LMW 및 RHK는 생명 과학 및 엔지니어링 (GSBSE)의 UMaine의 대학원에 의해 지원됩니다 RHK는 메인 농업 및 산림 실험 역에 의해 지원되었다. 추가 자금은 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIH P20-GM103423), 메인 농업 및 산림 시험장 (허가 번호 ME08004-10, JAG), 타이드 센터 (NSF 그랜트 # 1,008,498)를 상승 메인 ADVANCE의 대학에 의해 제공되었다 및 PhRMA 재단 (JAG)에서 약리학 / 독성학의 연구 스타터 부여합니다. 우리는 Drs에 감사드립니다. 항원 세포 데이비드 Holowka와 바바라 베어드. 우리는 히나 Hashmi, 알레한드로 벨 레즈, 장비 및 명령에 대한 도움말 앤드류 Abovian에 감사합니다. 이 메인 농업 및 산림 시험장 간행물 번호 3311입니다.

우리는 공개 아무것도 없어.

2004 년,이 NaAl 등. 1 탈과립의 높은 처리량 테스트를 위해 비만 세포 바이오 센서를 개발했다. 그것은 우리가 우리의 TCS 연구에 대한 적응이 비디오에 설명 한 강력한 분석이다. 이전이 NaAl 등에 1. 분석은 비만 세포의 탈과립은 정기적으로 β-헥 소사 미나 59-61 통해 평가하지만, 이러한 초기의 방법은 하나의 샘플을 한 번 읽은하는 형광 분석기를 이용하고 있었다. 중요한 것은...

비만 세포는 높은 천식의 주요 매개체 역할을 면역 효과기 세포, 알레르기, 기생충 방어 및 발암 13-16 알갱이 있습니다. degranulate을 활성화 때까지 안전하게 세포질 과립에 알레르기와 염증 매개을 저장할 위치를 그들은 거의 모든 혈관 조직 15에 있습니다. 탈과립은 히스타민, tryptase 및 류코트리엔 15와 같은 약리학 적 활성 중재자의 릴리스에서 결과 막 바인딩 된 과립의 exocytosis에 있습니다. 유형의 시작이 처리 결과 I 기생충에 대한 방어를 장착뿐만 아니라 알레르기 천식 및 발암 응답하기 15 시작의 중요한 과민 반응. 비만 세포와 호염기구는 FcεRI 수용체 면역 글로불린 E (IgE에) 17의 높은 친화력 수용체를 표현한다. 알레르겐 또는 항원에 노출 여러 IgE에 결합 FcεRI 수용체 17의 집계를 발생하고,이 s의티로신 인산화 이벤트, 내부 상점에서 포스 C, 칼슘 유출의 활성화 및 세포 18에 칼슘의 유입의 폭포 : 탈과립 프로세스를 시작 IgE에 결합 구단 수용체의 &quot;가교&quot;오 -라고. 이 칼슘 유입 탈과립을 위해 필요하며, 더욱, 과립 exocytosis에 15을 초래하기 전에 막으로 과립 융합을 알립니다. 실험적으로, 칼슘 이온 운반체 상류되거나 하류로 독성 물질에 의해 경로 대상의 식별을 허용, 직접 기본적으로 모든 신호 전달은 칼슘 유입 20 단계 이전 단계를 거치지 세포막을 19 일에 걸쳐 셔틀 버스 칼슘을 사용할 수 있습니다 칼슘은 20 신호. 탈과립은 히스타민 6 함께 과립에서 선형 적으로 해제 세포의 상층 액을,에 β-헥 소사 미나의 방출을 모니터링하여 신속하고 효율적으로 측정 할 수 있지만 난의 훨씬 쉽게 분석 형광 제품에 대한 간단한 효소 기질 반응 및 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 감지합니다. 같은 프로토콜 절에 자세히 설명이 마이크로 분석은에 의해 β-형광 기판의 절단 4 methylumbelliferyl-N-아세틸-β-D-glucosaminide을 정량화 원래이 NaAl 등에 의해 개발. 강력한 방법 1을 기반으로합니다 헥 소사 미나. 트리클로산은 여기에서 강조와 함께 우리는 약물과 독성 물질의 테스트 효과 분석을 수정했습니다. 이 방법은 신뢰성 탈과립을 정량화 예를 들어, 유세포 기반의 탐지 방법 21에 저렴한 대안입니다, 안티 - 알레르기 약물의 다양한 높은 처리량 검사에 잘 자신을 빌려 잠재력을 가지고뿐만 아니라, immunotoxic 또는 극성 물질. 이 마지막 점은 21 세기 2007 년 국립 연구위원회 보고서 &quot;독성 시험에 비추어 특히 중요하다 : 비전과 스트랫EGY &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> 는 마우스와 같은 전통적인 실험 동물의 비용 사용을 줄이기 위해 세포 배양을 활용 높은 처리량 독성 시험의 개발을지지한다). 이 NaAl 등 1.가 개발하고 우리 2로 수정 탈과립 프로토콜은, 상동 인간의 점막 비만 세포 나 호염기구에 3-5 잘 받아 들여진 모델 RBL-2H3 세포 라인을 사용합니다. (배양 RBL-2H3 세포에 대한 방법은 허친슨 등에 자세히 설명되어 있습니다. 22). 이 분석 가능성이 장착 된 비만 세포 유형에 적용 할 수 있습니다. 트리클로산 (TCS)는 병원, 개인 배려 제품, 소비자 제품 23,24에서 30 년 이상 사용되어왔다 광범위한 스펙트럼 항균이다. TCS의 항균 특성에 대한 행동의 모드는 억제 enoyl-아실 의한 것으로, 지방산 생합성의 억제입니다운반 단백질 환원 25,26. 이 같은 샤워 젤, 핸드 로션, 치약, 양치질, 0.3 % 또는 10 mM의 최대 24 농도에서 손을 비누와 같이 가전 제품의 넓은 범위에서 세계적으로 발견된다. TCS의 대폭적인 사용은 인간 27-29의 강과 하천 (30)에 검출 수준 귀착되었다. Allmyr 등에 의해 수행 연구. 27 TCS와 그 대사 산물이 혈장과 모유로 기르는 어머니의 우유 모두에 존재하는 것을 보여 주었다. 중요한 것은, TCS는 쉽게 피부에 31-37로 흡수된다. Queckenberg 등. 37 비만 세포가있는 피부에 상당한 농도의 결과, 12 시간 이내에 인간의 피부에 ~ 70 밀리미터 TCS 크림 ~ 10 %의 흡수를 발견했다. TCS는 인간의 알레르기 성 피부 질환 7-11을 관리하기 위해 임상 적으로 표시되었지만, TCS는 알레르기 성 피부 질환을 완화하는 메커니즘은 38 알 수있다. 형광 마이크로 플레이트 분석 detaile를 사용하여D는이 비디오에서 우리는 최근에 2 μM의 낮은 농도 TCS는 크게 이러한 임상 데이터 2에 대한 잠재적 인 설명을 제공하는 비만 세포 기능과 탈과립을 꺾는 것을 보여 주었다. 이러한 임상 데이터에 대한 설명을 제공 할뿐만 아니라, 파머 등 우리의 연구 결과는. 2 TCS 칼슘 유입의 하류 신호 분자 표적으로하는 것이 좋습니다. 많은 면역 및 기타 생물 학적 과정에 신호 칼슘의 중요성으로 인해, TCS는 잠재적으로 필요한 생물 학적 과정의 다양한에 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 사실, Udoji 등. 39 TCS는 또 다른 중요한 타고난 면역 기능, 인간의 자연 살해 세포의 세포 용해 활성을 억제 것으로 나타났다. 알레르기 성 피부 질환 (또는, 반대로, immunotoxicant 등)의 치료 원조로의 잠재력을 넘어, TCS는 장애 물질 40-49 내분비 할 수 있습니다. 따라서, 용액이 화학 물질을 준비하는 방법에 대한 명확한 절차 I독성 학자의 관심의. TCS는 작은 소수성 분자이기 때문에, 유기 차량은 종종 물에 용해성하기 위해 사용됩니다. TCS가 테스트되었습니다 가장 독성 연구에서, 준비는 에탄올, 아세톤 또는 석유 2,50,51 등의 유기 용매의 도움으로 물에 용해를 포함하고있다. 그러나 종종 이러한 용매 번하여 테스트 화학 물질 데이터를 51의 해석을 복잡하게, 자신 생물학적으로 활성 상태입니다. 사실, Rufli 등에 따라. 52 등 53, 그것은 수생 독성 실험을위한 테스트 솔루션은 독성 아티팩트를 생성하는 화학 용제의 가능성으로 인해, 화학적 방법을 통해 물리적 인 방법을 사용하여 준비하는 것이 좋습니다. 우리는 이전 TCS는 0.24 % 에탄올 / 물 (권 / 권)에 녹여 30 분 꺾 RBL 비만 세포의 탈과립 2 초음파 것으로 나타났습니다. 0.24 %보다 높은 농도의 에탄올 비만 세포 degra을 저해하는 표시되었습니다nulation 54,55 - 예 독성 연구에서 유기 용제의 잠재적 인 혼란 함을 주죠 효과. 뿐만 아니라 그것은 생물체 또는 연구에 사용되는 세포에 대한 용매의 영향을 고려하는 것이 중요하지만, 또한이 시험 화학 물질 자체에 용매의 효과를 모니터링하는 것이 중요합니다. 예를 들어, Skaare 등. 51 기름에 용해 함수의 완전한 손실이 발생하면서 폴리에틸렌 글리콜의 TCS를 (일반적으로 치약 및 구강에서 발견) 용해하는 건강한 여성 여성 안티 박테리아 및 안티 플라크 효과를 약화 것으로 나타났습니다. 따라서, 다른 용매의 능력 TCS 등 독성 물질 및 약물을 조절하는 효과를 분석 설계에 고려되어야한다. 오일이나 맛 첨가제의 사용은 다양한 제품 50,51에서 TCS의 효과를 방해 할 수 있습니다. 유기 용제를 사용하는 필요성을 제거하기위한 노력의 일환으로, 우리는 유기 졸의 사용을 제거하여 TCS 2 용해 우리의 방법에 따라 개선배출. 본 프로토콜에서는, 우리는 열 (≤ 50 ° C)과 수성 버퍼에 직접 TCS 과립을 분해 한 후 UV-VIS 분광 광도법으로이 TCS 주식의 농도를 확인합니다. TCS는 40 μM (최대 물에 용해하기 때문에 이러한 개선이 가능 <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) 50 ° C (가열시 분해에 저항하기 위해 표시되었습니다 <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. TCS도 강하게 4,200 L / 몰 / CM 12의 몰 흡광 계수와 280 nm의 58에서 흡수하는 것으로 알려져 있습니다대로 우리는 또한 UV-VIS 분광 광도계의 장점이 있습니다. 이 프로토콜은 저렴한 비용과 신속한 확인 등 유기 용제의 도움없이 버퍼에 TCS 과립을 분해 할 수있는 간단하면서도 효과적인 방법을 제공합니다농도, 그리고 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 모니터링하기위한 강력한 형광 마이크로 플레이트 분석을 설명합니다.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

비만 세포는 알레르기 질환과 기생충에 대한 면역 방어에 중요한 역할을한다. 일단 (알레르겐에 의해 예) 활성화, 그들은 degranulate, 프로세스가 알레르기 중재자의 exocytosis에 결과. 약물 및 독성 물질에 의한 비만 세포의 탈과립의 변조는 인간의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 비만 세포 기능은 쥐 염기성 백혈병 비만 세포의 사용 (RBL-2H3), 3-5 인간의 점막 비만 세포의 널리 사용되는 모델을 자세히 해부하고있다. 6 마스트 세포에서 히스타민과 협력하여 선형 출시 비만 세포 과립 구성 요소와 알레르기 중재자 β-헥 소사 미나는, 쉽게 신뢰성에 대한 의무가 마이크로 분석에서 측정 형광 강도를 산출, 형광 기질과의 반응을 통해 측정 할 수있다 높은 처리량 연구 1. 원래이 NaAl 등 1.에 의해 게시, 우리는 검사 O이 탈과립 분석을 적응F 약물 및 독성 물질과 여기에서의 사용을 보여줍니다. 트리클로산은 많은 소비자 제품에 존재하며이 효과에 대한 메커니즘은 알 수 있지만, 인간의 알레르기 성 피부 질환 7-11 치료 도움이 될 발견되었습니다 광범위한 스펙트럼 항균 에이전트입니다. 여기에서 우리는 비만 세포 탈과립에 트리클로산의 효과에 대한 분석을 보여줍니다. 우리는 최근 트리클로산 강하게 비만 세포의 기능이 영향을 미치는 것으로 나타났다. 유기 용매의 사용을 방지하기위한 노력의 일환으로, 트리클로산은 열 교반 수성 버퍼에 직접 용해되고, 결과 농도는 12 (ε 280 = 4,200 L / M / ㎠ 사용) UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 확인됩니다. 이 프로토콜은, 더 넓게 자신의 알레르기 가능성을 비만 세포 탈과립에 미치는 영향을 결정하기 위해 다양한 화학 물질과 함께 사용할 수있는 잠재력을 가지고 있으며,.

50 가열하면 ° C 90 분, TCS에 대한 UV-VIS 흡수 스펙트럼은 그림 1에서 보는 바와 같이 280 nm의 피크 ~ 260, 300 nm의 사이에 강한, 부드러운 곡선을 생산하고 있습니다. 280 nm에서 발표 몰 흡광 계수는 4,200 L / 몰 / ㎠ 12 년부터 UV-VIS 분광 광도계는, 따라서 농도를 계산하는 데 이용 될 수있는 중요한 도구입니다. 우리는 TCS는 50 ° C 가열 (데이터가 표시되지 않음)에 따라, 전체 탈과립 실험의 기간 동안 ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent at JoVE.com

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

비만 세포의 탈과립, 알레르기 중재자의 릴리스는, 알레르기, 천식, 및 기생충 방어에 중요합니다. 여기에 우리가 탈과립에 대한 약물 및 독성 물질의 영향을 평가하기위한 방법 1을 보여, 방법론은 최근 항균제 트리클로산 2의 강력한 억제 효과를 나타낸다 활용.

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K 조회수.  University of Maine, Orono.  비만 세포의 탈과립, 알레르기 중재자의 릴리스는, 알레르기, 천식, 및 기생충 방어에 중요합니다. 여기에 우리가 탈과립에 대한 약물 및 독성 물질의 영향을 평가하기위한 방법 1을 보여, 방법론은 최근 항균제 트리클로산 2의 강력한 억제 효과를 나타낸다 활용. 

비디오: A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1. Although genetic disposition and exposition to toxic substances are known causes for this disease in about one third of the patients, the origin of DCM remains largely unclear. In a substantial number of these patients, autoantibodies against cardiac epitopes have been detected and are suspected to play a pivotal role in the onset and progression of the disease2,3. The importance of cardiac autoantibodies is underlined by a hemodynamic improvement observed in DCM patients after elimination of autoantibodies by immunoadsorption3-5. A variety of specific antigens have already been identified2,3 and antibodies against these targets may be detected by immunoassays. However, these assays cannot discriminate between stimulating (and therefore functionally effective) and blocking autoantibodies. There is increasing evidence that this distinction is crucial6,7. It can also be assumed that the targets for a number of cardiotropic antibodies are still unidentified and therefore cannot be detected by immunoassays. Therefore, we established a method for the detection of functionally active cardiotropic antibodies, independent of their respective antigen. The background for the method is the high homology usually observed for functional regions of cardiac proteins in between mammals8,9. This suggests that cardiac antibodies directed against human antigens will cross-react with non-human target cells, which allows testing of IgG from DCM patients on adult rat cardiomyocytes. Our method consists of 3 steps: first, IgG is isolated from patient plasma using sepharose coupled anti-IgG antibodies obtained from immunoadsorption columns (PlasmaSelect, Teterow, Germany). Second, adult cardiomyocytes are isolated by collagenase perfusion in a Langendorff perfusion apparatus using a protocol modified from previous works10,11. The obtained cardiomyocytes are attached to laminin-coated chambered coverglasses and stained with Fura-2, a calcium-selective fluorescent dye which can be easily brought into the cell to observe intracellular calcium (Ca2+) contents12. In the last step, the effect of patient IgG on the cell shortening and Ca2+ transients of field stimulated cardiomyocytes is monitored online using a commercial myocyte calcium and contractility monitoring system (IonOptix, Milton, MA, USA) connected to a standard inverse fluorescent microscope.

The presented method offers a way to detect functional effective cardiotropic autoantibodies in the plasma of patients with dilated cardiomyopathy, irrespective of the specific antigen, by analysing the impact of isolated patient immunoglobulin on cellular shortening and intracellular calcium transients in isolated rat cardiomyocytes.

절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

연구

면역학 및 감염병학

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

흐름에서 백혈구의 모집에 기질 세포의 영향 분석

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현은 포유 동물 숙주 세포에서 분비 세균 독소의 효과를 연구하기

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

신생아 Capsaicin 치료에 의해 유도 된 아 토 피 성 피부염의 쥐 모델에 포 름 알 데히드의 노출의 효과

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...