이 프로토콜은 삼차 뉴런과 치과 펄프 줄기 세포를 공동 배양하는 방법에 대한 자세한 개요를 제공합니다. 이를 통해 우리는 그들의 크로스토크에 의해 구동되는 여러 응답을 조사할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 집단 또는 두 세포 집단을 연구하고 조작하고 결과를 정확하게 측정하는 기능입니다.
이 방법은 신경 연구에 직접적인 관련성을 가지고 있으며 치과 펄프 줄기 세포가 외상성 사건이나 신경 퇴행성 질환으로 손상된 신경 조직을 복구하는 방법에 대한 연구에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기술의 여러 단계가 배울 수 있으며 그들 모두를 유지하기어려울 수 있습니다. 이 프로토콜은 이를 돕기 위해 각 단계에 자세히 설명합니다.
치과 펄프와 중질은 분산하기 어렵고 다양한 소용돌이 및 파이펫팅이 필요합니다. 그럼에도 불구하고 전체 분산을 얻지 못하므로 최적화 및 복제가 필요합니다. 마우스의 안락사 후, 입이 천장쪽으로 향하고 목의 바닥이 작업 표면에 평평할 수 있도록 일회용 언더패드에 머리를 놓습니다.
면도날과 톱질 동작을 사용하여 하악을 맥시라와 분리합니다. 어금니에 쉽게 접근할 수 있도록 가위 나 집게로 혀를 제거합니다. 멸균 거즈 패드 위에 열린 머리를 접시에 놓고 해부 현미경 아래에 표본을 놓습니다.
첫 번째 어금니를 둘러싼 폐포 뼈 조직을 제거합니다. 폐포 개구부에 집게를 삽입하고 치아에서 부터 입의 부클 또는 언어 측면을 향해 조직을 애타게 합니다. 모든 상악 제1 어금을 수집하고 부드럽게 얼음에 1X PBS와 별도의 세포 배양 접시에 submandibular 및 상악 제 1 어금니를 전송합니다.
각 상악 제1 어금니의 외부를 둘러싼 에나멜 외부 장기를 제거합니다. 집게 세트로 커프스가 다운되고 열린 루트가 노출되도록 어금니를 회전시다. 치아 바닥에 는 타원형 개구부가 있고 덴틴과 에나멜의 얇은 층으로 캡슐화 된 불투명한 치과 펄프 조직이 있습니다.
집게의 끝을 사용하여, 미네랄 화 조직의 내부 둘레 주위에 집게의 한 쪽 팔을 실행하여 치과 펄프를 부드럽게 풀어. 미네랄 구조에서 치과 펄프 조직을 제거하고 1X PBS를 포함하는 제 3 접시로 옮김합니다. 이미 분리되지 않은 경우 에나멜 외부 장기를 제거합니다.
모든 치과 펄프 조직을 50 밀리리터 원추형 튜브에 0.25%의 트립신 EDTA로 이송합니다. 혼합물을 소용돌이시키고 섭씨 37도의 따뜻한 수조에 10분 간 놓습니다. 멸균 후드 아래에서, 효소를 비활성화하기 위해 트립신에 적어도 일대일 미디어의 최종 비율에 따뜻한 공동 배양 매체를 추가합니다.
미디어의 치과 펄프를 더욱 분산시키고 큰 거품을 피하기 위해 10 밀리리터 파이펫으로 미디어를 여러 번 위아래로 피하십시오. 분산된 치과 펄프의 1밀리리터를 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 옮기. 접시를 인큐베이터에 섭씨 37도에 놓습니다.
그리고 세포가 미디어를 변경하기 전에 48 시간 동안 분산되지 않은 조직에서 부착하고 마이그레이션할 수 있도록 합니다. 안락사 및 피부 제거 후, 두개골의 기지에 마이크로 해부 가위의 쌍의 끝을 삽입합니다. 두개골의 처진 봉합사를 따라 잘라.
두개골 기슭의 양두엽 봉합사를 따라 갈 때까지 귀에 의해 관상 봉합사를 따라 네 개의 작은 수평 컷을 만듭니다. 이렇게 하면 두 개의 골격 플랩이 생성됩니다. 집게를 사용하여 뼈의 두 플랩을 벗겨 뇌를 드러냅니다.
상악 과정의 뇌와 뼈 사이의 두라 마터에 보관 된 삼차 중추를 찾습니다. 눈에 여행 세 가지, 맥아, 그리고 하악. 그리고 직선 가장자리 미세 집게를 사용하여 얼음 에 접시에 차가운 1X PBS에 간질을 전송합니다.
모든 삼차 번들이 수확되면 살균 필터 콜라게나아제 타입 II.Vortex의 밀리리터 당 5밀리그램을 포함하는 50 밀리리터 원추형 튜브로 간리아를 전송하고 25~30분 동안 37도의 섭씨 수조에 튜브를 배치한다. 5~10분마다 수조, 소용돌이에서 튜브를 꺼내 목욕으로 돌아갑니다. 콜라게나제 삼차 뉴런 용액을 643xg에서 2분 동안 원심분리합니다.
조직 배양 후드 아래, 부드럽게 마이크로 파이프와 콜라게나아아제를 흡인하고 1 % 멸균 여과 트립신 유형 II의 5 밀리리터를 추가.다음 25 ~ 30 분 동안 37도 섭씨 수조에 튜브를 배치하고이 시간 프레임 소용돌이 5 분마다 간략하게 튜브소용돌이. 나머지 트립신을 비활성화하기 위해 미디어에 트립신의 일대일 비율로 미디어를 추가합니다. 세포의 수를 계산하고 미디어에서 밀리리터 당 200, 000 세포로 혼합물을 희석시.
코팅된 트랜스웰 필터를 치과 펄프로 우물에 넣습니다. 파이프 250 마이크로리터를 트랜스웰 필터에 대고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 세포를 배양한다. 다음 날, 미디어를 1개의 마이크로몰러 uridine과 15 마이크로몰러 5-플루오로-2'deoxyuridine로 보충된 공동 배양 매체의 1밀리리터로 대체하여 중성염 의 성장을 방지할 수 있는 중간엽 세포의 과잉 증식을 중단합니다.
당신은 둘째 날에 미토틱 억제제를 추가해야하거나 중성성 성장이 발생하지 않습니다. 이 연구에서는, 삼차 중성염 단배의 대조에 비해 기본 치과 펄프 세포의 존재에서 증가되었다. TGF-베타 수용체로부터 분리된 1차 세포 2 플로스/플록스 마우스는 아데-Cre-GFP 또는 아데-eGFP의 주사 후 수에 동등하였다.
반정량 PCR은 아데노바이러스-Cre-GFP가 대조바이러스-eGFP를 대조바이러스-eGFP로 변형시키는 측면 유전자를 삭제하여 대조바이러스-eGFP가 대조바이러스 벡터로 작용한다는 것을 보여준다. 성장인자 베타 수용체 2 를 변화시키는 배양에서, 중성염 의 성장은 감소하였다. 세포 인구의 결정 보라색 염색 후 트랜스웰 필터의 밝은 필드 이미징은 큰 모공이 널리 퍼져 있음을 보여줍니다.
큰 화살표는 중간 엽 형태를 가진 세포를 지적하는 반면 작은 화살표는 신경 형태세포를 가리킵니다. 크리스탈 바이올렛은 바이어스없이 두 세포를 염색했습니다. 또한, 알렉사 488 이차 항체를 가진 베타-III 튜불린의 면역불광 염색은 다중 세포의 비특이적 염색을 나타내어 포렌티드 구조의 이미징을 어렵게 만드는 다중 세포의 비특이적 염색을 보여준다.
치과 펄프 세포나 삼차 뉴런이 쉽게 분산되지 않으므로 각 연구원은 도금 절차를 최적화해야합니다. 별도의 우물에서 치과 펄프 세포를 배양하는 경우 면역 형광을 사용하거나 RNA 또는 단백질 수준을 정량화하여 치과 펄프 세포가 뉴런에 어떻게 반응하는지 결정할 수 있습니다. 아데노바이러스와 접촉하는 용기나 팁을 표백하는 것을 기억하십시오.
날카로운 쓰레기통에 면도기를 제대로 버리십시오.
