도움의 의견과 건설적인 조언을 세 익명의 검토에 대한 기술 지원을위한 윌리 일 박사 크리스 Gellynck을 부탁드립니다. 이 작품은 Sunnybrook 청각 재생 이니셔티브에 의해 투자되었다

마우스 조직을 유지 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 동물 관리 지침에 캐나다위원회에 따라 안락사 쥐 12 -reporter SOX2 EGFP에서 수확했다. 1. 배양 배아 Cochleae <ol><li> DMEM 8.89 ml의 소 태아 혈청 1 ㎖ (FBS), 100 × N2 보충제 100 ㎕, 및 / ㎖ 시프로플록사신 10 ㎎의 10 μl를 혼합하여 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 보충. 100 % HEPES 5 ㎖와 함께 495 ㎖의 HBSS를 혼합하여 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)을 보충. </li><li> 유리 바닥 배양 접시를 준비합니다 : <ol><li> 층류 후드에서 5 ㎖의 DMEM 200 ㎕의 막 대형 추출물 기판을 재현 탁. 10mm 우물에 35mm 직경의 유리 바닥 문화 요리를 준비합니다. 각 유리의 센터에 피펫 150 μL 기판 / DMEM는 접시를 바닥. 이들 접시는 40 분 인큐베이션 후에 사용되거나, CO (2)에 기록되어있다 </sub&gt; 적어도 일주일 동안 35 ° C에서 인큐베이터. 참고 : 요리의 기본은 투명하고 이미지에 적합 함을 보장하기 위해, 잘 외식 결국 쉽게 찾을 지역에 정착 할 수있는 요리의 중심에를 만들려면 유리 요리는 다음과 같은 이유로 사용되는 바닥 그래서 실험 후의 샘플을 면역 염색 이후의 분석을 위해 처리 될 수있다. </li></ol></li><li> 워크 스테이션 및 도구를 준비합니다 : <ol><li> 층류 클린 벤치를 켜고 깨끗한 작업 공간을 만들기 위해 70 % EtOH로 다운 스프레이. 70 % EtOH로에서 (에이전트 (1 부) 및 숯 분말 (2.5 g)을 경화 (184) 실리콘 엘라스토머 (10 부)의 혼합) 집게, 숟가락, 검은 184 실리콘 엘라스토머 요리를 만끽 해보세요. </li></ol></li><li> 깨끗한 워크 스테이션에서, 실험 수확 배아. 차가운 HBSS 1 % HEPES와 보충 얼음의 적절한 임신의 배아를 수집합니다. <ol><li> 시연 외부 또는 눈에 보이는 기관을 결정리포터 활성 및 형광 실체 현미경을 이용하여 배아를 조사. 실험 대상은 이들과 같은 1 % HEPES로 보충되어 차가운 HBSS 얼음 리포터 활성을 나타내는 배아를 수집. </li></ol></li><li> 시간적 뼈를 수집 : <ol><li> 멋진 광원 및 미세 집게를 사용하여 신속하게 작동, 새끼의 머리를 수집합니다. 시간적 뼈의 손상을 방지하려면 경추에서 턱 아래에 클립주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 두개골을 엽니 다. 뇌를 제거 머리의 앞을 트림, 깨끗한 접시에 1 % HEPES와 보충 신선한 얼음 차가운 HBSS에 후방 두개골을 전송합니다. 조심스럽게 전술에 전정 시스템을 유지하기 위해주의하면서 땅콩 모양의 시간적 뼈를 해부. </li></ol></li><li> 달팽이관을 해부 : <ol><li> 차가운 HBSS 1 % HEPES와 보충 얼음에 검은 색 실리콘 엘라스토머 코팅 접시에 시간적 뼈를 이동시켜 뼈의 전정 부위를 고정. 에 곤충 핀을 삽입측두골을 안정시키고 집게를위한 공간을 만들기 위해 경사 각도. 측두골는 그것이 그대로 달팽이관을 수확하는 것은 매우 어렵다 너무 많이 이동시킨다 것처럼 피닝 공정에서 중요한 단계이다. </li><li> 조심스럽게 달팽이관을 둘러싸고있는 연골을 제거합니다. 달팽이관의베이스의 바깥 쪽 가장자리에있는 연골에 포셉 한 가지를 넣고 연골에 구멍을 클립. </li><li> , 측면 플랩을 클립 집게의 가지를 넣고 부드럽게 연골에서 덕트의 지붕을 분리합니다. 대각선 위쪽과 가로로 클립, 조심스럽게 캡슐의 앞 부분을 들어 올립니다. 나머지 연골과 덕트 사이에 집게의 단자를 삽입하고 부드럽게 마지막 부분을 클립. 달팽이관의 꼭대기의 표면은 지금 노출되어있다. </li><li> 기본에서 시작, 덕트의 지붕은 인공 와우 상피에 맞는 영역을 잡아 인공 와우 덕트를 엽니 다. 조심스럽게 트리밍, 지붕을 벗겨필요한 경우이를 완전히 제거 될 때까지. 덕트의 내측에 남아있는 멤브레인의 어떤 부분을 잘라냅니다. 초과 중간 엽 조직의 덕트를 청소하고 전정 시스템에서 덕트를 분리합니다. </li></ol></li><li> 문화 외식 : <ol><li> 신중하게, 기판 코팅 유리 바닥 배양 접시의 중앙에, 절편, 내강 표면이 위로 가게 모든 액체를 그리는 2 분 동안 둡니다. 그것을 방해하지 돌보는 DMEM 드롭 현명한 절편을 보충 150 μl를 추가합니다. 절편, 무료 떠 집게로 위치를 변경하지만, 기판에 부착 할 수 있도록 절편은 접시의 바닥에 침전 있음을주의해야한다. </li><li> 습도를 유지하기 위해 멸균의 작은 접시로, 깊이 12cm 직경 페트리 접시에 유리 바닥 요리를 놓습니다. 하룻밤 절편이 기판에 부착하고 평평하게하기 위해서는 35 ° C의 배양기에 문화를 넣습니다. </li></ol></li></ol> 2. 라이브 IMAGING <ol><li> 절편 샘플을 선택합니다. 각 외식 달팽이관의 상태를 평가하기 위해, 형광 실체 현미경을 사용한다. 덕트가 손상되지 및 삼각 형상에베이스에서 유리에 부착 된 경우에만 외식을 선택합니다. </li><li> 문화 인공 조직에 5 % CO 2와 35 ° C에서 인큐베이터를 설정합니다. 인큐베이터 현미경으로 문화를 넣어 : <ol><li> 조심스럽게 보충 DMEM을 대기음 적어도 500 μL 신선한 용지로 교체합니다. 육일까지 이미징, 1.5 ml를 더 좋다. 이식편이 느슨하게 부착되는 경우에, 접시의 가장자리 주위 미디어 링 피펫. 이 매트릭스에 부착 계속하면서 여분의 액체가 절편을 방해하지 않고 소형 &#39;가습 실&#39;을 만들 것입니다. <ol><li> 또한, 사용 시약 이미지 컬렉션 사이의 간격 동안 교환 할 필요가있는 경우 요리는 현미경에서의 피팅에 체류하는 동안 요리가 뚜껑을 엽니 다 커버 힌지. 힌지 접시 덮개는 덮개가 될 수 있도록샘플을 방해하거나 설정에서 요리를 제거하지 않고 열었다. 이 이후의 이미지 캡처에 대한 자신의 정확한 위치를 유지합니다. </li></ol></li><li> 샘플 접시 홀더에 적절한 샘플을 포함하는 유리 바닥 요리를 삽입합니다. 이 예에서 현미경 여덟 35mm 샘플 요리를 보유하고 회전 플랫폼을 가지고있다. </li><li> 층류 후드에서 유리 뚜껑 플라스틱 뚜껑을 교체하고 샘플 접시 홀더에 요리를 삽입합니다. 접시의 바닥에서 외식을 제거하거나 미디어를 방해하지 인큐베이터 돌보는 내부의 샘플 접시 홀더를 놓습니다. </li></ol></li><li> 영상 루틴을 설정합니다 : <ol><li> 현미경, UV 램프 및 카메라 스위치 및 이미징 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> , 샘플을 찾아 순서대로 각각의 요리에 대한 노출 시간을, 이미징 영역을 선택 초점면과 조정합니다. 초점은 시작시 절편의보기에뿐만 아니라 따라 평면을 선택하지만, 알그래서 조직을 이동하는 방법과 시간 경과를 실행할 시간을 명심. </li><li> 형광 채널에서 선택된 초점면을 중심으로 Z 스택을 설정합니다. 실험의 샘플링 주파수와 길이를 설정합니다. 샘플링 주파수는 영상을 수집하는 데 걸리는 시간에 의해 제한되므로,이보기의 필드를 선택하고 Z 스택을 설정 한 후 결정되어야한다. 이 경우 샘플링 다섯 일 동안 30 분마다 일어난다. 실험 기간은 최대 14 일 수있다. </li></ol></li><li> 동영상을 생성합니다 : <ol><li> 시간 경과 기간의 끝에서 이미지 파일을 연다. 순차 수집 포인트를 열어이 경우 MetaMorph로부터 소프트웨어가 사용된다. 프레임별로 관심의 세포 인구를 표시하기위한 최적의 초점면을 선택합니다. </li><li> .avi 파일에 이러한 변환 이미지, 또는 여러 예측에 개방되고 분석 이미지 처리 소프트웨어 또는 전환 될 수있는 이미지 세트를 생성하는 몽타주로 내보낼영상 처리 소프트웨어를 사용하여 TS. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture.">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li><li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+for+canonical+Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea.">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li><li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

문화가 설립 장기 이미징 위해 시간 경과 현미경을 설정하는 경우 고려해야 할 몇 가지 기술적 인 점이있다. 우리는 인공 이식편을 배양 기재로서 기저막 매트릭스를 사용하지만, 기판은 세포 유형에 매칭되어야한다. 예를 들어, 이미지의 연결을 문화, 그것은 피브로넥틴 코팅을 제공하는 것이 더 좋을 수도있다. 항온 처리 온도 및 가스 조성은 또한 조직의 종류에 따라 선택...

포유류 달팽이관 주문한 높은 복잡한 기관이다. 마우스에서 출생 초기 단계에서 귀의 날 E11에 소포 및 개발 프로그램의 완성에서 원시적 인 내이의 출현 사이에, 세포 신호의 여러 파도와 유전자 발현 조정 변화가 일어난다. 인공 와우 덕트의 삼각 형상에베이스에서 실행하면 코르티 감각 상피, 또는 기관을 검출하는 소리입니다. 코르티 기관의 발전 절묘하게 개발 단부함으로써, 내측 유모 세포의 단일 행으로 구성된다되도록 제어되는, 외부 모세포 3 열의는지지 세포의 다섯 열 (기둥 셀의 두 행, 세 산재 Deiters &#39;셀의 행) 1. , 청력 손실을 기원하고 감각 epithemlium 2의 패턴이 적힌 studye의 중요성을 heighlighting이 정확한 순서로 결과에서 편차. 배아 마우스 COCH의 체외 배양에서레아는 코르티 기관의 발전의 메커니즘을 연구에 필수적인 도구입니다. 이 기술은 1974 년에 설립되었으며, 지난 40 년 동안, 감각 상피 지정 및 코르티 기관 (3)을 설립하는 메커니즘의 많은 것을 해명하는 데 사용되었습니다. 달팽이관은 동적 발달 과정과 복잡한 기관이다; 칠일 1 명시하는 등의 조작은 오래 걸릴 수 있습니다. E13에 인공 이식편 배양에 GSK 3β의 억제제를 추가 할 때 예를 들어, 최적의 잠복기는 화합물의 강력한 효과 육일 4 관찰. 개발 달팽이관의 라이브 영상은 코르티 기관의 형태의 변화로 조사를 할 수 있습니다, 유전자 발현의 변화, 이주의 추적 증식 또는 세포를 죽어가는, 그리고 실시간 제약 에이전트의 결과 관찰 및 신호의 중단을 할 수 있습니다 경로. 지금까지 달팽이관의 영상을 살고주로 단시간 5-8 위에 코르티 기관의 화상 작은 영역에 공 초점 현미경을 사용하여 수행하지만,이 기술은 이식편 생존력으로 인해 한계가있다. 느린 발달 과정에 장기간 조작의 효과의 촬상에서는, 촬상 환경이 매우 중요하다. 일반적으로 공 촛점 라이브 영상 시스템은 현미경에 앉는 가습 플라스틱 상자를 사용한다. 열 및 습도는 대물 또는 광원으로는 힌지 결합 된 개구를 통해 상기 microscope-의 다양한 부분 주위에 갭을 통해, 상기 액세스 창을 통해, 현미경 테이블을 충족 배양 상자의 간극을 통해 빠져 나갈 수. 이 이상의 2-3 일 건강한 이식편을 유지하기위한 최적이 아니다. 우리는 표준 CO 2 인큐베이터 안에 봉인 거꾸로 현미경보다는 현미경 중심으로 인큐베이터 &#39;인큐베이터 현미경&#39;을 정의합니다. 인큐베이터 현미경 전실험의 수명 경향 오히려 2-3 일 이상 촬상보다는 샘플 최대 2 주 동안 묘화 될 수 있도록. 인큐베이터 현미경은 문화와 표준 제어 조건을 절편하기 위해 최소한의 방해로, 세포의 성장과 분화를위한 훌륭한 환경을 제공합니다. 여러 날에 걸쳐 수행 될 연구에서는 인큐베이터에서 제거하고 거꾸로 형광 현미경을 수행하여 매일 영상 샘플에 의존하는 것이 일반적이다. 이 방법을 사용할 수 있지만, 인큐베이터에서 요리를 제거하면 민감한 개발 조직에 스트레스를 입 힙니다. 때문에 인큐베이터에서 제거에 온도에서 배양 매체와 변동 산도의 변화는 차선의 개발과 건강하지 못한 조직이 발생할 수 있습니다. 동일한 초점 평면에서 모든 시점에서 동일한 방향으로 동일한 영역을 이미징하는 것은 매우 어려운 것이다. 인큐베이터 내에서 자동화 된 시스템을 사용함으로써, 건강하게 유지할 수있다티슈는 더 시점에서 영상을 수집하고 동일한 영역이 매 프레임에서 캡처되도록. 최근에는 여러 개의 집적 현미경 조직 인큐베이터가 개발되어 임상 적으로 이들 9뿐만 아니라 줄기 세포 연구 및 암 (10,11)에서뿐만 아니라 유용했을. 여기에서 우리는 배아 마우스 와우 외식의 장기간의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시한다. 우리가 설정된 시점에서 다중 샘플의 이미지를 캡쳐하기위한 능력을 가진 표준 CO 2 인큐베이터 안에 자동화 현미경 시스템을 사용한다. 이 시스템은 인큐베이터 안에 설정 거꾸로 현미경으로 구성되어 있습니다. 샘플은 각 시점에서 다중 샘플의 이미징을 허용 회전 단상에 위치한다. 조명, 촬영, 및 연단의 회전 MetaMorph로부터 소프트웨어를 통해 운영 시스템에 의해 자동 제어된다. 운영 소프트웨어를 이용하여 촬상 루틴을 설정함으로써, 우리는 TW까지 동안 작동 실험을 설정할 수간섭을 최소한으로 줄이고 O 주. 이 예에서 우리는 특별히 큰 규모의 성장과 달팽이관의 재 배열하고, prosensory 영역을 보여 모두 시야 및 형광을 사용합니다. 이 실험에서, cochleae는. 배아 일 E13에 SOX2 EGFP 리포터 생쥐 해부한다 체외 배양이 설정됩니다 다음 오일을 통해 몇 군데.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
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		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

여기에서 우리는 살아있는 배아 마우스 와우 외식의 장기 시간 경과 이미징을위한 방법을 제시한다. 약 10 일 동안 포유류의 달팽이관 진행의 높은 주문, 복잡한 구조를 구축하기위한 책임을 발달 프로그램. 이 기간 동안 유전자 발현의 변화 및 ​​약제 학적 또는 유전자 조작에 대한 반응을 연구하기 위하여, 장기간의 영상이 필요하다. 이전에는, 라이브 영상은 전형적 표준 현미경 꼭대기 가습 실 내에 이식 된 조직의 생존 능력에 의해 제한되었다. 습도와 온도에 관해서는 배양 성장을위한 최적의 조건을 유지하는데 어려움 이미징 실험의 길이에 제한을 두었다. 수정 된 조직 문화 인큐베이터에 통합 현미경 장기-라이브 영상을위한 훌륭한 환경을 제공합니다. 이 방법에서 우리는 배아 마우스 와우 외식을 설정하는 방법과 시간 경과 imagi를 수행하는 인큐베이터 현미경을 사용하는 방법을 보여잉 오일 위에 전형적인 배아 일 (E) (13)와 인공 이식편 SOX2, 달팽이관의 prosensory 세포 마커의 거동을 조사 시야와 형광 현미경을 모두 사용.

여기에서 우리는 몽타주 (그림 1)과 E13.5에 도금하는 경우 일반의 Organotypic 인공 절편이 성장하는 방법을 보여주는 동영상 (그림 2)를 보여줍니다. SOX2 리포터 마우스 prosensory 영역을 시각화하는데 사용되었다. 영화는 달팽이관이 성장과 통합 및 확장을 겪는 것으로 보여, 녹색 SOX2 도메인의 측면 지역에서 세포는 확장 주변 조직으로 분할하지 않는 것. 이 코르...

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K 조회수.  Sunnybrook Research Institute.  손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다. 

비디오: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

연구

신경과학

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

자유롭게 행동 하는 쥐에 장기 감각 충돌

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

초파리 뉴런 개발시 빠른 수지상 분지 역학의 시간 경과 라이브 이미징 및 정량화

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

통가 경사진 마우스 망막의 장기, 세럼 없는 재배는 그대로 망막 색소 상피와 함께 익스처스

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...