이 작품은 건강과 조지 E. 휴이트 재단 교제 (AP)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.

겔 전기 영동 기술 참고 : 절차를 시작하기 전에 단백질 샘플을 준비했습니다. 이 첫 번째 단계 동안 샘플에서 단백질은 denaturing polyacrylamide 젤 전기 영동 (PAGE)를 사용하여 분자량에 따라 구분됩니다. 단백질 샘플이 10 분 동안 70 ° C에서 가열되고 나면 리튬 Dodecyl의 황산 (LDS)를 읽어 NuPAGE ® LDS 샘플 버퍼 변성 상태 polypeptides을 유지합니다. 강한 감소 에이전트는 두 번째와 세 번째 차 구조 (DTT, 이황화 채권을 망가뜨릴 수있는)를 제거하기 위해 함께 사용됩니다. 또한, 샘플 단백질은 부정 청구 LDS에서 설명되고 따라서 긍정적인 충전 전극쪽으로 젤의 아크릴 아미드 메쉬를 통해 이동합니다. 이것은 분자량 (킬로 달톤스, KDA로 측정)에 따라 분리 수 있습니다. 샘플 준비 및 PAGE 절차에 대한 자세한 단계별 절차는 Invitrogen 웹사이트 2 발견하거나 NuPAGE 기술 가이드 3인치 수 있습니다 기술 팁 <ol><li> I) 젤의 acrylamid 농도 (하단의 더 나은 해상도로 인해 큰 아크릴 아미드 농도와 함께 : Invitrogen NuPAGE 비스 - 트리스 discontinous 버퍼 시스템에서 단백질과 젤의 후속 분리 범위의 전기 영 동적 이동성은 두 가지 요인에 따라 달라집니다 분자량 단백질)과 II) 실행 버퍼, 걸레 또는 MES의 후행 이온. 당신이 달성하고자하는 분리 범위에 해당하는 조합을 선택하려면, 젤 마이 그 레이션 차트 1 참조하십시오. 웰스의 젤과 전화 번호의 두께는 볼륨 및 각각 부하 계획 샘플의 수량에 따라 달라집니다. </li><li> 당신이 젤의 우물에 샘플을 로드할 때, 적어도 하나의 차선은 분자량 마커 (또는 사다리)에 사용됩니다. 이러한 단백질 표준은 여러 회사에서 상업적으로 사용할 수 있으며, 일반적으로 사용자가 마이 그 레이션 진행에 따라 허용 보이는 밴드를 형성하는만큼, 정의 분자 무게를 가지고 스테인드 단백질의 혼합물로 이루어져 있습니다. 귀하의 겔 해상도와 호환되는 분자 중량의 범위를 선택하십시오. </li><li> 좋은 심지어 마이 그 레이션 패턴을 달성하기 위해 우리는 샘플이나 1X LDS 샘플 버퍼의 비슷한 볼륨으로 젤의 모든 우물을 로딩하는 것이 좋습니다. </li></ol> 이전 기술 참고 : 이전 단계를 시작하기 전에 전송 버퍼 (10 % 메탄올로 1X)과 ° C 추운 방에 4 미리 냉정을 준비합니다. 항체 검출에 액세스할 단백질을하기 위해, 그들은 nitrocellulose 막에 겔에서 electroblotting로 전송됩니다. 단백질 바인딩은 막과 단백질 사이의 소수성 상호 작용뿐만 아니라 요금 상호 작용을 기반으로합니다. (Polyvinylidene 불소 (PVDF) 멤브레인도 대안으로 사용할 수 있습니다.이 경우, PVDF 막는 메탄올 최소한 30초 사용하기 전에 미리 젖다 필요합니다.) 귀하의 연구실이 Invitrogen의 XCell II를 갖춘 경우에는 바이오 래드 미니 트랜스 - 블롯 전기 전송 셀 또는 참조 2-3을 사용하는 경우 송금 절차에 대한 자세한 단계별 프로토콜 참조 4 찾을 수 있습니다 ™ 모듈을 얼룩. 이 과정의 결과로, 단백질은 얇은 표면 레이어에 노출되어 있으며, 검색을위한 준비. 겔에서 막에 단백질의 양도의 균일 성과 전반적인 효과는 가역 개양귀비빛의 S 염료 막 얼룩에서 확인하실 수 있습니다. 개양귀비빛의 S 얼룩 절차 (선택 사항) : <ol><li> 단백질 전송 후 (단백질가 직면하고) 배양 트레이에 멤브레인를 놓습니다. </li><li> 멤브레인을 커버하고 부드러운 교반과 함께 최소한 30 초 정도 부화 개양귀비빛의 S 스테 이닝을 추가합니다. </li><li> 배경 분명히 때까지 증류수로 막을 린스. </li><li> 2-3분 위해 증류수를 실행과 함께 막을 Destain. </li><li> 차단 솔루션의 멤브레인 (아래 참조) 놓습니다. </li></ol> 기술 도움말 : <ol><li> 우리는 단백질이 노출된하는 측면과 샘플의 방향을 나타내기 위해 단백질 전송하기 전에 연필로하여 막을 라벨 부착하는 것이 좋습니다. </li><li> 개양귀비빛의 S 얼룩 및 분자량 마커 모두 다른 항체로 인한 부품을 프로빙에 대한 전송 후 멤브레인를 잘라 사용할 수 있습니다 </li></ol> 면역 : 기술 참고 :이 면역 절차는 단지 지침으로 제공됩니다. 최적화는 각 개미에 대해 필요할 수 있습니다ibody, 구체적인 정보는 상용 항체 대부분의 데이터 시트 (예 : 희석, 부화 시간 등 작업)에서 찾을 수 있습니다. 이 마지막 과정에서 대상 단백질은 특정 항체를 사용하여 감지하고 영화에 밴드로 표시됩니다. 밴드 강도는 대상 단백질 존재의 양에 따라 달라집니다 반면 밴드의 위치는 대상 단백질의 분자량의 따라 달라집니다. 일반적으로이 세 substeps 후에 이루어집니다 : <ol><li> 차단 : 멤브레인 (막의 초과 공간이 일반적인 단백질의 희석 용액으로 뒤덮혀있다)와 항체가 아닌 구체적인 상호 작용을 방지하려면. </li><li> 프로빙 : 관심의 단백질은 특정 의해 감지 <a title="프라이 머리 항체" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">기본 항체</a> . 언바운드 기본 항체가 씻겨되면 멤브레인이 기자에 링크된 다른 항체에 노출 <a title="효소" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">효소</a> , <a title="양고추냉이 퍼옥시데이즈" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">양고추냉이 퍼옥시데이즈</a> (HRP). 이 이차 항체는 일차 항체의 종류 특정 부분 (예 : 안티 - 토끼 이차 항체 어떤 토끼 공급 차 항체에 바인딩합니다)에 대한 감독입니다. </li><li> 검색 : chemiluminescent 에이전트가 보조 항체에 HRP에 노출되면 형광을 발하게 되죠 기판으로 사용됩니다. 이 반응은 장소와 탐지 단백질의 금액에 비례하여 발광을 생산하고 있습니다. 빛이 그런 다음 사진 필름에 의해 감지됩니다. </li></ol> 일반 단계별 절차는 아래 제공됩니다. 기타 자세한 절차는 ECL 플러스 서양 모래 바닥 감지 시약의 사용 설명서 5 또는 데이터 시트 대부분의 상용 항체를 동반에서 찾을 수 있습니다. 부화 시간, 항체 희석하고, 차단 및 세척 솔루션은 경험적으로 각 항체에 대한 최적화해야합니다. 면역 절차 : <ol><li> 전체 멤브레인을 충당하기 위해 PBS 1 % 카제인 차단 솔루션의 충분한 볼륨 잠복기하여 불특정 바인딩을 차단합니다. 상온에서 최소 30 분 락커에 장소 또는 4 박 ° C. </li><li> 기본 항체 (관심의 단백질에 대한 구체적인)와 세포막을 품어. 기본 항체는 솔루션을 차단에 희석한다. 대부분의 항체에 대한 완전한 구속력은 부드러운 선동에 따라 상온에서 1~2시간 보육 후에 이루어진다. 또는, 인큐베이션 단계는 잡음 비율로 신호를 증가 ° C ~ 4에서 하룻밤을 수행할 수 있습니다. </li><li> 솔루션을 (폐기 또는 ° C -20 ° C 반복적으로 사용하기 위해 4 유지) 제거하고 신속 한 번 멤브레인 씻으십시오. 다음 PBS로 3X10 분, 활발한 잡고 상온에서 0.05 % 트윈 20 (PBST). </li><li> 솔루션을 차단에 희석 HRP - 결합 차 항체로 막을 품어. 기본 항체가 자랐어요 종족의 IgG 부분을 인식 항체를 선택합니다. 부화는 부드러운 선동에 따라 상온에서 1 시간 동안 수행됩니다. </li><li> 솔루션을 삭제하고 신속 한 번 멤브레인 씻으십시오. 활발한 잡고 실온에서 PBST로 다음 3X10 분. </li><li> 제조 업체 지침에 따라 chemiluminescent 탐지로 진행합니다. 우리는 GE 헬스케어 (특정 지침에 대한 참조 5 참조)에서 ECL 플러스 서양 모래 바닥 감지 시약을 사용합니다. </li><li> 귀하의 사란 랩에서 막 또는 autoradiography 카세트 내부 주머니와 장소를 놓습니다. 초과 액체 드레인 모든 기포를 제거했는지 확인하십시오. </li><li> 어두운 방에 막 수있는 사진 필름을 쉽게받을 수 있습니다. 1 분 노출 시간 시작하고 원하는 신호 강도에 따라 조정합니다. </li></ol> 기술 도움말 : <ol><li> 비 특정 바인딩의 차단은 단백질의 희석 용액에 멤브레인를 삽입하여 이루어진다. 우리는 일반적으로 1 %의 카제인하지만, 사용 <a title="소 혈청 알부민" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">소 혈청 알부민</a> 의 대안으로 사용할 수 있습니다 (~ 2퍼센트 BSA) 또는 비 뚱뚱한 건조 우유 (~ 5 %). </li><li> 트리스 버퍼 살린 (TBS)이 절차를 통해 대신 PBS에 사용할 수 있습니다. 당신이 phosphospecific 항체와 멤브레인을 탐사하려는 경우 우리는 TBS를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 의 사용은 빛이 어둠 속에서 autoradiography 카세트의 하단에 도청 스티커 (예, Stratagene의 Glogos ® II 방사능의 마커)는 분석 단계 동안 영화와 멤브레인 정렬하는 데 도움이 될 것입니다. </li></ol> 분석 당신이 필름을 노출 했으므로, 당신은 실용적인 측면에서, 모든 서부 하나의 좋은 단일 밴드로 단백질을 보여줄 것을 깨닫게됩니다. Additiona내 밴드는 기본 및 보조 두 항체의 비 특정 바인딩으로 인해 나타날 수 있습니다. 이 배경 신호가 면역 절차를 최적화하여 줄일 수있다. 또한, 적절한 제어 (예 : untransfected 세포, siRNA - 처리 세포 등)이 항체의 특이성과 멤브레인의 대상 단백질의 정확한 위치를 결정하기 위해 도움이 될 것입니다. 필름에있는 멤브레인에서 스테인드 단백질 표준 밴드의 위치를​​ 표시한 다음, 각 분자량의 로그를 플롯 해당 상대 유동성 (X 축)에 대한 단백질 기준 (Y 축)의. 상대 유동성 (RF)는 (겔 앞)로 이동했습니다 단백질 거리 추적 염료 또는 낮은 분자량 마커에 상대적으로 원산지는 점 (젤 상단)에서 이동되었습니다 거리의 비율에 사용되는 용어입니다 . 기울기와 y - 절편의 값을 얻기 위해 표준 곡선의 회귀 라인을 확인합니다. 타겟 단백질의 알려지지 않은 분자 중량 (크기)는 RF 다음과 같은 수정된 방​​정식을 사용하여 추정됩니다 : 분자량 로그 = (경사) (대상 단백질의 이동성 또는 RF) + Y - 절편 (자세한 지침에 대한 참조 6 참조). 표현 수준 approximations은 구조 단백질 (예 : tubulin 또는 굴지)이나 GAPDH 같은 가사 유전자 제품의 위해 대상 단백질의 밴드 강도를 비교하여 촬영하고 있습니다. 이것은 소위 &quot;로딩 제어&quot;는 샘플 사이의 변경해서는 안되며, 특정 주 항체를 사용하여 드러났습니다. 이미지가 더욱 단백질 얼룩의 금액을 비교하여 평가하고 광학 밀도의 측면에서 결과를 수치 densitometry로 분석됩니다.

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Migration+chart:+.">Gel Migration chart: .</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website.">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuPAGE+technical+guide.">NuPAGE technical guide.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+Manual,+Mini+Trans-Blot+Cell.">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction.">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis,+GE+Healthcare+Website.">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , .</li><li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai.">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li><li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3.">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li><li>Penna, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , .</li></ol>

여기에 제시 절차는 MES는 Invitrogen NuPAGE Novex 전기 영동 시스템을 사용하여 페이지를 denaturing의 예로 버퍼를 실행하는 비스 - 트리스 젤을 사용합니다. 또한이 사전 캐스트 겔 시스템은 denaturing 또는 비 - denaturing 조건뿐만 아니라 아래의 단백질 분리 수 있습니다 분자 무게의 광범위한 (위한 36-400 KDA에 BIS - 트리스 젤에 대한 1-200 KDA에서 트리스 - 숙박 아세테이트 젤). 실험에 따라, 당신은 여기에서 설명한 서양 모?...

western blotting using the invitrogen nupage novex bis tris minigels

서양은 모래 바닥 (또는 immunoblotting하는) 조사관은 단백질의 표현을 확인할 수 있도록 표준 실험실 절차, 다른 샘플에서 단백질 현재의 상대적 양을 결정하고, 공동 immunoprecipitation 실험의 결과를 분석할 수 있습니다. 이 방법에서는 대상 단백질은 조직 homogenate 또는 추출물의 주어진 샘플의 특정 기본 항체와 함께 발견됩니다. 분자량에 따른 단백질 분리는 SDS - PAGE를 denaturing 사용하여 이루어진다. 멤브레인로 전송 후, 대상 단백질은 특정 기본 항체와 탐지하고 chemiluminescence에 의해 감지. 최초의 설명 이후 서양 모래 바닥 기법 사전 주조 젤류 및 사용자 친화적인 장비를 포함한 여러 개선을 거쳐있다. 저희 연구실에서는, 우리는 Invitrogen에서 상용 NuPAGE 전기 영동 시스템을 사용하도록 선택했습니다. 그것은 혁신적인 중립 산도, 불연속 SDS - PAGE, 사전 캐스트 미니 젤 시스템입니다. 8개월에서 일년에 이르기까지 사전 주조 젤의 긴 선반 인생); II) 1에서 400 KDA하는 분자 무게의 광범위한 분리 범위는 유형에 따라이 시스템을 포함한 전통적인 Laemmli 기술을 통해 몇 가지 장점을 소개 의 겔 사용되는;) 및 III보다 다재 다능한 (아크릴 아미드 비율, 젤의 종류 및 실행 버퍼의 이온 조성의 범위). 이 비디오 문서에서 설명하는 절차는 4-12% 비스 - 트리스 기울기 젤류 및 MES는 Invitrogen의 NuPAGE 전기 영동 시스템을 사용하여 서양 얼룩을 수행하는 방법에 대한 그림으로, 버퍼를 실행하는 BIS - 트리스 불연속 버퍼 시스템을 사용합니다. 저희 연구실에서는, 우리는이 서양 모래 바닥 방법을 사용하여 다양한 생화 학적 응용 프로그램을위한 좋은 재현성 결과를 획득했습니다.

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Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

이 기술 문서는 Invitrogen에서 상용 NuPAGE 전기 영동 미니 젤 시스템을 사용하여 표준 서양 모래 바닥 절차를 설명합니다.

웨스턴 Invitrogen NuPage Novex BIS 트리스 MiniGels를 사용하여 모래 바닥

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

37.1K 조회수.  University of California, Irvine (UCI). 이 기술 문서는 Invitrogen에서 상용 NuPAGE 전기 영동 미니 젤 시스템을 사용하여 표준 서양 모래 바닥 절차를 설명합니다.

비디오: Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

Endolymphatic 덕트의 말살로 Endolymphatic의 Hydrops의 외과 유도

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

연구

생물학

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

기능화 비스 - 펩타이드의 고상 합성은 방법론 &quot;을 안전 잡아라&quot;사용

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

공장 Vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

서부 블로팅에서 실용적이고 편리하며 신뢰할 수 있는 토탈 단백질 로딩 제어를 위한 V3 얼룩 없는 워크플로우

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

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A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

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Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법<em&gt; 체외</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

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