Trowell 형 장기 배양은 조직 외식편을 배양하는 데 사용됩니다. 여기에서는 이 방법을 사용하여 지속적으로 성장하는 치아의 줄기 세포를 연구하는 방법을 보여줍니다. 이 기술을 통해 우리는 틈새 시장에서 줄기 세포와 그 행동을 연구하고 줄기 세포의 생존 및 유지에 대한 다양한 분자의 영향을 스크리닝 할 수 있습니다.
이 방법은 피부나 유선과 같은 다른 기관의 줄기 세포를 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 35mm 페트리 접시에 1-2mm 직경의 구멍이있는 30mm 금속 격자를 배치하여 시작하십시오. 미디어가 그리드 표면에 도달할 때까지 미디어로 위치를 채웁니다.
그런 다음 조직이 분리되고 배양할 준비가 될 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다. 마우스를 참수 한 후 피부를 제거하여 하악을 노출시키고 교근을 절단하여 하악골을 상악과 나머지 머리에서 분리합니다. 하악골이 분리되면 혀와 최대 연조직을 제거하십시오.
symphysis를 절단하여 정중선에서 하악을 분할하십시오. 얼음 위의 PBS가 들어있는 페트리 접시에 하악골을 놓습니다. 일회용 20 x 26 게이지 피하 주사 바늘을 사용하여 절치를 해부하십시오.
그런 다음 더 나은 시각화를 위해 뼈 표면에서 연조직과 근육 조직을 청소하십시오. 10 일 미만의 동물에서 얻은 하악골의 경우 일회용 20 x 26 게이지 피하 주사 바늘을 사용하여 하악의 각 절반을 세로로 열어 앞니를 노출시킵니다. 주변 뼈에서 절치를 부드럽게 분리하십시오.
자궁 경부 루프가 포함 된 근위 끝을 자르고 미네랄 화 된 법랑질과 상아질 기질을 제거합니다. 배양 준비가 될 때까지 Dulbecco의 PBS에서 수집 된 근위 끝을 얼음 위에 보관하십시오. 10 일 이상 된 마우스의 경우, 하악의 각 절반을 세로로 열어 절치 치아를 노출시킵니다.
핀셋을 사용하여 하악을 잡고 뼈를 부러 뜨려 치아를 노출시킵니다. 자궁 경부 루프가 포함 된 근위 끝을 자릅니다. 배양 준비가 될 때까지 Dulbecco의 PBS에서 수집 된 근위 끝을 얼음 위에 보관하십시오.
예열 된 배양 접시의 그리드 위에 직사각형 필터를 조심스럽게 놓고 조직 조각의 방향을 올바르게 지정하십시오. 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 90-95%에서 배양합니다. 기포의 형성을 피하면서 격일로 조심스럽게 매체를 교체하십시오.
조직 성장을 모니터링하고 매일 이미지를 캡처합니다. 접시에서 배양 배지를 제거하고 조심스럽게 얼음처럼 차가운 메탄올을 조직에 첨가하십시오. 그런 다음 5 분 동안 배양하십시오.
조직 체외이식편을 운반하는 필터를 고정 용액으로 채워진 샘플링 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 밤새 최대로 PBS에서 준비된 4 % 파라 포름 알데히드로 체외 이식편을 고정하십시오. 상피 줄기 세포는 앞니의 근위 끝에 위치한 자궁 경부 루프라고하는 틈새에 있습니다.
자궁 경부 루프는 느슨하게 배열 된 상피 세포의 핵심 인 별 모양의 세망을 감싸는 내부 및 외부 법랑질 상피로 구성됩니다. 각 앞니에는 하나의 순순 및 하나의 설측 경추 루프가 있지만 순순 자궁 경부 루프에만 줄기 세포가 포함되어 있습니다. 출생 후 2일 Sox2-GFP 마우스에서 분리한 앞니의 근위 말단을 캡처하여 Sox2 발현 앞니 상피 줄기 세포를 식별하고 시각화할 수 있었습니다.
Sox2-GFP 및 Fucci 적색 형질전환 마우스에서 분리된 자궁경부 루프에서 GFP 양성 줄기세포 및 Fucci-적색 양성 비증식성 세포가 확인되었습니다. Sox2-GFP 발현은 Wnt/베타-카테닌 신호 전달제 BIO의 효과를 분석하기 위한 리포터로 사용되었으며, 이는 GFP 발현뿐만 아니라 Sox2 발현 줄기세포에 부정적인 영향을 미쳤습니다. 이 기술은 줄기 세포 행동의 라이브 이미징에 최적화 될 수 있습니다.
압착 또는 배양된 체외이식편은 또한 추가 분석을 위해 단일 세포 현탁액으로 효소적으로 처리될 수 있습니다.
