이 연구는 보조금 협정 제 건강-F2-2009-241778에에서 부여 번호 FO 315/4- 아래 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG, 독일 연구 재단)과 유럽 연합 (EU) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에 의해 지원되었다 CF.

1. 잘 접시에 내피 세포의 파종 <ol><li> 합류에 도달 할 때까지 두 번 배지 (DMEM이 10 % FCS, 50 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L-글루타민 포함) 주 변화, T75 문화 플라스크에 생쥐 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)을 육성. (. 포스터 등 2005 년 21,19. 뇌 미세 혈관 내피 세포의 생성 및 불멸화를 들어, Burek 외, 2012 참조). </li><li> 인산 세포를 씻으 식염수 (PBS)가 버퍼. PBS를 제거하고 2 ㎖ 따뜻한 트립신-EDTA 용액으로 세포를 trypsinize. </li><li> 세포 층이 분산 될 때까지 5 분 또는 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 세포에 8 ML 문화 매체를 추가합니다. 세포를 분리 플라스크를 여러 번 누릅니다. </li><li> 플라스크의 완전한 분리를 보장하기 위해 현미경으로 세포를 볼 수 있습니다. </li><li> 분리 된 세포를 위아래로 피펫 매체. 세포 suspensi을 혼합하는 소용돌이 플라스크합니다. </li><li> , 세포 현탁액의 20 μl를 타고 혈구에 넣고 세포의 수를 계산합니다. </li><li> 세포 밀도와 씨앗 20,000 세포 /도에 cm 2를 확인합니다. </li><li> collagen1에 세포 현탁액을 전송 3 ML / 잘 총량의 6 자 유연한 바닥 배양 플레이트 (63,525 cm 2)로 코팅. 각각의 잘은 9.62 cm 2의 면적을 가지고 있습니다. </li><li> 합류 할 때까지 일주일 동안 37 ° C에서 세포를 성장. 일주일에 두 번 배양액을 변경합니다. </li></ol> 2. 이전 스트레치에 의한 부상 세포 분화 <ol><li> 분화 배지 (DMEM는 혈청 벗겨 송아지 태아 혈청 (ssFCS) 1 %, 50 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는)와 세포의 배양액을 변경합니다. </li><li> 24 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어. </li></ol> 3. 내피 세포의 스트레치에 의한 손상 <ol><li> 세포 손상 컨트롤러 장치의 전원을 켭니다. </li><li> 50 밀리 초까지의 지연 시간을 설정합니다. </li><li> 레귤레이터 압력 15 PSI로 설정하고 등록 된 피크 압력이 안정 될 때까지 트리거 몇 번을 누릅니다. </li><li> 원하는 값으로 조절기 압력을 설정합니다. 스트레치 부상의 다양한 학위를 생성하기위한 가이드로 표 1을 사용합니다. </li><li> 트레이 홀더에 6 자 유연한 바닥 배양 플레이트 (63,525 cm 2)를 놓습니다. 잘 선택이 올바른뿐만 크기 (즉, 큰 우물)로 설정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 확실히 잘 통해 어댑터 플러그를 놓습니다. 다른 한편으로는 트리거를 밀어 한 손으로 제자리에 플러그를 잡으십시오. </li><li> 생성 된 피크 압력을 기록한다. </li><li> 바로 시간의 원하는 기간 동안 37 ° C 배양기에 다시 접시를 넣어 또는 실험이나 평가를 성공을 즉시 사용합니다. </li></ol> 4. 염료 흡수 분석에 의해 스트레치 손상의 평가 <ol><li> 세포는 STR이었다 직후에칭 (단계 3.7), 생존 얼룩의 1 MG / ML 솔루션의 30 μl를 추가하는 세포 배양 배지 (참고 독성 마커 (재료 및 장비의 보충 표 참조) 역할 : 염료 용액 10 μL ) 세포 배양 배지의 모든 ML을 위해 사용됩니다. </li><li> 세포에 염료를 첨가되면, 즉시 형광 현미경으로 볼 수 있습니다. </li></ol> 5. 젖산 탈수소 효소에 의해 스트레치 상해의 평가 (LDH) 출시 <ol><li> 즉시 세포 (단계 3.7) 스트레칭 후, 우물에서 세포 배양액 200 μl를 제거합니다. 당신은 LDH 방출의 수사에 포함 할 때마다 포인트 이후 부상에 대해 동일한 작업을 수행 (즉, 예를 들어, 30 분, 1 시간, 2 시간, 등.) </li><li> 모든 세포 파편을 제거하는 5 분의 microcentrifuge의 가장 높은 설정으로 세포 배양액을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 후속 단계에 대해이 작업을 사용합니다. </li><li> 당신 H 회AVE 단계 5.1를 완료하고 당신이, 조사 LDH 분석 키트 (재료 및 장비의 보충 표 참조)에 포함 된 용해 용액을 사용하여 세포를 용해하고 싶은 다양한 시간 지점에서하고 싶습니다 필요한 샘플을 촬영했습니다. </li><li> 키트에 제공된 96 웰 플레이트의 각 잘 분석 키토에 포함 된 측정 배지 100 μl를 넣습니다. </li><li> 분석 키트에 포함 된 96 웰 플레이트의 두 개의 병렬 우물에 세포 무료 세포 배양액 100 μl를 넣습니다. </li><li> 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 492 nm에서 흡광도를 참조하십시오. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성상 세포, 신경 glial 세포 및 대동맥 내피 세포 8, 9, 22 체외에서 기계적 손상의 효과는 연구되어왔다 및 방법이 확립되었다. 여전히 배양 뇌 혈관 내피 세포에서 스트레칭 부상의 체외 모델에서 알려진 최신하지 않도록, 그러나,있다. 외상의 휴대 전화 모델은 세포의 기계적 환경을 정확하게 6 제어 할 수 있기 때문에 동물 모델에 중요한 이점을 제공합니다. 따라서 배양 된 내피 뇌 세포를 사용하여 스트레치 부상을 통해 외상 체외 모델에서 그러한 우리의 프로토콜 선물이 유용하다는 것을 증명 할 수있는 것과 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 모델 역할을합니다. 이 프로토콜은 CEnd를 세포의 사용, 우리의 실험실에서 설립 BBB 모델을 만든다. BBB 고장이 자주 TBI 환자에 문서화하고 TBI는 종종 부종 형성 23, 24 발생할 수 있습니다 BBB의 중단에 연결되어 있기 때문에,이 메소드는 PRES여기 성향의 구체적 TBI에 관하여 BBB 연구를 수행에 사용할 수 있습니다. 이 모델에서, 그것은 스트레치 부상의 정도가 세포에 적용되는 방법을 많이 돌봐 것이 중요합니다. 세포가 어떤 경우에, 그리고 적용되는 압력의 어떤 금액으로 부상하는만큼의 내피 세포에 영향을 미칠 수있는 손상의 정도가 다른 세포 유형에서 크게 많이 다릅니다. 대동맥 내피 세포는 성상 세포 또는 혼합 glial 세포 9보다 부상을 스트레칭하는 것이 더 저항. 다른 세포 유형에 비해 또한, 그들은 부상 후보다 신속하게 복구 할 수 있습니다. 따라서 뇌 혈관 내피 세포, 특히 CEnd를 세포 스트레칭 손상의 큰 금액에 대한 부상의 높은 수준을 생산하기 위해 필요합니다. 하나는 표 1의 해당하는 압력을 적용하여 부상의 원하는 수준을 달성 할 수 있습니다. CEnd를 셀, 그러나 심각한 부상은 긴장하는 그들의 저항에 따른 선호합니다. 실시 LDH 분석 실험 하였다스트레치 증가의 정도를 더 LDH는 상층으로 분비되어 있는지 확인합니다. 대조적으로, 스트레치 부상의 낮은 양을 주어진 세포는 세포를 제어 유사한 양 LDH를 생산. 프로토콜에서 언급했듯이, 하나는 매체의 적절한 양 매체의 양을 증가 또는 감소가 우물에 적용되는 피크 압력의 차이가 발생할 수 있으므로 사용되는주의해야합니다. 45 PSI 압력이 가해질 때 빈도 3.8 PSI의 평균을 등록 예를 들어, 유체의 잘 포함 5 ML 4.0 PSI의 평균에서 피크 압력을 등록합니다. 따라서 생성 될 최대 압력이 원하는 양에 해당되도록 잘 컨트롤에 트리거를 여러 번 밀어 좋습니다. 우리의 실험에서 우리는 생존이 세포막의 투과성을 스트레칭의 효과를 결정하는 얼룩 사용됩니다. 우리가 사용하는 유연한 바닥 문화 판의 광학은 우리가 vi를 할 수 있습니다EW 직접 현미경으로 스테인드 세포. 그러나 한 직접 스트레치 부상 후 immunolabelling 연구를 수행하고자 할 때, 어려움이 발생할 수 있습니다. 첫째, 접시의 크기와 두께는 약간의 현미경보기 플랫폼과 문제를 일으킬 수 있습니다. 둘째, 잘 유연한 막 광학 감상을 취소 장애가있을 수 있습니다. 앞서 언급 한 한계에도 불구하고, 설명 절차는 BBB의 생체 기계 부상의 모델로 사용할 수 있습니다. 외상성 뇌 부상 (TBI) 두 가지, 즉 구성 요소, 허혈 및 외상을 포함한다. 빈혈은 저혈압이나 뇌의 결과로 인한 심각한 혈액 손실이있을 때 경우에 TBI에 따라 뇌에 제한 산소 공급을 붓기 보조 부상으로 발생할 수 있습니다. 그것은 부상 (25)의 순간에 시작된 연속 병적 인 과정을 나타내는 지연, nonmechanical 피해로 간주됩니다. 저산소증의 발생따고 심각한 외상성 뇌 손상은 일반적으로 26이다. 산소 포도당 박탈 (OGD)는 현재 체외에서 모델 허혈에 사용되는 방법입니다. 따라서, 스트레칭 후 세포에 보조 모욕으로 OGD하는 세포를 가하면 국소 빈혈 다음 TBI의 발생을 모방 할 수 있습니다. 따라서 체외 모델에서 우리의 현재를 개선하는 TBI와 최대한 가까이 실제 TBI로는 생체 내에서 발생으로 패턴을, 미래에 우리는 또한 스트레치 부상과 함께 OGD 채용합니다.

외상성 뇌 부상 (TBI) 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 만 10 사람들이 그 주요 건강 및 의료 문제 1하고 TBI에 의해 매년 영향을받습니다. 이로 인해 생체 내 및 TBI의 체외 모델에서 다양한이 확립 및 메커니즘 2,3,4을 연구하기 위해 개발. TBI의 더 나은 이해는 환자 치료를 개선하고 관련 사망률, 이환율과 비용을 감소 할 수있다. 생체 내 및 생체 방법 모두에서 사용 뇌 손상에 대한 많은 모델이 존재합니다. 생체 내 모델 머리 부상의 실제 이벤트를 모방 할 수 있습니다. 그러나 생체 내 상황의 복잡성, 관심의 조직에 접근성으로 인해이 제한됩니다. 입은 부상의 결과로 각각의 세포의 생리적 반응을 이해, 그것은 세포가 고립되는 것이 중요하다 전신 효과에서 어떤개별 응답 5를 억제하거나 변경할 수 있습니다. 이러한 이유 때문에, 외상의 휴대 전화 모델은 세포의 기계적 환경을 정확하게 6 제어 할 수 있기 때문에 동물 모델을 통해 중요한 이점을 제공합니다. 부상 등의 방법에 의한 변경을 결정하기 위해 세포 나 조직에 기계적인 부하의 사용을 고용 생체 시스템에서 개발되었다. 예를 들어, 세포에 기계적 손상의 효과를 연구하기위한 방법은 성상 세포, 신경 glial 세포 및 대동맥 내피 세포 7,8,9 설립되었습니다. 설치류 우리가 우리의 모델에 사용할 것과 동일한 압력 제어 장치를 채용 인간의 성상 세포 반응 (10)의 연구를 위해 설립 된 체외 외상 모델. 같은 방법은 마우스 뇌 미세 혈관 내피 세포 (bEnd3) 11 대뇌 피질의 뉴런으로 12,13뿐만 아니라, 대뇌 endoth에 스트레칭을 통해 부상을 유도하기 위해 적용신생 자돈 14 일부터 elial 세포. 장치하여 기계 스트레치 부상 10를 생산 아니라 문화의 바닥을 변형. 그것은 세포 위의 공기 압력의 응용 프로그램에 의해 배양 세포에 손상을 입 힙니다. 이 압력은 그로 인하여 세포를 스트레칭, 세포가 성장하는에 막 편향 수 있습니다. 스트레칭의 여러도 ( &quot;즉,&quot;낮은 &quot;보통&quot;또는 &quot;중증)을 따라 공기 압력 펄스 지속 시간과 강도를 설정하여 달성 할 수있다. 스트레치에 의한 손상이 방법은 생체 내 7에 외상과 연관되어 있습니다. 또한 부상이 방법은 세포 환경의 정확한 제어가 가능하고 쉽게 재현 할 수 있습니다. 비슷한 방법이 bEnd3 포함하여 많은 다른 뇌 세포 유형에 사용되었지만, 우리의 모델은 쥐 뇌 미세 혈관 내피 세포의 사용 (CEnd를)이 발생하게된다는 점에서 장점입니다우리 연구실합니다. 이 셀 라인은 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 잘 적합 모델입니다. BBB 모델로 사용되는 체외 세포 배양에서 그들을 투과성 화면 역할을 할 수있는 것이 특징을 가지고해야합니다. BBB 투과성 예측 될 체외 세포 모델에서 하나의 중요한 기준은 생리적으로 실제 세포 구조에 15을 소유해야한다는 것입니다. bEnd3 세포가 표시에도 불구하고 특유의 스핀들과 같은 그들은 오히려 섬유소 젤 17 일반 관 구조보다 낭종과 같은 구멍을 형성 그것에 문화 16 편평 형태, 그들은 체외에서 불규칙한 형태 형성의 동작을 나타냅니다. 또한, 세포가 배아 및 신생아 생쥐에 주입했을 때, 그들은 있지만 신생아와 젊은 생쥐의 배아 생쥐에 치명적인 빠르게 성장하는 종양을 유도. 그것은 따라서 정상적인 내피 성장, 이동, 분화를 지배하는 하나 이상의 프로세스가 변경되거나 eliminat되었다는 것을 권장합니다이 셀 라인 18 ED. 반면에, 내피와 BBB 마커의 발현, 생체 및 paracellular 플럭스 측정의 형태 학적, 면역 세포 평가는 우리의 BBB 모델 CEnd를 실제로 BBB 19 적합한 모델이라고 보여줍니다. 생체 뇌 내피 세포는 횡단 내피 전기 저항 (티이)가 Ωcm 2 2,000-5,000 이르기까지와 매우 긴밀한 투과성이 특징입니다. 의약품에 대한 뇌 미세 혈관 장벽 특성 연구를 위해, 세포의 paracellular 제한성 및 견고이 고려되어야한다. 대부분의 뇌 모세 혈관 내피 세포 (BCEC)에서이 세포 전시 봉사자는 50 ~ 100 Ωcm 2에서 20까지로 유지되지 않습니다. 불후의 뇌 내피 세포 라인 bEnd3가없는 큰 15 2 Ωcm 60 이상의 봉사자 값을 생성합니다. 포함하는 배지로 CEnd를 세포의 대비 차별화 혈청 디스플레이를 감소300-500 Ωcm 2 19,21 이르기까지 티이 값. 지금까지 배양 된 뇌 혈관 내피 세포에서 스트레칭 부상의 체외 모델에서 부족합니다. 따라서, BBB의 모델로 역할을 배양 뇌 혈관 내피 세포를 사용하여 스트레치 부상을 통해 외상 체외 모델이 유용하다는 것을 증명하기 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 뇌 세포 BBB 구체적으로 뇌 미세 혈관 내피 세포, TBI 동안받는 실제적인 영향을 모방 할 수있는 체외 모델을 제시한다. 이 모델의 가장 큰 장점은 부상의 양이 세포뿐만 아니라 세포 환경이 쉽게 실험 셋업을 쉽게 재현성을 가능하게하는 정확한 방식으로 제어 할 수 있습니다에 적용되는 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

외상성 뇌 손상 (TBI), 하나 더 그것에 관련된 기본 메커니즘을 이해 할 수있는 메소드가 낳은 높은 사망 사고로 인해 치료에 유용합니다. 생체 내에서 이러한 목적에 사용할 체외 방법에서 모두있다. 그것이 TBI 중에 발생으로 생체 내 모델은 실제 머리 부상을 모방 할 수 있습니다. 그러나 생체 기술에 세포 생리학 수준에서 연구에 악용 될 수 없습니다. 그들이 조작 세포와 세포 외 환경에 쉽게 액세스 할 수 있기 때문에, 따라서 체외 방법이 목적을 위해 더 유리하다. 우리의 프로토콜은 뇌 미세 혈관 내피 세포의 TBI 사용하여 스트레치 부상의 체외 모델을 제공합니다. 유연 바닥 우물에서 배양 세포에 적용되는 압력을 사용합니다. 압력은 쉽게 제어 할 수 있습니다 적용과 낮은에서 심한 범위하는 부상을 생성 할 수 있습니다. 쥐우리의 실험실에서 생성 된 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)는 이렇게 유사한 기술을 채택 다른 시스템에 이점을 제공하는 혈액 뇌 장벽 (BBB)​​에 대한 잘 적합 모델입니다. 또한, 방법의 단순성으로 인해, 실험 셋업을 쉽게 복제됩니다. 따라서,이 모델은 BBB에서 TBI에 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 연구에 사용할 수 있습니다.

콜라겐에 배양 세포 나 세포 들것 장치를 사용하여 스트레치 부상의 다양한 학위를 받게 된 6 자 유연한 바닥 배양 플레이트 (63,525 cm 2)로 코팅. 부상 세포를 복종 후에는 세포 형태에 스트레치에 의한 부상의 효과를 현미경으로 관찰 하였다. 그것은 스트레칭으로 큰 정도가 세포 왜곡의 큰 정도도 관찰 할 수있는 세포 (그림 1)에 적용되었는지 관찰되었다. 그림 1A와 같이 부상에 노출되지 않은 컨트롤 세포는 세포의 팽창이나 왜곡의 표시없이 정기적으로 모양의 뇌 혈관 내피 세포 (CEnd를)를 나타납니다. 스트레치 부상이 적용되었을 때 (그림은 1B-D), 변형 광학 현미경으로 관찰 할 수있다. 3.5-4.5 PSI 사이의 최대 압력을 심각하게 세포를 스트레칭 후 CEnd를 세포는 크게, 수축 팽창이 아닌로 변형 등장<html> 수 간 공간. 또한, 얼룩 생존 (100 nm의 최종 농도)의 섭취는 스트레치 부상의 정도 (그림 2) 증가로 증가했다. 가능성은 사용 염색은 세포의 세포막의 무결성이 손상 될 때 투과되고 건강한 세포에 염색 impermeant입니다. 염료 뻗어 세포 (그림 2B-D)에 비해 따라서, 세포의 단지 몇 (그림 2A) 염색 하였다, 제어 세포의 대부분에서 제외되었다. 많은 셀 스트레치 부상의 증가도 녹색 fluoresced. 젖산 탈수소 효소의 부상 릴리스 (LDH)의 생화학 적 마커로 효소는 제조업체의 지침에 따라 조사 하였다. 그림 증가 세포 스트레칭 부상 증가 LDH 방출을 야기하는 3 보여줍니다. &quot;928/50928fig1.jpg&quot;폭 = &quot;500px /&gt; 그림 1. 정상 대 손상된 세포의 광학 현미경 검사. (A) 일반 늘어나지 합류 세포 단층이 istightly 포장 길쭉한. 세포들은 적은 소형 표시 1.8-2.0 PSI (즉, 낮은 뻗기)의 피크 압력 펄스를 적용하여 뻗어 때, 공간은 화살표 (B)로 표시. 세포가 적당히 2.5-3.0 피크 압력 펄스로 부상했을 때, 그들 중 일부는 부어 (C) 변형 나타났다. 세포는 화살표 (D)로 표시 3.5-4.5 PSI, 심한 스트레칭으로 철회된다. 100X 배율. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> 그림 2. 형석정상 대 손상된 세포의 escence 현미경 검사 손상 후 생존 얼룩 2 시간 치료 세포 : 제어 늘어나지 세포 BD : 기지개 세포 (B - 낮은 C - 중간, D - 심한 경우도 있음).... 100X 배율. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> 그림 3. 스트레치 부상 후 상층 액에 젖산 탈수소 효소 (lactate dehydrogenase, LDH) 효소 릴리스. LDH 배양액으로 방출이 스트레치에 의한 손상 후 다양한 시간 간격으로 측정 하였다. LDH는 총 박리 LDH (미디어 플러스 세포의 LDH)의 백분율로 표시 하였다. 값은 ± SEM 있습니다. 마다 포인트 n은 0 시간 V를 제외하고 5입니다alue n은 = 3 심한 스트레칭을 실시. 낮은 중간 스트레칭을 실시 하였다 세포 LDH 방출이 늘어나지 컨트롤의 그것과 서로 유의 한 차이가 없었다. 심각하게 뻗어 된 세포는 1 시간에 적당히 늘어 샘플을 제외한 모든 다른 시료에 비해 LDH의 상당히 큰 금액을 발표했다. (p &lt;0.05, 하나의 요인 ANOVA, 홀름 - Sidak 방식). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 표 1. 스트레치 부상의 다양한 학위를 생성하기 위해 안내합니다. <table border="1"><tbody><tr><th> 레귤레이터 압력 </th><th> 최대 압력 </th><th> 부상의 정도 </th></tr><tr><td> 15 PSI </td><td> 1.2-1.5 PSI </td><td> &lt;저 </td></tr><tr><td> 20-25 PSI </td><td> 1.8-2.0 PSI </td><td> 낮은 </td></tr><tr><td> 30-35 PSI </td><td> 2.5-3.0 PSI </td><td> 중간 </tD&gt; </tr><tr><td> 40-50 PSI </td><td> 3.5-4.5 PSI </td><td> 심한 </td></tr><tr><td> 60 PSI </td><td> 4.8-6.0 PSI </td><td> &gt; 심한 </td></tr></tbody></table>

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Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

체외에서 외상성 뇌 손상 모델은 생체 뇌의 변형으로 재현하기 위해 개발되고있다. 스트레치에 의한 손상은 성상 세포, 뉴런, glial 세포, 대동맥, 뇌 혈관 내피 세포에 대한 고용되었습니다. 그러나 우리의 시스템은 체외 TBI 모델을 설정하는 BBB의 합법적 인 모델을 구성하는 속성을 가지고 혈액 뇌 장벽 (BBB) ​​모델을 사용합니다.

로 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)에 기지개<em&gt; 체외</em혈액 뇌 장벽의&gt; 외상성 뇌 손상 모델

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

14.8K 조회수.  Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg.  체외에서 외상성 뇌 손상 모델은 생체 뇌의 변형으로 재현하기 위해 개발되고있다. 스트레치에 의한 손상은 성상 세포, 뉴런, glial 세포, 대동맥, 뇌 혈관 내피 세포에 대한 고용되었습니다. 그러나 우리의 시스템은 체외 TBI 모델을 설정하는 BBB의 합법적 인 모델을 구성하는 속성을 가지고 혈액 뇌 장벽 (BBB) ​​모델을 사용합...

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MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

쥐 모델에서 Transcranial 집중 초음파를 사용하여 혈액 - 뇌 장벽의 MRI를 유도 장애

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

연구

의학

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

혈액 - 뇌 장벽 장애의 쥐 모델 Neurovascular 치료학 타겟이 분명한 허용하려면

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

외상성 뇌 손상에 대한 제어 피질 충격 모델

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

청소년 쥐에 대한 가벼운 외상성 뇌 손상의 소설 모델

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화<em&gt; 체외</em&gt; 허혈 - 재관류 손상 모델 공부 뇌 혈관 장벽 부전

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal neurological deficits and even amnesia. Athletes participating in contact sports are at high risk of exposure to large number of mTBIs. In terms of the level of injury in a sporting athlete, a mTBI is defined as a mild injury that does not cause gross pathological changes, but does cause short-term neurological deficits that are spontaneously resolved. Despite previous attempts to model mTBI in mice and rats, many have reported gross adverse effects including skull fractures, intracerebral bleeding, axonal injury and neuronal cell death. Herein, we describe our highly reproducible animal model of mTBI that reproduces clinically relevant symptoms. This model uses a custom made pneumatic impactor device to deliver a closed-head trauma. This impact is made under precise velocity and deformation parameters, creating a reliable and reproducible model to examine the mechanisms that contribute to effects of single or repetitive concussive mTBI.

Athletes absorb several hundred mild traumatic brain injuries (mTBI)/concussions every year; however, the consequence of these on the brain is poorly understood. Therefore, an animal model of single and repetitive mTBI that consistently replicates clinically relevant symptoms provides the means to advance the study of mTBI and concussion.

단일 및 반복적 인 경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...