Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
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우리는 방법의 개발에 선도적 인 토론을위한 앤 마리 디온 - 코트 감사합니다. JK와 RB는 FQNRT 박사 학자이며, M.-MG는 바니 에르 CIHR 학자이며, J.-YM는 FRSQ 수석 연구원이다. 이 작품은 자연 과학 및 JY에 공학 연구 협의회에서 기금에 의해 지원되었다. M.

1. 재조합 배큘로 바이러스의 제조 배큘로 바이러스는 주로 단지 약간의 수정 제조자의 프로토콜에 따라 인비 트로겐의 바크 투 바크 배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 생성된다 : <ol><li> 수정 pFastBac1 벡터 (기브, 수명은) GST와 그의 - 태그 (그림 2)를 포함 만들었습니다. PET-52B (+) 벡터 (노바 젠)의를 다중 사이트 (MCS)는 10xHis 태그를 포함, pFastBac1 - 패 혈성-10xHis를 생성하는 pFastBac1 벡터의 MCS에 삽입했다. PET-52B (+) MCS 시퀀스는 5에서 BglII에 제한 사이트 &#39;말단과 3에서 HindIII의 제한 사이트&#39;말단을 추가를 XbaI 및 BlpI 제한 부위 사이에 증폭 된 PCR했다. PCR 생성물을 B​​amHI 및 다음 BglII에 제한 시퀀스의 호환성을 이용하여 제한 효소 BamHI과 HindIII로 pFastBac1의 제한 부위 사이에 클로닝 하였다. 목표는 표현을 허용 pFastBac1를 생성 할 때부터스트렙 타비 딘과 10xHis - 태그 재조합 단백질, PET-52B (+)의 BamHI로 제한 사이트는 MCS 시퀀스는 사용되지 않았다. 또한, XbaI의 제한 사이트는 이미 pFastBac1의 MCS 및 PET-52B의 MCS 삽​​입이 (+)의 사이트 사이에서 발생하는 제한 사이트의 중복을 피하기 위해 사용되지 않았습니다. PreScission 단백질 분해 효소 인식 부위 (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro)와 GST 코딩 순서는 다음 pFastBac1 - 패 혈성-10xHis에 삽입했다. 유전자 pGEX-6P-1 (GE 헬스 케어)에서 GST의 cDNA 서열은 PCR 각각 5에서을 NcoI 및 KpnI으로 제한 부위를 함유하는 프라이머 &#39;및 3&#39;말단으로 증폭 하였다. 을 NcoI 사이트는 개시 코돈의 첨가뿐만 아니라 GST에 알라닌을 허용한다. PCR 생성물이어서 스트렙 타비 딘 - 태그의 삭제 결과를 NcoI 및 KpnI으로 제한 부위 사이 pFastBac1-Strep의-10xHis로 클로닝 하였다. 이렇게 얻어진 새로운 융합 벡터 pFastBac1-GST-10xHis 지명되었다. </li><li> 홍보에 대한 cDNA를 코딩을 복제GST (N-말단)과 그의 태그 (C 터미널) 사이의 pFastBac-GST-10xHis 벡터에 관심 otein. C-말단 그의 태그와의 융합을 허용하는 cDNA를 정지 코돈을 제거 할주의하십시오. </li><li> E.에게 변환 (단계 1.2에서 얻은) 재조합 pFastBac와 대장균 DH10Bac는 백 미드를 생성합니다. 식민지 Bluo - 여자와 IPTG (10 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린, 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신, 12 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신, 100 ㎍ / ㎖의 Bluo을 함유 선택 접시에 30 ° C에서 37 ° C 몇 시간에서 하룻밤 성장 할 수 있도록 허용 여자, 40 ㎍ / ㎖의의 IPTG). </li><li> 선택과 화이트 표현형을 확인하기 위해 선택 접시에 (단계 1.3에서) 2 화이트 식민지를 restreak. </li><li> 10 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린, 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신, 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 단계 1.4에서 두 개의 흰색 식민지로하고 37 ℃에서 교반하면서 밤새 (250 RPM)를 물게을 포함하는 LB 2 ㎖를 접종 </li><li> 백 미드의 DNA를 정제하기 위해서는, 단계 1.5에서 박테리아 펠렛용액 300 μL 난에있는 세포를 재현 탁 및 솔루션 II 300 μL (퀴아 Maxiprep 키트)를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 품어 3 M KOAc이다 산도 5.5의 300 μl를 추가하고 얼음에 10 분 동안 품어. 4 ° C, 10 분 동안 최대 속도로 샘플을 원심 분리기. 상층 액에 이소프로판올 800 μl를 추가하고 얼음에 10 분 동안 품어. 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리하여 70 % 에탄올 500 μL로 펠렛을 씻으십시오. 펠릿 건조시켜 트리스​​ - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8.0의 40 μL의 멸균 조건을 재현 탁. 백 미드의 DNA는 4 ℃에서 보관해야 </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 설명 된대로 배큘로 바이러스를 생성합니다. 배큘로 바이러스는 빛으로부터 보호 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 재조합 단백질 발현 <ol><li> 정제를위한 가장 효율적인 배큘 선택할 및 단백질 발현의 피크에 도달 몇시 모니터하기 위해, 미니 감염 분석을 수행의는 다음과 같다 : 2 인 Sf9의 X 10 7 배큘로 바이러스의 133 μL (1 / 150)으로 (10 % FBS, 1 % P / S 보완) 그레이스의 미디어에있는 27 ° C에서 배양 된 세포를 감염 감염하십시오. 0, 24, 48에 1.5 ㎖를 분취를 수집하고, 72 시간 게시물 감염. 펠렛은 세포 및 안티 태그 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 그 단백질의 발현 수준을 분석한다. </li><li> 바이러스와 미디어 사이의 1 / 150의 비율로 미디어 500 ㎖에 ML 당 1.0 × 10 6 인 Sf9 세포를 포함하는 회 전자를 감염시키기 위해 2.1 단계에서 가장 효율적인 배큘로 바이러스를 사용합니다. 감염된 세포는 27 ° C에서 서스펜션의 성장과 최대의 단백질 발현 (위 2.1 단계에서 결정)에 도달하면 세포를 수확 할 수 있습니다. 펠렛 세포는 나중에 사용할 때까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 수용성 세포 용 해물의 제조 다음 배양 단계는 모두 가벼운 회전에서 4 ° C에서 수행됩니다. <ol><li> 를 Lyse SGST 결합 완충액 (150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.05 % 트리톤 - X-100, 1 ㎜ 250 ㎜의 염화나트륨의 최종 농도에 대한 PBS1X의 DTT, 및 단백질 분해 효소 억제제 ~ 20 ㎖에 관심 단백질을 발현 F9 세포 칵테일 (로슈). 빙수 욕에서, 다운스 균질 기, 초음파 처리 3X 30초 각 (70 % 출력)와 용액 20X 다운스 다시 20X를 다운스. </li><li> (선택 사항). DNA 또는 RNA의 오염을 제거하기 위해 4 ° C에서 30 분 동안 1 mM의 MgCl2를 2 7 클레아 제 (2.5 U / ㎖) 벤조 전체 세포 용 해물을 품어. </li><li> 4 ℃에서 30 분간 18,000 rpm으로 원심 분리기 뜨는을 유지합니다. </li><li> (선택 사항). 원심 분리기는 상층 액을 다시 4 ° C에서 18,000 rpm으로 30 분 동안 명확한 가용 해물를 얻을 수 있습니다. 막힘을 방지하기 위해 0.2 또는 0.45 μm의 필터를 통해 뜨는을 전달합니다. </li></ol> 4. GST 구슬에 단백질의 결합 <ol><li> GST 비즈 1 ㎖로 용해 세포 용 해물을 품어 (로 2 회 prewashedGST의 10 ㎖의 부드러운 회전에서 4 ° C에서 1 시간 동안 버퍼)를 결합. </li></ol> 의견 배양 시간은 단백질의 안정성과 결합 효율에 따라 최적화 될 필요가있다. <ol start="2"><li> 빠른 700 rpm에서 스핀과 결합되지 않은 단백질을 함유 뜨는을 제거 (이는 추가 분석을 위해 유지 될 수있다). GST 세척 버퍼 GST-결합 단백질 (그림 3B, 레인 1) 세척 (GST는 350 mM의 염화나트륨 마지막으로 버퍼를 바인딩). </li><li> 단계를 반복 4.2 배. 마지막 세척에서, 가능한 한 많은 뜨는을 제거합니다. </li><li> 열 충격 단백질 (8)의 비특이적 결합을 방지하기 위해 4 ° C에서 1 시간 동안 (10 ㎖ GST 바인딩 버퍼) 5 mM의 ATP, 15 mM의 MgCl2를 가진 구슬을 품어. GST 세척 버퍼로 구슬을 세 번 씻으십시오. </li></ol> 5. GST의 PreScission 분열 <ol><li> GST 비즈를 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 P5 버피와 GST 비즈를 씻어FER (50 mM의 NaHPO 4의 pH 7.0, 500 mM의 NaCl을, 10 % 글리세롤, 0.05 % 트리톤 - X-100, 5 mM의 이미 다졸). </li><li> 3 시간에 밤새 4 ℃에서 P5 버퍼 PreScission 효소와 GST-구슬을 품어 (100 μL의 분수 GST 비즈를 나누고 P5 버퍼 100 ㎕의 희석 효소의 4-8 단위 (2-4 μL)를 추가). </li></ol> 의견 PreScission 단계의 배양 시간은 분자량뿐만 아니라 단백질의 안정성에 따라 최적화 될 필요가있다. 열화가 관찰되는 경우,이 배양 시간 밤새 2 시간의 최소 대신에 감소 될 수있다. <ol start="3"><li> 빠른 스핀과 상층 액을 수집합니다. P5의 100 μl를 추가 한 후이 단계를 두 번 반복 구슬에 버퍼 및 모든 분수 (그림 3B, 레인 2) 풀. </li></ol> 코멘트 : 나머지 구슬 절단 효율성의 분석을 위해 사용될 수있다 (그림 3B </stroNG&gt;, 레인 3). 일반적으로, 단백질 70 ~ 80 %가 절단된다. 6. 단백질 결합 TALON 금속 친 화성 수지에 <ol><li> 1 ㎖의 3 분수에 위의 용출을 나누고 회전에서 1 시간 동안 (P5 버퍼로 2 회 prewashed) 100 ㎕의 발톱 금속 친 화성 수지 건조 구슬과 각을 품어. </li></ol> 코멘트 : 여러 분수 용출을 나누면 바인딩 / 세척 효율을 증가시킨다. <ol start="2"><li> P30 버퍼 (30 mM의 이미 다졸의 최종 농도로 P5 버퍼)와 수지 5 분을 씻으십시오. </li><li> 단계 6.2 배를 반복하여 하나의 튜브에 비즈를 풀. 마지막 세척하기 전에 가능한 한 많은 뜨는을 제거합니다. </li></ol> 코멘트 :이 TALON 바인딩 샘플 (그림 3B, 4 레인)에 해당합니다. 7. 정제 된 단백질의 용출 <ol><li> P5와 회전에서 5 분의 단백질 결합 TALON 수지를 품어00 버퍼 (500 MM의 이미 다졸의 최종 농도로 P5 버퍼). 버퍼 1:1 V / V의 구슬의 비율을 사용 (당신이 건조 구슬 200 μl를 촬영 한 경우 예를 들어, 당신은 P500의 200 μl를 추가해야합니다). 이 단계를 두 번 반복하고 개별적으로 각각의 용출 분획을 유지 (, 그림 (b), 5-7 차선), 용출 1 (E1)라는 이름의 용출 2 (E2 및 용출 3 (E3)). </li></ol> 의견 남은 비즈 용출 효율 (도 3b, 레인 8)의 분석에 이용 될 수있다. 전형적으로, 단백질 60 ~ 80 %가 전체에 용출된다. <ol start="2"><li> 쿠마시 블루 (그림 3B) 또는 시각화를위한 SYPRO 단백질 얼룩 SDS-PAGE와 얼룩에 표준 BSA 농도가 각 부분의 약 20 ~ 40 μl를로드하여 정제 된 단백질의 양과 질을 분석합니다. </li></ol> 코멘트 : 관심의 단백질은 또한 죽 검출 할 수있다항-GST 및 안티 그의 항체 (도 3C)를 이용하여 정제 절차 ughout. 8. 정제 된 단백질의 저장 <ol><li> 4 ℃에서 적절한 저장 버퍼에 대한 정제 된 단백질 (예를 들어, 20 mM 트리스 아세테이트 산도 8.0, 200 MM의 한국 공항 공사, 10 % 글리세롤, 1 mM의 EDTA, 0.5 mM의 DTT)을 Dialyze 그것은 투석 중에 정제 된 단백질의 침전을 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 일반적으로 교반 회전에서 4 ° C에서 1 시간 동안 2 배 dialyze. </li><li> 정제 된 단백질 (10 ~ 20 μL)의 작은 분취 량을 확인하고 30 분 동안 드라이 아이스에 냉동. -80 ° C에서 분취를 저장하고 여러 해동 / 냉동 사이클을 피할 수 있습니다. </li></ol>

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	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

여기에 제시된 GST - 그의 정화 프로토콜은 재조합 단백질의 크기의 넓은 범위의 정화를 위해 적당하다 : 우리는 성공적으로 리 RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), 불안정한 고 분자량의 단백질을 정제 리 슈만 편모충의 infantum : 리튬 BRCA2 (125kDa) 6.9. 또한,이 프로토콜을 사용하여 정제 된 단백질은 6 생화학 적 활성했다. 이 방법의 성공은 전적으로 목적 단백질...

재조합 단백질의 정제는 생화학의 근본적인 문제를 해결하기 위해 매우 중요합니다. 이온 교환 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피와 같은 단백질 정제의 통상적 인 방법은 각각 같은 그것의 등전점과 충전 또는 크기와 같은 표적 단백질의 물리적 특성에 의존한다. 후자 단백질 특성은 상당히 통상적 인 단백질 정제 전략 단백질 오염의 기회를 증가 단백질의 다양성에 의해 공유된다. 이 문제는 시간 소모적이다 체류 정화 컬럼의 사용으로 피할 수있다. 동시에, 후자의 크로마토 그래피 방법은 고가의 실험 구성을 요구한다. 대부분의 경우 태그가 관심의 단백질에 고유하므로 선호도 태그 정화가 강하게 대상 특이성을 증가시킨다. 최근 연구에서, 플래그 또는 HA-친화력 정화 널리 사용되어왔다. 기존 REC 대조적하나의 태그가 사용되는 ombinant 단백질 정제 프로토콜은, 우리는이 태그의 고유 한 조합을 설립. 우리의 방법은 양 원하는 단백질의 순도 사이의 최적의 비율에 대한 관심의 단백질의 C-말단의 N-말단과 그의 태그에서 GST-태그의 융합을 포함한다. GST는 글루타티온 세 파로스 구슬 정화에 매우 효율적이다 긴 태그 (29 kDa의)입니다. 또한, GST를 사용하여 우리의 방법 1의 비용 효율성을 보장합니다. (두 아미노산의 첨가의 결과로 인식 서열 LeuGluValLeuPheGln / GlyPro 가진) PreScission 효소와 GST를 절단 할 수있는 가능성은 많은 장점을 가지고 예를 들어, 이러한 전략은 알로 스테 릭 장애물로 인해 생리적 단백질 기능의 변경을 방지한다. 다른 단백질 말단에 융합 작은 그의 태그는 벽개 GST를 씻어 내고,뿐만 아니라 분해 단백질 및 기타에 의해 단백질 순도를 증가시키기 위해 제 정제 공정에 제공<html> 오염 물질. 그의 정화 단계의 열 (TALON 수지)에 GST 전환 할 때 또한 프로토콜은 투석 단계가 필요하지 않습니다. 이러한 정제 과정에서 일반 오염 물질은 열 충격 단백질 (HSP)이다. MgCl2를 ATP와 함께 인큐베이션 단계의 첨가는 이러한 오염물을 제거 (도 1)을 허용한다. 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 관심의 정제 된 단백질의 높은 수율을 생성하기 위해 고가의 장비에 의존하는 일반적인 기술이다. 우리가 여기에 존재하는 배치 정화 프로토콜은, 대조적으로, 수동이며, 고가의 악기 설정을 필요로하지 않습니다. 단백질의 높은 수율이 프로토콜을 확장하여 도달 할 수 있습니다. 동시에 일괄 정제 프로토콜, 용출 부피는 FPLC 또는 HPLC와 관련되지 않은 단백질의 농도를 향상시키기 위해 조정될 수있다. ntent &quot;&gt; 또, 일괄 GST-그의 정제 프로토콜 ~ 10-300 kDa의의 크기 범위를 가진 단백질을 정제 할 수있다. 큰 장점 중 하나는 하나가 동시에 여러 단백질을 정제 할 수 있다는 사실에 의해 주어진다 예를 들어, 야생형과 돌연변이 단백질 둘. 제시된 프로토콜의 성공은 전적으로 그 단백질의 발현 수준과 용해도에 의존한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.Coli &lt;/em&gt;DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I and II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 infected cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission enzyme</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace&#039;s infected medium supplemented</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum characterized</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose resin</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal GST-antibody</td><td>Production in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 6X-His-antibody</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (tight)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis bag (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2115217</td><td></td></tr></tbody></table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

체외에서 단백질의 생화학 적 특성에 대한 효소 학의 핵심 분석은 그 정제 된 단백질의 높은 농도를 필요로. 단백질 정제 프로토콜은 효율, 단순성 및 비용 효율성을 배합 한 것이다. 여기에서, 우리는 N-말단 글루타티온 세 파로스 태그 (GST) 2,3 모두 융합 C-말단 10xHis 태그 4를 기반으로 재조합 단백질에 대한 새로운 소규모의 친화력 정화 시스템으로 GST - 그의 방법을 설명 관심의 단백질. 후자의 구조는 단백질 발현을위한 5 인 Sf9 감염된 세포의 감염을 위해, 배큘로 바이러스를 생성하는데 사용된다. GST는 정화 효율을 보장하는 역할을 다소 긴 태그 (29 kDa의)입니다. 그러나, 단백질의 생리 학적 성질에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 후속 적으로 10 PreScission 효소를 사용하여 단백질을 분해한다. 최대 순도를 보장하고, 쪼개진 GST를 제거하기 위해 우리비교적 작은 그의 - 태그를 기반으로 두 번째 친 화성 정제 단계를 추가했습니다. 중요한 사실은, 우리의 기술이 따라서 저하 된 단백질을 제거하기위한 효과적인 도구이다 단백질의 양단 측면에 위치하고있는 두 개의 서로 다른 태그에 기초하고, 전장 단백질을 풍부. 여기에 제시된 방법은 FPLC 등 고가의 악기 설정을 필요로하지 않습니다. 또한, 우리는 열 충격 단백질 불순물과 핵산을 오염 폐지하는 핵산 분해 효소 처리를 제거하는 MgCl2를하고 ATP 세척을 통합. 요약하면, 플 랭킹이 다른 태그의 조합을 N-및 C-말단 및 태그 중 하나를 절단하는 기능을, 또한 고순도 및 전장 단백질의 회수를 보증한다.

GST-그의 정제 프로토콜의 효율을 예시하기 위해, 우리는 Rec14, S. 정제 32.9 kDa의의의 pombe 단백질. Rec14 cDNA를 각각 N-및 C-말단 (그림 1A)에서 GST - 그의 - 태그의 추가를 허용하는 우리의 수정 pFastBac1 벡터에 클로닝 하였다. 재조합 배큘로 바이러스는 다음 제조 및 단백질 발현을 위해 감염된 SF9 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. 수용성 세포 용 해물은 GST 비즈 배양과 결합...

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GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

본 프로토콜에서는, 고유 분해 가능한 GST-태그 및 그의 작은 태그를 조합하여 재조합 단백질의 정제를 허용하는 매우 효율적이고 비용 효과적인 소량의 단백질 정제 방법을 보여준다.

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

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41.6K 조회수.  Hôtel-Dieu de Québec.  본 프로토콜에서는, 고유 분해 가능한 GST-태그 및 그의 작은 태그를 조합하여 재조합 단백질의 정제를 허용하는 매우 효율적이고 비용 효과적인 소량의 단백질 정제 방법을 보여준다. 

비디오: GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

연구

생화학

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, the calcium (Ca2+)-permeable cation channel, transient receptor potential (TRP), binds tightly to the scaffold protein, inactivation-no-after-potential D (INAD), and forms a large signaling protein complex with eye-specific protein kinase C (ePKC) and phospholipase C&#946;/No receptor potential A (PLC&#946;/NORPA). However, the biochemical properties of the Drosophila TRP channel remain unclear. Based on the assembling mechanism of INAD protein complex, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous TRP channel. First, the purified histidine (His)-tagged NORPA 863-1095 fragment was bound to Ni-beads and used as bait to pull down the endogenous INAD protein complex from Drosophila head homogenates. Then, excessive purified glutathione S-transferase (GST)-tagged TRP 1261-1275 fragment was added to the Ni-beads to compete with the TRP channel. Finally, the TRP channel in the supernatant was separated from the excessive TRP 1261-1275 peptide by size-exclusion chromatography. This method makes it possible to study the gating mechanism of the Drosophila TRP channel from both biochemical and structural angles. The electrophysiology properties of purified Drosophila TRP channels can also be measured in the future.

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Based on the assembling mechanism of the INAD protein complex, in this protocol, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous Drosophila TRP channel.

내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Strategies for Expressing and Purifying Solute Carrier Transporters

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

저자 스포트라이트: Expression and Purification of Human Solute Carrier Transporters Using Codon-Optimized Genes 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

면역학 및 감염병학

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

생물학

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

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구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

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작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제