이 프로토콜에서는 전기 생리학적 특성을 연구하고 전장 초파리 TRP 채널의 구조 정보를 얻는 데 필요한 첫 번째 단계인 정제된 전장 TRP 채널을 얻기 위한 정제 과정을 시연합니다. INAD 단백질 복합체의 샘플링 메카니즘에 기초하고 훨씬 더 높은 용량의 저가의 니켈 비드를 사용하여, 충분한 양의 TRP 채널이 플라이 헤드로부터 정제될 수 있다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자 인 Yuyang Liu가 될 것입니다.
먼저, 염화칼슘 열충격 형질전환 방법을 이용하여 pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 플라스미드를 E.coli BL21 세포로 형질전환시킨다. Luria Bertani 배지 10 밀리리터에 단일 식민지를 접종하고 섭씨 37도에서 밤새 자랍니다. 10 밀리리터의 시딩 배양물을 Luria Bertani 배지 1 리터에 넣고 섭씨 37도에서 배양하십시오.
세포의 광학 밀도가 0.5에 도달 한 후 세포를 섭씨 16도까지 냉각시키고 0.1 밀리몰 이소프로필 - 베타 -D-1- 티오갈락토피라노사이드를 첨가하십시오. 과발현 후, 원심분리에 의해 배양된 세포를 한 리터 펠릿하고, 40 밀리리터의 포스페이트 완충 식염수에 재현탁시켰다. 재현탁 된 세포를 고압 균질 기에 넣고 섭씨 네 도까지 미리 냉각하십시오.
천천히 호모게나이저 압력을 800 bar로 증가시킨다. 입구 탭을 열고 재현탁 된 셀이 좁은 슬릿이있는 밸브를 원형으로 통과하도록하십시오. 글루타티온 비드 5 밀리리터를 중력 흐름 컬럼에 적재하고 50 밀리리터의 인산염 완충 식염수 완충액으로 비드를 총 세 번 세척하십시오.
48, 384배 G.에서 고압 호모게나이저로부터 세포 용해물을 원심분리하고, 원심분리된 세포 용해물의 상등액 약 40 밀리리터를 중력 유동 컬럼 내의 평형화된 글루타티온 비드에 첨가하고, 섭씨 4도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 글루타티온 비드를 10분마다 재현탁합니다. 30분 동안 인큐베이션한 후, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 관통 분획을 분리하였다.
유동 분획을 버리고, 나머지 글루타티온 비드를 50 밀리리터의 인산염 완충 식염수 완충액으로 두 번 헹구십시오. 글루타티온 비드에 15 밀리리터의 용출 완충액을 첨가하고, 10분마다 비드를 재현탁시킨다. GST 태그가 지정된 TRP 1261-1275 단편을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 크기 배제 컬럼에 로딩한다.
튜브 당 다섯 밀리리터의 용출된 단백질을 수집하고, 냉장 원심분리기의 한외여과 스핀 컬럼에서 원심분리하여 정제된 단편을 하나의 밀리리터로 농축시킨다. His-tagged NORPA 863-1095 단편을 정제하려면 니켈 비드를 사용하여 이전에 입증된 절차를 따르십시오. 성인 파리를 50 밀리리터 원뿔형 원심 분리 튜브에 모으고 액체 질소에서 10 분 동안 동결시킵니다.
얼어 붙은 튜브를 손으로 격렬하게 흔들고 혼합물을 순차적으로 쌓인 세 개의 미리 냉각 된 스테인레스 스틸 체로 옮깁니다. 체를 흔들고 브러시를 사용하여 40 메쉬 체에서 플라이 헤드를 닦아냅니다. 다섯 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮겨 영하 80도에 보관하십시오.
미리 냉각 된 모르타르와 유모차를 사용하여 액체 질소에서 0.5 그램의 머리를 균질화하십시오. 균질화된 헤드를 5밀리리터의 10X 용해 완충액에 용해시키고, 섭씨 4도에서 20, 817배 G에서 20분 동안 원심분리하였다. 스핀 다운 상청액을 섭씨 4도에서 60분 동안 100, 000배 G로 더 원심분리한다.
중력 흐름 컬럼에 니켈 비드 1 밀리리터를 넣고 섭씨 4도에서 이중 증류수 10 밀리리터로 비드를 세 번 씻으십시오. 구슬을 섭씨 네 도에서 세 번 10 컬럼 부피의 용해 버퍼로 평형화하십시오. 500 마이크로리터의 600 마이크로몰 정제된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단백질을 니켈 컬럼에 첨가하고, 컬럼을 인큐베이션한다.
10 분마다 구슬을 재현탁하십시오. 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 스루 분획을 분리하고, 니켈 비드를 10 밀리리터의 냉 용해 완충액으로 세척한다. 그런 다음 Drosophila head homogenate의 차가운 상청액을 니켈 컬럼에 첨가하십시오.
인큐베이션 후, 비드를 10 밀리리터의 용해 완충액으로 세척하고 500 마이크로리터의 600 마이크로몰 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단백질을 비드에 첨가한다. 중력 컬럼으로부터 용출된 분획을 수집한다. 니켈 비드를 10 밀리리터의 결합 완충액으로 씻으십시오.
그런 다음, 용출 완충액을 첨가하고, 중력 유동 컬럼으로부터 용출 분획을 수집한다. 초파리 TRP 채널 정제로부터 용출된 분획을 네 밀리리터 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 농축한다. 샘플을 크기 배제 컬럼에 주입하고, 합리적인 유속으로 단백질을 용출시킨다.
GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 E.coli 세포에서 발현시키고, 글루타티온 비드 및 크기 배제 컬럼을 사용하여 정제하였다. 유사하게, His-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 니켈 비드 및 크기 배제 컬럼을 사용하여 발현되고 정제되었다. 용출된 TRP 채널은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과도한 GST 태깅된 TRP 1261-1275 펩티드로부터 분리된다.
부산물로서, INAD, ePKC, NORPA 863-1095 복합체는 TRP 1261-1275 펩티드 경쟁 후에 수득된다. 이 프로토콜을 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 액체 질소에서 플라이 헤드를 균질화하고 DDM이라는 세제를 함유 한 완충액에서 균질액을 해결하는 것입니다. 이 절차에 따라, 우리는 또한 조립 및 조절 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 전체 INAD 단백질 복합체를 정제 할 수 있습니다.
이 방법의 잠재적 인 향후 적용은 Cryo-EM 기술을 사용하여 내인성 초파리 TRP 채널의 구조 정보를 연구하는 것입니다. 또한, 인공 이중층 지질막에서 정제된 내인성 초파리 TRP 채널의 전기생리학적 특성을 측정하는 것도 실현 가능하다.
