 수있다. 데이터 또는 디스크에 기록하지 않고 획득 할 수있다. </li><li> 기록 후, 동물을 케타민 / 자일 라진으로 마취 칵테일 것으로 transcardially optrode 배치 및 옵신 발현을 확인하기 위해서 생리 식염수 및 파라 포름 알데히드 (4 %)으로 관류. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

기술의 다양한 설치류에서 분리 된 뇌 영역에 미생물 옵신 유전자를 유전자 표적으로 사용할 수 있습니다. 바이러스 성 유전자 전달은 세포 형 특이 ChR2 및 NpHR 표현을 매개 비교적 저렴​​하고 빠른 방법을 제공합니다. AAV 벡터 시스템은 스토리지, 병원성이 부족하고 장기 유전자 발현 (10)을 생산하는 능력을 유지하는 동안 안정적인 높은 생산 역가 때문에 optogenetic 실험에 사용하기위한 일반적인 선택이다. 세포 형 특이 적 프로모터와 옵신 구조의 대부분은 펜실베니아 대학 (벡터 핵심 시설에서 AAV 혈청 형의 다양한 상업적으로 사용할 수 있습니다 <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) 또는 대학 채플 힐의 노스 캐롤라이나 ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). AAV 기술에 대한 하나의 단점은셀 고유 타겟팅을 사용할 수있는 유전자 카세트 크기에 제한을 배치 한정된 장비 용량 (~ 4.7 KB). 대안으로,보다 큰 장비 용량 렌티 바이러스 벡터는, 큰 프로모터 서열의 제어하에 표적 옵신를 수용 할 수있다. optrode의 사용은 일시적으로 정밀한 빛의 전달과 함께 전기 생리학 신호의 신뢰성 감지 할 수 있습니다. 상술 한 바와 같이, 그러나, 충분한주의가 그 건설 필요하다. 절단 된 광섬유가 깨지기 때문에, 너무 단단히 봉합 실을 묶는 것은 섬유가 중단 될 수 있습니다. 전달 광의 전극과 품질의 임피던스가 저하되므로 optrode 여러 레코딩에 사용될 수 있지만, 전극과 광섬유 삽입 이전 세정 (또는 수동으로 광섬유 맨발 단부의 경우 절단)되어야 반복 사용과 함께. ELE 중ctrophysiological 녹음 그것은 optrode 서서히 전진하는 것이 중요하다. 여기에 사용 optrode 약 350 μm의 두께가 (텅스텐 전극 : 125 μm의, 광섬유의 코어 : 200 ㎛) 및 빨리 저하는 뇌 조직의 움직임으로 이어질 수 있습니다. 빛에 의한 유물은 특정 기록 및 광 전달 셋업 11-12로 간주 될 수 있습니다. 우리가 우리의 실험 조건에서 더 빛을 유도 유물을 발견하지만, 형질 뇌 영역 밖의 기록은 잠재적으로 빛 유물에 대한 제어로 사용할 수 있습니다. 기록 처리 중에 다른 고려 사항은, 특히 장기간 녹화 들면 ChR2 또는 NpHR-발현 뉴런의 변화를 관찰하기위한 필수의 광 강도이다. 강한 레이저 강도와 긴 레이저 조명은 조직 손상 및 / 또는 후속 전달 빛을 12-13로 감소 반응이 발생할 수 있습니다. 행동 실험을 위해서 컨트롤 바이러스 벡터의 사용은 eliminatin 필요G 섬유에서 전달되는 열에 의한 영향. 시판 optogenetic 구조의 많은 옵신 유전자 서열이 제거 된 상보 제어 구조가있다. 그것은 ChR2 특정 실험 질문에 14 ~ 15에 더 적합 할 수있는 다른 침묵 opsins과 함께 개발 된 향상된 특성 및 반응 속도와 변종 설계 주목해야한다. 예를 들어, 대상 돌연변이 유발을 통해 설립 된 새로운 ChR2 변종, &quot;Cheta은은&quot;원래 ChR2 14의 위의 (적어도 200 Hz에서 최대) 주파수에서 높은 충실도의 연결 스파이크를 구동 할 수있다라고합니다. 생체 내에서 빛의 전달 및 신경 반응의 동시 녹음의 조합은 유전자 표적 세포 집단과 해당 시간에 잠 행동 행사에 패턴 활동 사이의 인과 관계를 확립하는 중요한 단계입니다. 절차 및 하여기에 설명 rdware 설치류의 생체 내 머리 고정 녹음에 optogenetics을 구현하는 간단한 방법을 제공합니다.

시간적으로 정확한 방식으로 신경 회로 내의 특정 세포 유형을 활성화하거나 침묵하는 기능은 신경 회로가 감정과 인식의 기초가 서로 다른 유형의 정보를 처리하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 그대로 신경 활동을 통해 실험 제어는 제공하지 않습니다 loss-/gain-of-function 도구 (예를 들어, 전기 자극, 약물 변조, 병변)를 채용 한 하나 공간적 시간적 규모로, 뉴런의 특정 인구를 제어하기위한 선택적으로 필요합니다. 바로 이러한 기술적 과제를 해결, 유전자 인코딩 할 빛에 민감한 도구의 개발 및 응용 프로그램은 잘 정의 된 행동 이벤트 기간 동안 셀을 선택 유형의 전기 활동을 제어하는​​ 신경 과학자를 가능하게했다. 이 빛에 민감한 단백질의 대부분은 빛 게이트 양이온 채널, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, 및 광 기반 염화 펌프, halorhodop으로, 미생물 기원합니다죄 널리 사용 (NpHR) 2, 3,. optogenetics의 가장 큰 장점은 이종 뇌 영역에있는 유전자 표적 특정 세포 집단의 능력과 기술을 성공적으로 모델 생물의 수 (인간이 아닌 영장류에 무척추 동물) 4-6에 적용되었습니다. 많은 optogenetic 형질 전환 동물이 발생하고 7,8 상업적으로 사용할 수 있습니다, 그러나 설립 유전자 변형 라인은 노동 집약적이고 비용 금지 될 수 있습니다되었습니다. 여기서 우리는 재조합 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 쥐 prelimbic의 피질 및 subiculum의에서 CaMKIIα 프로모터에서 ChR2 및 NpHR 유전자의 바이러스 성 매개 납품을위한 프로토콜을 설명합니다. 전뇌 내 CaMKIIα 식 글루타메이트 피라미드 뉴런 9 배타적입니다. AAV는 일반적으로 인해 상대적으로 생산 및 병원성의 부족의 용이성뿐만 아니라, 기본적인 연구에 사용되는 강한 persi이 벡터 10 달성 한 스텐트 유전자 발현. 또한 우리는 마취 머리 고정 된 쥐에서 동시에 빛의 전달 및 기록하는 단계와 하드웨어를 설명합니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe </td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Removable Needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-03</td>
 <td>31 gauge, beveled tip</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microinjector Pump</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>UMP3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pump Controller</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-MICRO4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone Oil</td>
 <td>Alfa Aesar</td>
 <td>A12728</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser Protective Eyeware</td>
 <td>Kentek </td>
 <td>KMT-4501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Optical Fiber</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>BFL37-200</td>
 <td>200 &mu;m diameter core, 0.37 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber Stripping Tool</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>T12S21</td>
 <td>for 200 &mu;m diameter core multimode fiber</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Power Meter</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Photodetector</td>
 <td>Newport</td>
 <td>818-SL/DB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tungsten/Fiber Optrode</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>Lumitrode</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Capillary Tube</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-362-566</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydraulic Micromanipulator</td>
 <td>Narishige</td>
 <td>MO-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Kation Scientific</td>
 <td>ExAmp-20K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquistion Device</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>NI USB-6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rodent Head Restraint for Recording</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic Unit</td>
 <td>David Kopf Instruments</td>
 <td>Model 963</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

Optogenetic 방법은 종의 넓은 범위에 걸쳐 행동의 다양한 세트를 기본 신경 회로의 활동을 해명하기위한 강력한 도구로 등장했습니다. 미생물 유래의 Optogenetic 도구 (예를 들어, channelrhodopsin-2, ChR2) 또는 침묵 (예를 들어, halorhodopsin, NpHR) 행동으로 관련 척도에 신경 활동 ingenetically 정의 종류의 세포를 활성화 할 수있는 빛에 민감한 막 단백질로 구성되어 있습니다. 우리는 첫 번째 지느러미 subiculum의 쥐의 전두엽 피질의 prelimbic 지역에 ChR2 및 NpHR 도입 유전자의 아데노 - 관련 바이러스 매개 전달을위한 간단한 방법을 보여줍니다. ChR2 및 NpHR 유전자 타겟팅 할 수 있기 때문에, 우리는 높은 시간 정밀도로 이종 조직에 내장 신경 (즉, 피라미드 뉴런)의 특정 개체군의 전기적 활성도를 제어하기위한 본 기술의 사용을 설명한다. 우리는 여기에 하드웨어, 사용자 정의 소프트웨어 업데이트를 설명생체 준비 마취에서 유전자 변형 피라미드 뉴런에서 동시에 빛의 전달 및 전기 녹음 수 있도록 사용자 인터페이스 및 절차에 대해 설명합니다. 이러한 광 응답 툴 정보 처리 및 동작에 다른 세포 유형의 인과 포스팅을 식별하기위한 기회를 제공한다.

그림 1은 신경 세포 활동의 동시 녹음에 사용되는 빛의 펄스 파라미터 (즉, 펄스 주파수, 펄스 폭, 자극 기간)을 제어하는 사용자 정의 소프트웨어 LabVIEW 환경 개발 (프로 NeuroLux) (내쇼날 인스트루먼트)의 스크린 샷을 보여줍니다. 소프트웨어 프로그램은 하나의 다이오드 레이저에 대한 제어를위한 TTL 펄스를 생성하는 디지털 수집 장치에 명령 신호를 보낸다. 또한 소프트웨어 프로그램의 표시 및 저장 기록 된 신경 세포의 활동과 전달 TTL 신호. 이러한 신호는 정의 된 샘플 레이트 (예를 들어, 20 kHz에서)에서 수집 장치를 통해 디지털화된다. 기록 된 신호는 이진 파일의 2 차원 배정 밀도 배열로 저장됩니다. 그림 2는 광섬유에 부착 된 텅스텐 전극으로 구성된 사용자 지정 optrode을 보여줍니다. 광섬유는 3 번 경상 봉합 실을 사용한 전극에 고정되어있다포인트. 필요한 경우, 최고 접착제는 이들을 고착 할 수있다. 그러나, 전극이 섬유를 여러 번, 빛의 투과를 재사용 할 수 있지만, 반복 사용으로 분해하고 분해 및 청소하거나 뇌에 삽입 할 때마다 교체해야하기 때문에 영구적으로 전극에 광섬유를 고정하지 마십시오. 실제 ChR2 및 NpHR 식을 나타내는 강화 노란색 형광 단백질의 그림 3은 형광 이미지의 왼쪽 패널. 이 사진은 대표적인 쥐의 등쪽에서 subiculum의 NpHR 표현 (그림 3A)과 prelimbic 피질 ChR2 표현 (그림 3B)를 보여줍니다. 바이러스 성 표현 (예 : 일부 형광)이 왼쪽, 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 (그림 3A를 관찰) 등의 subiculum의 및 prelimbic 피질에 주로 제한되었다. 전극 (얇은 트랙, 화살표 머리)와 광섬유 (두꺼운 트랙, 화살표)의 트랙도 관찰되었다. 그림 4의 = &quot;jove_content&quot;&gt; 왼쪽 패널 ChR2가. 그림 4a는 prelimbic 쥐에 10 밀리 초 푸른 빛의 펄스의 20 Hz에서 전달에 대응 ChR2 트리거 활동 전위의 예를 추적합니다 쥐 prelimbic 피질에서 시간적으로 정확한 스파이크를 유도 것을 보여줍니다 피질. 래스터 플롯 (그림 4B)는 여섯 대표 뉴런 ChR2 유도 활성화를 보여줍니다. 모든 기록 된 신경 세포는 완벽한 충실도로 빛을 유발 급상승을 보였다. ChR2 달리, NpHR가 신속하고 가역적으로 쥐 prelimbic 피질 (그림 4의 오른쪽 패널)의 생체 내에서 자발적인 활동을 침묵.도 4c 보여주는 예제 추적입니다 아래 NpHR을 표현 prelimbic 피질의 연속 532 nm의 조명 (10 초) CaMKllα 프로모터는 생체 내에서 자연 단일 유닛 활동을 제거한다. prelimbic 피라미드 세포 활동의 완전한 침묵 시간 고정 10 초 연속 광 전달에 유의하십시오. 낮은어 래스터 플롯 (그림 4D)는 여섯 대표 뉴런 NpHR 유도 침묵을 보여줍니다. 모두 생체 내 기록은 미생물 옵신 유전자의 AAV - 중재 배달 18-21 일 이전에 발생한 성인 흰쥐에서 얻은 전형적인이다. 그림 5는 쥐 prelimbic 피라미드 신경 세포의 반복 ChR2 자극의 결과를 보여줍니다. 블루 라이트 펄스 (10 밀리 초)을 5 초 (100 펄스 총) 20 Hz에서 전달했다. 빛 유발 스파이크의 전압 추적 반복 2 시간의 녹음 세션 (61 회 반복 합계) 중 매일 2 분을 인수했다. 이 반복적 인 자극 프로토콜을 사용하는 경우에도, ChR2는 광 전달에 응답하여 안정적이고 강력한 스파이크를 유발. 도 6 및 7은 NpHR 유도 광 저해 및 래트 subicular 신경 활동의 ChR2 구동 photoactivation의 결과를 나타낸다. 경우 prelimbic 피질에서와 같이, NpHR 및 ChR2는 할 수 있었다빛에 의한 시간 고정 억제 및 재현성 옵신 형질 도입 subicular 신경 세포의 활성화를 중재. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> 그림 1. 동시에 빛의 전달 및 전기 생리학 녹음 NeuroLux Pro 소프트웨어 인터페이스의 스크린 샷. 사진은 추적 연속 532 nm의 빛 전달의 10 초에 대응 쥐 prelimbic 피라미드 세포의 자발적인 활동의 NpHR 유도 침묵을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> 그림 2. 사용자 정의 optrode의 고성능 이미지. 광섬유는 유리 모세관 텅스텐 전극에 부착되어 봉합 실을 사용한 전극에 고정 삽입된다. betw 중심 간 거리EEN 전극 팁 및 광섬유 팁은 약 500 μM이다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> 그림 3. 바이러스 성 표현과 optrode 배치. (왼쪽) 사진은 대표 지느러미 subiculum의에서 NpHR 식 (A)와 prelimbic 피질 (B)에 ChR2 표현을 보여줍니다. 각 사진이 촬영 된 위치를 나타냅니다 (오른쪽) 도식. 각 사진의 화살촉과 화살은 텅스텐 전극의 위치와 광섬유를 표시였다. SUB : subiculum의, DG : 치아 이랑 (dentate gyrus), PL :. prelimbic 피질의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> 그림 4. ChR2 또는 NpHR 형질 도입 쥐 prelimb에서 생체 전기 생리학 기록IC 피질. (A) 블루 (473 NM) 광 펄스 (10 밀리 초, 파란색 막대)의 20 Hz에서 전달에 대응 ChR2 트리거 활동 전위의 예 추적. (B) 여섯 대표 뉴런에 ChR2 유도 스파이크를 보여 래스터 플롯. 각 유닛 활동은 점으로 꾸몄다. (C) 연속 녹색 (532 nm의) 빛 조명 (10 초, 녹색 막대) 동안 자발적인 활동의 NpHR 유도 억제의 예 추적. (D) 여섯 대표 뉴런에 NpHR 유도 침묵을 보여주는 래스터 플롯. 각 유닛 활동은 점으로 꾸몄다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> 그림 5. 생체 내에서 쥐 prelimbic 피라미드 신경 세포의 반복 20 Hz에서 ChR2 중심 급상승. (A) 라이트 유발 스파이크의 흔적을 전압은시점 0, 30, 60, 90에서 취득한, 레코딩의 시작 후 120 분. (B) 빛에 의한 활성화의 61 반복 (2 분 간 시험 간격, 120 분 합계)를 표시 래스터 플롯. 각 유닛 활동은 점으로 꾸몄다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> 그림 6. NpHR 형질 도입 쥐의 척수에서 subiculum의 생체 ​​전기 생리학 기록. (A) NpHR을 표현 지느러미 subiculum의 10 초 연속 532 nm의 조명 (녹색 막대가) 자발적인 활동을 제거 보여주는 예 추적. 위의 추적에서 두 개의 기록 된 단위 (B) 평균 파형. 진폭 임계 값은 두 개의 별개의 뉴런을 식별하는데 사용되었다. (C) 다섯 반복을 보여주는 래스터 플롯이러한 단위의 NpHR 유도 침묵의의. 각 유닛 활동은 점으로 꾸몄다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> 그림 7. 생체 내에서 쥐의 등쪽 subicular 신경 세포의 반복 20 Hz에서 CR2 중심 급상승. (A) 시점 0, 30 일에 획득 한 요동 치고 빛 유발의 흔적을 전압은 60, 90, 120 분 녹화 시작 후. 삽입 된이 세포의 전형적인 파열 활동. (B) 빛에 의한 활성화의 61 반복 (2 분 간 시험 간격, 120 분 합계)를 표시 래스터 플롯. 각 유닛 활동은 점으로 꾸몄다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, &quot;optogenetics&quot;라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

18.9K 조회수.  University of Colorado Boulder.  유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다. 

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

연구

신경과학

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

마우스 좌골 신경에 생체 전기 생리 측정에서

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

매우 낮은 밀도에 대한 단순화 된 방법, 장기 차 해마 신경 세포 문화

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법

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