우리의 프로토콜은 뇌졸중 후 회복에 영향을 미치는 복잡한 세포 메커니즘의 연구를 위해 시험관 내에서 인간의 혈액-뇌 장벽을 더 잘 요약할 필요성을 인식하고 있습니다. 당사의 트리플 모델은 부분적으로 웰 인서트의 큰 구획과 관련된 견고한 무결성을 보여 주므로 변경 빈도를 줄이고 모집단의 중단을 피할 수 있습니다. 우리의 모델은 허혈성 뇌졸중 중 및 후에 혈액 뇌 장벽에서 발생하는 분자 및 세포 변화를 연구하기위한 훌륭한 도구입니다.
우리의 프로토콜은 뇌졸중 후 회복을 개선하기 위해 새로운 표적과 치료제의 발견을 허용합니다. 허혈성 뇌졸중에 대한 현재의 치료법은 시간에 민감하며 결과적으로 항상 효과적인 것은 아닙니다. 합류할 때까지 섭씨 37도의 5%이산화탄소 인큐베이터 내에서 세포 접착을 위한 활성화된 표면을 가진 T75 배양 플라스크에서 HBVP를 배양하는 것으로 시작합니다.
합류점에 도달하면 오래된 pericyte 배지를 흡인하고 따뜻한 Dulbecco의 PBS 5 밀리리터로 세포를 씻습니다. Dulbecco의 PBS를 흡인하고 4 밀리리터의 따뜻한 트립신 EDTA 용액과 1 밀리리터의 Dulbecco의 PBS를 조합하여 플라스크에서 세포를 분리합니다. 플라스크를 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양합니다.
현미경으로 보고 세포가 플라스크에서 분리되었는지 확인합니다. 2%FBS를 포함하는 5밀리리터의 따뜻한 혈관주위세포 배지를 플라스크에 추가하고 분리된 세포를 50밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 200 g에서 3분 동안 원심분리하여 세포가 튜브의 바닥에 펠릿을 형성하도록 한다.
튜브에서 배지를 흡입하여 세포 펠릿이 손상되지 않도록 합니다. 세포 펠릿을 혈관주위세포 배지에 재현탁시킨다. 세포의 합류점과 필요한 웰 삽입물의 수에 따라 배지의 양을 계산하십시오.
10 마이크로 리터의 재 부유 세포를 취하여 세포 계수 슬라이드에 넣고 세포 수를 세십시오. 세포 밀도를 결정하고 1 밀리리터의 pericyte 배지에 삽입물 당 300, 000 세포를 웰 삽입물의 abluminal 측에 놓습니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 2%FBS를 포함하는 성상세포 배지를 사용하여 1차 인간 성상교세포를 배양합니다.
세포 밀도를 결정하고 웰당 300, 000개의 세포를 조직 배양 6-웰 플레이트의 바닥에 놓는다. 증발을 방지하기 위해 플레이트를 덮고 밤새 배양하십시오. 유사하게, 텍스트 원고에 설명된 대로 10%FBS를 포함하는 완전한 고전 배지를 사용하여 조직 배양 접시에서 HBMEC를 배양합니다.
성상 세포가 들어있는 조직 배양 6 웰 플레이트와 혈관 주위 세포가 들어있는 웰 삽입물을 인큐베이터에서 꺼냅니다. 조직 배양 6웰 플레이트로부터 성상세포 배지를 흡인하고, 1밀리리터의 혈관주위세포 배지 및 1밀리리터의 성상세포 배지를 각 웰에 첨가한다. 웰 삽입물로부터 혈관주위세포 배지를 흡인하고, 이를 파종된 성상교세포가 들어 있는 조직 배양 6웰 플레이트에 넣는다.
HBMEC를 동일한 웰 인서트의 정점면에 2 밀리리터의 완전한 클래식 배지에서 웰 당 300, 000 개의 세포 밀도로 시드합니다. 둘베코의 PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. 산소-포도당 박탈을 받은 삼중 세포 배양의 경우, 정점 및 기저측 구획 모두에 포도당이 없는 배지를 추가합니다.
배양 배지를 새로운 배지 및 정상 대조군 세포 배양으로 교체하십시오. 섭씨 37도의 5%이산화탄소 인큐베이터에 대조군 삼중 배양액을 놓습니다. 저산소증 인큐베이터 챔버에 20ml의 멸균수가 들어있는 페트리 접시를 놓아 배양 물의 적절한 가습을 제공합니다.
링 클램프를 풀어 챔버를 연 다음 선반에 세포 배양 물을 배열하십시오. 링 클램프를 고정하여 챔버를 밀봉하십시오. 챔버의 입구 및 출구 포트를 열고 챔버의 유량계 상단에서 튜브를 부착합니다.
공기 필터를 통해 유량계 바닥에서 가스 탱크로 튜브를 부착합니다. 탱크 유량 제어 밸브를 시계 반대 방향으로 돌려 열어 가스 흐름을 최소화하십시오. 시계 방향으로 돌려 압력 조절기 밸브를 천천히 엽니다.
분당 20 리터의 유속으로 5 분 동안 가스 혼합물로 챔버를 플러시하십시오. 가스 공급원에서 챔버를 분리하고 두 흰색 플라스틱 cl을 단단히 닫습니다.amps. 시계 방향으로 돌려 탱크 유량 제어 밸브를 끕니다.
시계 반대 방향으로 돌려 압력 조절기 밸브를 닫습니다. 저산소증 챔버를 섭씨 37도에서 4 시간 동안 설정된 기존 인큐베이터에 놓습니다. 멸균된 TEER 기기를 생물안전 캐비닛에 넣고 전극을 상피 볼트 저항계에 꽂습니다.
최소 30 분 동안 30 % 이소 프로필 알코올 용액 30ml에서 전극을 소독하십시오. TEER 기기를 켜고 기능을 옴으로 설정합니다. 70 % 이소 프로필 알코올 용액에서 전극을 제거하고 TEER 장치의 디지털 판독 값이 0 옴을 읽을 때까지 최소 30 분 동안 Dulbecco의 PBS 20ml에 넣습니다.
블랭크 웰 인서트 컨트롤의 웰 인서트 격납고에 있는 세 개의 구멍 중 하나를 통해 전극의 긴 갈래를 삽입하여 웰 바닥에 닿을 때까지 내립니다. 짧은 갈래가 우물 삽입물 바닥의 정점 배양 위에 놓여 있는지 확인하십시오. 값을 기록하기 전에 TEER 기기의 디지털 판독값이 꺼질 때까지 기다리십시오.
전극을 Dulbecco의 PBS에 다시 넣어 측정 사이에 세척하십시오. 두 개의 추가 빈 웰 삽입 컨트롤에 대한 모든 TEER 측정값을 계속 수집합니다. 앞에서 설명한 대로 샘플 플레이트의 TEER 측정값을 수집합니다.
모든 측정이 이루어지면 전극을 70% 이소프로필 알코올 용액에 30분 동안 다시 넣습니다. 그런 다음 TEER 기기에서 전극을 분리하고 자연 건조시킵니다. TEER 값을 계산합니다.
기저측 구획에서 배지를 흡인하고 삼중 세포 배양 혈액-뇌 장벽 모델에서 2 밀리리터의 페놀 레드가없는 내피 세포 성장 배지로 교체하십시오. HBSS로 정점 구획의 세포를 두 번 씻으십시오. 정점 구획에 FITC 덱스트란 용액 1 밀리리터를 넣고 알루미늄 호일로 판을 덮은 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 설정된 인큐베이터에 1 시간 동안 놓습니다.
기저측 구획에서 100 마이크로 리터의 배지를 가져 와서 검은 색 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 여기 및 방출 파장을 각각 480 및 530 나노미터로 설정된 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정합니다. 접시 당 150, 000 세포의 밀도로 폴리 -D- 라이신 코팅 된 35 밀리미터 유리 바닥 접시의 중앙에 HBMEC, 1 차 성상 세포 및 HBVP의 200 마이크로 리터를 시드합니다.
HBMEC를 파종하기 전에 접시 바닥에 부착 계수를 코팅하십시오. 세포를 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 밤새 방치하여 유리 표면에 부착되도록합니다. 합류점에 도달하면 배양 배지를 폐기하고 산소-포도당 박탈을 위한 예열된 포도당이 없는 배지 2밀리리터를 추가하거나 대조군을 위한 일반 배지를 추가합니다.
산소-포도당 박탈 처리 후 배지를 모든 접시에서 이미징에 최적화된 배지로 교체한 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 GFP 필터와 최상위 컨포칼 현미경 인큐베이터로 형광 라이브 셀 이미징을 수행합니다. 표시된 혈액-뇌 장벽 모델 구성에서 내피 단층의 장벽 무결성은 산소-포도당 박탈 전후와 24시간의 재산소화 후 TEER을 결정함으로써 평가되었습니다. 4 시간 동안 산소 - 포도당 박탈은 HBMEC 단일 배양 및 HBMEC 및 HBVP와의 공동 배양 모델에서만 TEER 값의 현저한 감소를 초래했다.
이러한 감소된 수준은 24시간의 재산소 공급 후 기준선 수준에 도달했습니다. 삼중 공동 배양 모델의 TEER 값은 산소-포도당 박탈 직후 이중 공동 배양 대조군 또는 단일 배양 대조군의 값보다 유의하게 높았습니다. 20 킬로달톤 분자량 인 FITC 덱스트란에 대한 내피 단층의 초 세포 투과성은 HBMEC 단일 배양에서 크게 증가했으며 정상 대조군과 비교하여 HBMEC 및 HBVP와의 공동 배양 모델에서 더 적은 정도로 증가했습니다.
또한, 20 킬로달톤 FITC 덱스트란 투과성 수준은 정상 및 산소-포도당 박탈 조건 하의 모든 모델 중에서 삼중 뇌-혈액 장벽 모델에서 가장 낮았다. 임의의 모델에서 내피 단층에 걸친 70 킬로달톤, FITC 덱스트란 플럭스에서는 변화가 관찰되지 않았다. 산소-포도당 결핍에 노출된 모든 1차 인간 유형은 강한 녹색 형광을 나타내어 이미징된 살아있는 세포가 저산소임을 증명했습니다.
우물 삽입물의 면에 인간의 뇌 혈관 혈관주위세포를 파종한 후 증발을 방지하기 위해 플립 플레이트로 덮는 것이 매우 중요합니다. 우리 모델에서는 비교적 작은 0.4마이크로미터 기공 직경의 폴리에스터 웰 인서트를 사용하여 치료를 위해 혈액-뇌 장벽을 통과해야 하는 모든 질병에 대한 약물 후보를 스크리닝하는 데 적합합니다. 이 기술은 필요한 경우 단백질 및 수송체의 변형을 시각화할 수 있는 훌륭한 기회를 제공합니다.
