분석은 환자의 IgE와 알레르겐의 교차 연결에 의해 유도된 basophils의 탈과립을 시뮬레이션하는 중요한 연구 도구를 나타냅니다. 따라서 분석체는 타입-1, 알레르기 반응을 모방하기 위하여 이용될 수 있습니다. 분석은 견고하고 재현 가능하며 맞춤화할 수 있습니다.
더욱이, 소량의 재조합 또는 정제 알레르겐또는 복잡한 알레르겐 추출물로 수행될 수 있기 때문에 매우 민감하다. 이 방법은 알레르겐에 대한 환자의 반응성을 분석할 때 알레르기를 진단하는 데 사용됩니다. 또한 이 방법은 상호 반응성을 분석하고 AIT 치료 효능을 모니터링하는 데 적합합니다.
세포 배양에서 Ag8 세포를 수확하고 세포를 원심 분리 튜브로 이송하는 것으로 시작합니다. 실온에서 250배 g에서 5분간 원심분리로 세포를 아래로 내려놓습니다. 슈퍼나탄을 흡인시키고, 세포 펠릿을 6세포에 약 10회, 인간화된 RBL 세포 배지에서 밀리리터당 10분의 1의 최종 농도로 재침한다.
Ag8 세포 현탁액에서 인간 세라를 1~10개 희석하여 분석에서 1~20°C의 최종 혈청 희석을 위해, 1시간 동안 섭씨 37도, 이산화탄소 5~7%에서 배양한다. 인간화된 RBL 세포가 50~90%에 도달하면, T-75 세포 배양으로부터 배지를 신중하게 흡인하여 부착된 인간화된 RBL 세포를 만지지 않고 한다. 플라스크의 반대편에 DPBS의 10 밀리리터를 추가하고 세포에 직접 적으로 첨가하여 세포를 두 번 세척하십시오.
흡면 DPBS, 세포 분리를 위해 미리 따뜻하게 한 번 트립신-EDTA의 5 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양하십시오. 플라스크를 부드럽게 눌러 세포를 분리합니다. 세포 현탁액을 15mm 원심분리 튜브로 옮기고 인체에 식힌 RBL 세포 배지 또는 DPBS로 튜브를 채우고 트립신-EDTA를 희석시한다.
실온에서 5분 동안 250배 g의 원심분리기. 슈퍼나탄을 흡인시키고, 세포 계수에 대한 인간화된 RBL 세포 배지의 5밀리리터에서 펠릿을 재보편하게 한다. 세포를 계산한 후, 인간화된 RBL 세포 배지에서 세포를 희석하여 밀리리터당 제6 세포에 2회 10의 최종 농도를 얻습니다.
멸균 96웰 플레이트에서 잘 5세포에 10회 10회상당의 인간화된 RBL 세포 현탁액 50마이크로리터를 첨가한다. 원심분리기는 Ag8 세포 펠릿을 방해하지 않고, 원심분리된 Ag8 혈청 현탁액50마이크로리터를 인간화된 RBL 세포를 각각 잘 포함하는 것으로 이송한다. 항원 없이 감이 있는 자극되지 않은 세포를 바닥 신호 고원 또는 배경의 표시를 위한 항원 제어로 사용하지 않으며, 배경 및 최대 용해 제어 우물을 민감하게 하지 않습니다.
뚜껑으로 접시를 덮고 하룻밤 사이에 섭씨 37도, 이산화탄소 5~7%로 배양합니다. 세포 매체를 포함하는 혈청을 흡인시키고, 흡수성 용지에 판을 배반하고 탭하여 인간화된 RBL 세포를 세척하기 위한 플레이트를 비웁니까. 티로드 버퍼 200 마이크로리터를 양번 첨가하여 세포를 세 번 씻고, 처음 두 세척을 위해 세척당 약 30초 동안 배양합니다.
Tyrode의 버퍼를 세 번째로 추가한 후 버퍼를 흡인하고 항원 희석을 추가할 준비가 될 때까지 용액을 우물에 둡니다. 항원 용액 100마이크로리터를 각 웰에 전달하여 전감화된 인간화 RBL 세포를 함유하고 있으나 항원으로 최대 용해 및 비민감성 배경 세포를 자극하지는 않는다. 최대 용해 제어 우물, 민감하지 않은 배경 제어 웰 및 민감성 노 항원 우물에 Tyrode의 버퍼 100 마이크로 리터를 추가합니다.
세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5~7%에서 1시간 동안 배양합니다. 최대 용액 제어 우물을 10 마이크로리터당 10%의 트리톤 X-100을 잘 처리하고 베타 헥소사미니다제의 100% 방출을 위해 세포를 완전히 lyse에 적절히 혼합합니다. 50 마이크로리터의 기판 용액을 새로운 결합되지 않은 96웰 플레이트에 넣습니다.
플레이트를 함유하는 인간화된 RBL 세포의 우물에서 50마이크로리터를 기판 용액을 포함하는 새로운 플레이트로 옮기고 불소기기판의 변환을 허용하기 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 플레이트를 배양한다. 100 마이크로리터의 정지 용액을 잘 추가하고 텍스트 원고에 설명된 대로 형광을 측정합니다. 베타-헥소사미니다제 활성 분석에서 얻어진 종 모양의 곡선은 알러지 유발 물질의 과잉으로 인한 면역글로불린 E의 항원 전형체의 단원적 직업을 나타내며, 이는 알러지 유발 물질 면역글로불린 E가 고항원 농도에서 교차 연결하는 것을 억제한다.
반 최대 중재자 방출에 필요한 항원 농도는 선형 회귀 분석을 사용하여 계산되었다. 세포 생존성 분석은 자극에 사용되는 감쇠 세럼 또는 항원으로부터 유래된 세포독성 효과를 배제하기 위해 수행되었다. 베타 헥소사미니다제 활성 분석에 5개의 다른 인간 혈청이 사용되었고, 자작나무 꽃가루 알레르기 환자로부터 유래된 5가지 세라 중 4개가 Bet v 1 자극에 반응하여 Bet v 1이 면역글로불린 E매개 알레르기 증상을 담당하는 강력한 알레르겐임을 입증하였다.
상동성 알레르겐에 대한 면역글로불린 E의 상호 반응성을 평가하였다. Bet v 1에 대한 반응은 두 환자 모두에서 발견되었지만 환자 2 명은 Cor a 1에 응답했습니다. Bet v 1 상동성 식품 알레르겐은 환자 2에서 1개의 상호 반응성 면역글로불린 E 수준을 더 높게 나타낸다.
알레르겐의 돌연변이 변이체의 저자극성 성질을 평가하고 야생 형에 비해 비교되었다. Bet v 1 접이식체의 방출 곡선은 야생형 알레르겐에 비해 항원 농도가 높은 쪽으로 이동하여 반최대 방출을 유발하는 항원 농도가 상당히 높아져 돌연변이가 알레르기가 적고 따라서 알레르겐 특정 면역 요법의 후보입니다. 그렇지 않으면 세포가 건조되는 것을 피하기 위해 항원 희석을 적용 할 때까지 세포에 세척 용액을 두는 것을 잊지 마십시오.
상기 분석법은 알레르겐 특이적 면역요법에 사용되는 피부 찌르기 시험 솔루션 또는 추출물과 같은 생물학적 활성에 기초하여 알레르기 성 제품의 표준화를 포함한 많은 다른 응용 분야에 사용될 수 있다.
