우리는 원고의 중요한 읽기 아샤 스 미르 노프와 Laura Gonyar 감사합니다. 이 작품은 AKCMBJ 보조금 NIH R00 TW008042 및 R01 AI097312는 NIH T32 AI007046에 의해 부분적으로 지원되었다에 의해 지원되었다.

1. 프로피 디움 요오드 및 SYTO9와 세균 생존 능력을 평가 <ol><li> 그 박테리아를 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오. </li><li> 회 부드럽게 세포를 헹구 0.1 M 3 - (N-모르 폴리 노) 1 mM의 MgCl2를 (MOPS / MgCl2를 2)를 함유하는 프로판 술폰산 (MOPS)의 pH 7.2. </li><li> 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 세포를 품어. </li></ol> 참고 : 행동이 관심의 렉틴 또는 항체 (그림 1)에 관계없이 생존의 모든 박테리아를 바인딩 것을 보여주기 위해, 숙주 세포의 부재에서, 라이브와 죽은 세균 제어합니다. <ol start="4"><li> MOPS / MgCl2를 가진 세포를 두 번 씻어. </li><li> 기음 M세포 edia 및 0.5 ㎖ 라이브 / 죽은 염색 솔루션을 추가합니다. 라이브 / 죽은 염색 솔루션 MOPS / MgCl2를 5 μM의 SYTO9, 30 μM의 propidium 요오드화, 0.1 %의 사포닌 (최종 농도)입니다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 세포를 배양한다. </li><li> MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어. </li><li> 반전의 coverslips는 유리 슬라이드에 얼굴을 아래로하고 명확한 매니큐어로 밀봉. 설치 미디어를 사용하지 마십시오. </li><li> 녹색, 빨강, 및 원적외선 이미지 수집과 호환 필터 세트와 형광 현미경을 이용하여 30 분 이내에 이미지를 획득. </li></ol> NOTE : 종래의 형광 현미경과 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용할 수있다 둘. 30 분 후, 형광 염료가 세균으로부터 새기 시작해야하며 취득한 데이터를 더 이상 정확하다. 이 문서에 표시된 이미지는 Openlab 소프트웨어를 사용하여 하마 오카-ER 디지털 카메라 니콘 이클립스 E800 강직 한 형광 현미경에 인수했다. 650 nm의 663의 발광 필터 - - 알렉사 플 루어 647의 형광은 590 여기 파장 필터를 사용하여 발견 된 735 nm의, 거짓 색 파란색입니다. 580 ㎚, 600의 방출 필터 - - 660 nm의 요오드화 프로피 듐에서 형광 540의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTO9의 형광은 465의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다. <ol start="10"><li> 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 적색 + 청색으로 이미지가 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 빨간색 만 표시, 외부 가능한 박테리아는 녹색 + 청색으로, 내부 가능한 세균은 녹색 나타납니다. 눈으로 외부 생존 할 내부 생존 할 외부 가능한, 내부 가능한 박테리아의 수를 계산합니다. </li><li> 외부 박테리아의 총 수 (기준 외부 생균의 수를 분할함으로써 외부 생균의 퍼센트를 계산 가능한 플러스 nonvi수). 내부 박테리아의 총 수 (가능한 플러스 생존 불가능한) (도 4)에 의해 내부의 생균 수를 나눔으로써 내부 생균의 퍼센트를 계산한다. </li><li> 이 프로토콜을 사용하여 수행 할 수있는 두 가지 중요한 컨트롤이 있습니다. 첫째, 모든 생존 할 박테리아의 propidium 요오드화 양성과 모든 살아있는 박테리아가 SYTO9 양성임을 확인합니다. (모든 호스트 세포의 부재) 박테리아의 중간 대수 문화&gt; 95 % SYTO9 양성해야한다. N.의 중간 로그 문화는 그림 2에 보이는 임질은 라이브 / 죽은 염색 용액을 배양 (10에서 8 식민지 밀리리터 당 단위를 형성). 둘째, 요오드화 프로피 듐 및 SYTO9 모두 permeabilized, 감염된 숙주 세포를 입력 할 수 있음을 확인합니다. <ol><li> 죽은 박테리아의 인구를 생성하려면, 1.5 ML의 microfuge 튜브의 단위를 형성하는 2 × 10 8 세균성 식민지를 수집, 70 % 이소프로판올을 추가하고 10 분 동안 앉아있다. 의 microfuge에 박테리아 펠렛차 잔류 이소프로판올을 제거하기 위해 PBS에 두 번 박테리아를 씻어. 1.7 - 다음에 따라 프로토콜은 1.5 단계를 반복합니다. 유리 슬라이드에 세균 현탁액의 5 μl를 추가하고 coverslip에와 오버레이. 프로토콜 단계 1.9에서와 같이 이미지 샘플. 이러한 조건에서, 인구의 100 %의 propidium 요오드화 양성 (그림 2)이어야한다. 일부 세균 종에 요오드화 프로피 듐 완전히 SYTO9 염색을 압도하지 않으며, 생존 할 박테리아는 황색 또는 오렌지 나타날 수 있습니다. </li><li> 호중구와 같은 식세포를 들어, 이소프로판올 - 살해 박테리아 세포를 노출하고 세포 내 박테리아의 100 %의 propidium 요오드화 양성 (그림 3)되어 있는지 확인하십시오. 죽은 박테리아를 내면화하지 않을 수 있습니다 nonphagocytic 세포의 경우, 아 지드 화 나트륨 또는 이전에 라이브 / 죽은 염색 솔루션을 추가하는 다른 세포 투과 항균제에 감염된 세포를 치료하기에 충분할 수있다. </li></ol></li></ol> 2. SYTOX GREE와 평가 세균의 생존n 및 DAPI <ol><li> 라벨 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 모스의 정의 매체 (25)에서 10 ㎍ / ㎖의 DAPI와 관심의 박테리아. </li><li> DAPI 표지 박테리아와 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오. </li><li> MOPS / MgCl2를 한 번 세포를 씻어. </li><li> 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 세포를 품어. 제안 컨트롤 프로토콜 단계 1.3에서 참고 사항을 참조하십시오. </li><li> 기음 세포에서 미디어와는 MOPS / MgCl2를 0.5 ml의 0.4 μM SYTOX 녹색을 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 5 분 동안 세포를 배양한다. </li><li> MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어. </li><li> 5 분 MOPS / MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오. </li><li&gt; 형광 현미경으로 30 분 이내의 이미지를 획득. 현미경, 디지털 카메라, 및 수집 소프트웨어의 설명 프로토콜 단계 1.9를 참조하십시오. </li></ol> 참고 : 알렉사 플 루어 647에서 형광이 590 여기 파장 필터를 사용하여 감지되었습니다 - 650 ㎚, 663의 발광 필터 - 735 nm의, 거짓 색 빨간색입니다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTOX 녹색에서 형광 465의 여기 파장 필터를 이용하여 검출 하였다. 375 ㎚, 400 ㎚의 장벽 필터 - DAPI에서 형광은 355 여기 파장 필터를 사용하여 검출되었다. <ol start="10"><li> 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 녹색 + 빨강 이미지가 나타날 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 파란색 + 녹색 표시, 외부 가능한 박테리아는 파란색 + 빨간색 표시, 내부 가능한 박테리아는 (그림 4) 블루 나타납니다. 프로토콜 인트의 설명에 따라 외부 및 내부 세균의 비율을 정량화P 1.11. </li><li> 프로토콜 단계 1.12에 기재된 제어 DAPI / SYTOX 녹색 염료 조합 (도 2 및 3)으로 수행되어야한다. </li></ol> 3. 세포 내 현지화 외에도 세균 생존 능력을 평가 <ol><li> 라벨 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 모스의 정의 중간에 10 ㎍ / ㎖의 DAPI와 관심의 박테리아. </li><li> DAPI 표지 박테리아와 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오. </li><li> MOPS / MgCl2를 한 번 세포를 씻어. </li><li> 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 어둠 속에서 실온에서 10 분 알을 품다. 제안 컨트롤 프로토콜 단계 1.3에서 참고 사항을 참조하십시오. </li><li> 기음 세포에서 미디어와 세포 두 TI 린스MOPS / MgCl2를 2 MES. </li><li> 0.2 %의 사포닌을 포함 MOPS / MgCl2를 2, 20 분에 대한 관심의 세포 내 마커에 대한 알렉사 플 루어 555-결합 항체와 세포를 품어. </li><li> MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어. </li><li> 5 분 MOPS / MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오. </li><li> 기음 세포에서 미디어와는 MOPS / MgCl2를 0.4 μM SYTOX 녹색을 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 세포에게 5 분을 품어. </li><li> MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어. </li><li> 5 분 MOPS / MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오. </li><li> 형광 현미경에 30 분 이내에 슬라이드의 이미지를 획득. 현미경, 디지털 카메라, 및 수집 소프트웨어의 설명 프로토콜 단계 1.9를 참조하십시오. </li></ol> 참고 : 알렉사 플 루어 647에서 형광이 590 여기 파장 필터를 사용하여 감지되었습니다 - 650 nm의 663의 방출 필터 - 735 nm의, 거짓 색 보라색입니다. 형광 F580 ㎚, 600의 방출 필터 - - 660 nm의 ROM 알렉사 형석 555은 540의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTOX 녹색에서 형광 465의 여기 파장 필터를 이용하여 검출 하였다. 375 ㎚, 400 ㎚의 장벽 필터 - DAPI에서 형광은 355 여기 파장 필터를 사용하여 검출되었다. <ol start="14"><li> 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 녹색 + 보라색 이미지가 나타날 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 파란색 + 녹색 표시, 외부 가능한 박테리아가 파란색 + 보라색 표시, 내부 가능한 박테리아는 파란색 표시하고, 세포 내 단백질 (그림 4) 빨간색이 나타납니다. 프로토콜의 설명에 따라 외부 및 내부 가능한 박테리아의 PERECENT 1.11 단계를 정량화. </li><li> 프로토콜 단계 1.12에 기재된 제어 DAPI / SYTOX 녹색 염료 조합 (도 2 및 3)으로 수행되어야한다. </li><li> 에실행 가능하고 생존 할 박테리아를 계산에 추가, 관심의 세포 내 마커 colocalization을 긍정적이거나 부정적인 각 박테리아를 분류합니다. </li><li> 생균의 전체 숫자로 colocalized 생균의 수를 분할함으로써 세포 내 마커 colocalized 생균의 퍼센트를 계산한다. 생존 불가능한 박테리아의 총 수에 의해 생존 할 colocalized 박테리아의 수를 분할함으로써 세포 내 마커 colocalized 생존 불가능한 박테리아의 퍼센트를 계산한다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

DNA는 인간의 세포와 내부에 부착 된 라이브 및 죽은 박테리아를 식별 할 수있는 형광 렉틴과 함께 결합과 생존의 염료를 사용하는 두 개의 프로토콜은 여기에서 소개하고 있습니다. 두 프로토콜 효과적으로 사균의 라이브 판별하기 때문에, 사용하는 프로토콜의 선택은 실험의 목표에 의존한다. 제 1 프로토콜은 생존 불가능한 박테리아 그대로 박테리아를 검출하는 SYTO9를 검출 프로피 듐 요오다 ?...

동적 상호 작용과 그들이 거주하는 박테리아와 호스트 사이의 공동 발전이있다. 박테리아 부착 소기관, 분비 시스템, 및 / 또는 호스트 식세포 및 비 식세포 그들의 생산적 감염을 활성화 독소를 생산하는 능력을 진화 해왔다. 박테리아는 또한 인식과 숙주 면역 시스템의 항균 활동을 주장해야합니다. 숙주 면역 시스템은 물리적 및 화학적 장벽, 면역 세포, 보체계 및 체액 성 면역의 다른 구성 요소들을 포함하는 선천성 및 적응 구성 요소로 구성된다. 많은 박테리아가 다층 호스트 면역 반응에 의해 살해 및 통관에 민감하지만, 몇 가지 병원성 및 기회 박테리아가 숙주 세포의 다양한 감염 및 숙주 면역 반응 (1)에 의해 허가를 파괴하는 메커니즘을 진화했다. 임균은 세균성 병원체의 한 예입니다 그는 매우 그 사람의 호스트. N에서 지속하도록되어있다. 임질은 쉽게 비뇨 생식기의 기관, 인두, 결막, 그리고 직장의 점막 상피 세포의 내강 표면을 식민지화한다. 식민지 점막 사이트에서 호중구의 풍부한 모집을 트리거합니다. 호중구는 미생물을 죽이는 항균 다양한 공정을 가지고 전문 식세포 있습니다하지만, N. 임질은 호중구 2-5의 존재하에 생존 할 수있다. 같은 N. 같은 방법 세균성 병원균에 대한 이해 임질은, 파괴 억제하고 궁극적으로 일반적으로 적대적 호스트 환경에서 살아 남기 위해 면역 반응을 납치하는 것은 전염성 질병을 퇴치에 대한 새로운 치료법의 개발에 매우 중요합니다. 종종 숙주 세포에서 박테리아의 생존을 조사하는 데 사용 실험 프로토콜은 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석 및 전자 현미경 (가) 있습니다. 콜로니 카운트 분석법에서, 감염 세포의 집단은 ㅁ하는 세제, 예를 들어 (용해된다무형 문화 유산 박테리아는 박테리아를 해방하는) 저항한다. 해물 희석 한천 기반 미디어에 도금하고, 용 해물의 콜로니 형성 단위는 각 시점 및 / 또는 실험 조건에 대해 열거된다. 이 접근법은 전체 세균 집단의 생존 능력을보고하지만, 세포 내 및 세포 생존을 구별 할 수 없다는 것이다. 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석에 변화가 구체적으로 진핵 생물의 세포막 6 교차하는 항생제 겐타 마이신의 무능력에 따라 세포 내 박테리아의 생존을 측정한다. 그러나이 분석은 겐타 마이신 (또는 유사 진핵 막 impermeant 또 다른 항생제)와 내부 박테리아에 액세스 할 수있는 항생제의 무능력에 의해 살해에 감염되는 박테리아에 의존합니다. 따라서, 겐타 마이신 보호 분석은 모든 세균 종의 검사를 위해 효과적 일 또는하지 않을 수 있습니다 높은 세균의 생존을 검사 할 때이러한 호중구로 pinocytic 세포. (박테리아가 집계 또는 다른 개별 박테리아 세포에서 행동 microcolonies을 형성하는 경우 예) 둘 중 어떤 방법을 사용해도 세포 내 현지화 각각의 박테리아 또는 다른 동작을 보여준다. 각각의 외부 및 내부 박테리아의 생존을 조사하는 또 다른 자주 사용되는 방법은 얇은 단면 투과 전자 현미경 (TEM)이다. 이 방법은 상기 세포 내 마커에 대해 골드 결합 항체로 면역 전자 현미경으로 조사 할 수있는 숙주 세포에서 박테리아의 위치 (예 phagosome에, 세포질 autophagosome)에 관한 정보를 제공 할 수 있다는 점에서 유리하다. 그러나 전자 현미경은 세균의 생존 능력을 평가에 특히 구분하지 않습니다. 포함 된 섹션은 우라 닐 아세테이트, 리드 시트 레이트, 또는 다른 전자 밀도 시약으로 염색과 전자 현미경에 의해 촬영하는 경우, 전자 밀도가 박테리아는 생존과 ELEC 간주됩니다트론 - 루슨트 생존 할 7,8. 그러나이 가정은 심각한 혼란 세포막과 세포질의 결여와 만 죽은 박테리아 때문에 전자 - 루슨트 표시, 세균의 생존 능력을 과대 평가. 또한, 일부 세균 종은 어려운 생존력을 결정하게하는, 성장의 그들의 단계에 따라 전자 밀도의 범위를 표시 할 수있다. 대체 또는 이러한 널리 사용되는 방법에 추가로, 여기에서 우리는에 부착 숙주 세포에 의해 내면화 된 박테리아의 생존을 평가하는 세균 생존 능력을 나타내는 형광 염료의 사용을위한 프로토콜과 이론적 근거를 제공한다. 세포 외 박테리아를 식별하기 위해, 감염된 세포는 최초의 렉틴이나 박테리아의 특정 항체로 형광 시약에 노출되어 있습니다. 감염된 세포는 다음 permeabilized 및 세균 생존을위한 대리로, 성능이 저하 된 막 대 손상과 세균에 차별적으로 액세스 할 수있는 DNA 특정 염료에 노출되어 있습니다. 제 P 있음프로피 디움 요오드는 세포막을 손상하고, 따라서 생존 불가능한 것으로 간주되는 그 박테리아 만이 액세스 할 수있는 동안 rotocol, 막 투과성 염색 SYTO9는 총 세균 집단을 식별합니다. 프로피 디움 요오드 및 SYTO9는 바이오 필름 ​​세균 생존 능력을 평가하는 비병원성 박테리아 병원성 차별, 실행 가능한 수 인성 박테리아 9-12을 열거하는 데 사용되었습니다. SYTOX 녹색 생존 할 인구 만 액세스 할 수있는 동안 두 번째 프로토콜에서, 4 &#39;, 6&#39;-diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)는 총 박테리아를 식별합니다. 이들 생존 염료 쌍은 박테리아 세포 내 현지화를 정의하는 예를 들어, 관심있는 단백질과 관련하여, 각 세균의 위치를​​ 결정하기 위해 면역 형광과 결합 될 수있다. 이러한 분석법의 사용은 숙주 세포의 감염시 세균 살상 또는 생존을 초래할 상호 작용에 대한 통찰력을 제공한다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 생존을 평가하기 위해 사용되었다호중구 된 phagosomes 5,13,14의 다른 인구를 포함하여 인간의 기본 호중구와 내부에 부착되어 N. 임질. 그러나, 이들 프로토콜은 프로 식세포, 비전문 식세포 및 원생 동물에 15-24 그람 양성 및 그람 음성 세균의 생존 능력을 평가하기 위해 적용될 수있다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 현재의 프로토콜은 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석 및 전자 현미경 (가) 있습니다. 콜로니 수와 겐타 마이신 보호 분석은 전체 세균 집단의 생존 능력을 평가하고 각각의 세균 가능성을 확인할 수 없습니다. 전자 현미경 개별 박테리아의 생존을 결정하고 숙주 세포에서의 지역화에 관한 정보를 제공하는데 사용될 수있다. 그러나 박테리아는 종종 생존 능력의 평가는 어렵게, 전자 밀도의 범위를 표시합니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 분석은 인간의 기본 호중구에 임균의 생존을 평가하기 위해 원래 개발 된, 그러나해야한다어떤 박테리아 숙주 세포의 상호 작용에 pplicable. 이러한 프로토콜은 막 투과 형광 염료 결합 만 액세스 할 수있는 막 투과성 형광 염료 (요오드화 프로피 듐 및 SYTOX 녹색)로, 모든 박테리아를 얼룩 (SYTO9 및 4 &#39;, 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 [DAPI), 생존 할 박테리아. 종래 진핵 세포 permeabilization에, 항체 또는 형광 시약을 세포 외 박테리아를 식별하기 위해 추가된다. 따라서 이러한 분석은 진핵 세포와 내부에 부착 박테리아의 생존 능력을 차별. 프로토콜은 또한 개별 박테리아 세포 내 현지화를 결정하기 위해, 진핵 세포 마커 형광 항체와 조합 생존력 염료를 사용하여 제공된다. 이 문서에서 설명하는 박테리아의 생존 염료 개별 박테리아의 생존 능력을 평가하고 박테리아가 숙주 세포에서 살아 남기 위치에 관한 정보를 제공하기 위해 기존의 미생물 기술에 민감한 보완 및 / 또는 대안의.

설명 된 프로토콜은 N.의 생존을 검사하는 데 사용되었다 임질은 인간의 기본에 노출 된 후 5,26를 호중구. 호중구는 N. 감염된 임질 및 녹색 형광 생존력 염료 SYTO9 및 빨간색 형광 프로피 디움 아이오다 이드 (도 4A)를 사용하여, 한 프로토콜로 처리. 염료는 우선적으로 숙주 세포의 원형질막 아닌 N.을 투과하는 콜레스테롤 sequesters는 사포닌의 ?...

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Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다.

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.6K 조회수.  University of Virginia Health Sciences Center.  세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다. 

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

연구

면역학 및 감염병학

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...