HCC4017 및 HBEC30KT 세포주 친절 닥터 존 민나의 실험실에 의해 제공되었다. 이 작품은 닥터 리 장에 세실 H.와 아이다 녹색 기금에 의해 지원되었다.

주의 : 방사능과 함께 작업하는 동안, 실험자와 환경 오염을 방지하기 위해 적절한 예방 조치를 취할. 지역의 방사선 안전 지침에 따라 모든 폐기물을 폐기 할 것. 세포의 1. 준비 <ol><li> 포화 상태는 시험 당일의 80 % -90 %에 도달하도록 3.5 cm 플레이트 종자 세포. <ol><li> 세포 생장을 시드하는 세포의 종류와 성장 속도에 따라 다를 수 있습니다. 특정 일수 시약으로 처리하면 세포 생장이 헴 측정 일에 80 % -90 %가되도록 세포를 시드. 3.5 cm 플레이트로부터 얻은 세포의 수가 부족하면, 다음 단계에서 방사성 ALA의 동량 6cm 판을 사용한다. 주 : 개별 판을 쉽게 처리 할 수​​ 있기 때문에 개인 접시를 사용하면 좋습니다. </li></ol></li><li> 헴 측정 전 날, 최종 C에 도달하기 위해 0.1 ~ 0.3 μCi를 [14 C] 5-ALA 차가운 ALA를 추가방사성 물질 작업을위한 작업 영역에 맞는 각각의 배양 접시에 총 ALA 20 μM의 oncentration과 것은 다시 인큐베이터에 접시를 넣어. 이상적으로, 16 시간 동안 방사성 ALA에 품어. 참고 : 방사성 표지 된 5-ALA는 세포 라인에 따라 다를 수 있습니다 요구했다. 적어도 100 분 (CPM) 당 방사능 카운트가 카운트와 연관​​된 오차를 최소화 할 필요가있다. 이 연구중인 세포주 필요한 [14 C] 5-ALA의 최소한의 양을 결정하는 것이 바람직하다. 대부분의 실험에서 0.1 ~ 0.3 μCi를는 좋은 측정 값을 얻기에 충분하다. 감기 ALA의 추가는 선택 사항입니다. </li></ol> 2. 헴 추출 <ol><li> 얼음에 세포 배양 접시를 놓고 방사능 작업 영역에 맞게 가져 가라. <ol><li> 방폭 후드 전체 추출 및 증발 과정을 수행한다. 저장 에테르가 폭발 할 수 있기 때문에,에 에테르 저장하지 않는, 작은 병에 에테르를 사용하고 남은 액체를 증발한 달 이상을위한 개방형 병. 이 가연성이기 때문에 화염, 히터 근처에 아세톤을 사용하지 마십시오. 이 조직 배양 플라스틱을 용해시키는 유리 병에 시약을 함유하는 저장소 아세톤. </li></ol></li><li> 피펫을 사용하여 매체 대기음. 1X 차가운 PBS 1 ml의 세포를 한 번 씻으십시오. PBS를 대기음. </li><li> 고무 경찰관을 사용하여 판의 하단에있는 세포를 플레이트에 1X 차가운 PBS 1 ㎖를 추가하고 수집합니다. 레이블이 사전 냉장 2 ML 튜브 각 판에서 수집 된 세포를 전송합니다. 2 ml의 튜브에있는 모든 세포를 수집합니다. 참고 : 각 판에서 세포를 긁어 각 판의 신선한 고무 경찰관을 사용합니다. 각 플레이트를 들어 네 개의 2 ㎖의 튜브, 1.5 ML 튜브 및 섬광 유리 병을 필요로한다. </li><li> 4 ° C에서 1 분 15,000 XG에 스핀. </li><li> , 피펫을 사용하여 PBS를 꺼내 짧은 스핀을주고 잔여 PBS를 제거합니다. 1X PBS 100 ㎕에 재현 탁 세포. 소용돌이는 세포를 재현 탁과 얼음에 유지합니다. </li><li> 받아 10# 956; L 얼음에 1.5 ml의 microcentrifuge 관 및 저장소에 5 단계 및 전송의 단백질 농도를 측정합니다. 주 : 세포 용해 완충액은 세포에 첨가하고, 이후 단백질 농도를 측정하기 위해 얼음에 보관해야한다. </li><li> 4 ° C에서 30 초 동안 5,000 XG에서 5 단계에서 나머지 90 μl를 스핀; 완전히 200 μL 피펫 팁을 사용하여 PBS를 제거합니다. </li><li> 헴 추출 버퍼 300 μl를 추가 각 튜브 (자료 목록 참조). 그런 다음 15 초 동안 와류 믹스 1 분 동안 얼음에 넣어,이 3 번 반복합니다. <ol><li> 헴 추출 완충액 (HEB)를 첨가하고, 펠렛을 재현 탁 신속 튜브를 와동, 펠릿이 너무 오래 남아 HEB없이 신속 재현 탁되어야하기 때문에 한 번에 하나 또는 두 개의 튜브를 수행. HEB 모든 튜브에 첨가하고, 펠릿 후 재현 탁되면하는 펠릿을위한 HEB 버퍼에 남아 있으면 펠릿 HEB로 완전히 전환되지 않을 수 있음을 8 단계 참고 같이 얼음주기에 15 초간 와동 1 분을 수행 더 길게시간과 신속하게 재현 탁 없습니다. </li></ol></li><li> 30 초 동안 각 튜브와 소용돌이에 디 에틸 에테르 1.2 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 15,000 XG에 스핀. 참고 : 디 에틸 에테르 신속하게 피펫 팁의 부족. 아래로 한 번 또는 두 번이, 피펫 디 에틸 에테르 위를 제어하려면, 이렇게하면 피펫에 디 에틸 에테르를 유지하는 데 도움이됩니다. 신선한 피펫 팁을 사용하는이 때마다 반복합니다. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관 1 ML의 피펫 맨 (에테르) 상을 전송합니다. 9 단계에서와 같이 2 N 염산, 혼합하는 소용돌이와 스핀의 0.5 ML을 추가합니다. 주 : 에테르 염산 상 사이의 간격을 표시하는 것은 곤란하다. 따라서, 그것을 옅은 청색을주고, 실험 기간 동안 충분히 사용될 2 N HCl 용액에 트리 판 블루 소량 추가. 이 두 단계를 구분하는 데 도움이됩니다. 하부상은 청색되며 상부 에테르 상을 무색이 될 것이다. 새로운 튜브로 상단 무색 에테르 위상을 전송하고 낮은 염산 (파란색) 단계를 폐기합니다. </li><li> 10 단계를 반복이번 이상은 2 N HCl로 에테르 상을 씻어. 각 반복하는 동안 새로운 튜브 만 상단 에테르 위상을 전송하고 낮은 염산 단계를 폐기합니다. </li><li> HCl로 세 번째 세척 후, 섬광 유리 병에 1 ML의 피펫 상단 위상을 전송합니다. 화학 후드 O / N에서 샘플을 유지하여 디 에틸 에테르를 증발시켜 샘플을 건조시킵니다. </li></ol> 방사능 3. 측정 <ol><li> 다음 날, 단계 2.12에서 건조 된 샘플 섬광 액 5 mL를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 혼합 잘 흔들어. 섬광 계수기를 이용하여 방사능을 측정한다. </li></ol> 4. 계산 <ol><li> CelLytic M 버퍼의 동일한 양을 사용하여 단계 2.6에서를 Lyse이 세포를 4 ℃에서 5 분 동안 14,000 XG에 스핀 (자료 목록 참조). </li><li> 상청액의 분취 량을 취하여 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정한다. mg의 (TP) 단백질의 총량 = (90 μL의 *의 농. 단백질에(81); G / μL) / 1000 헴 합성 레벨 (방사능 / TP) = 단백질의 pmol의 / mg의. </li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

헴은 호흡 (26)를 통해 세포 에너지의 생성에 중요한 역할을한다. 변경된 헴 대사 암 28,41 포함한 다양한 질환과 관련이있는 것으로 알려져있다. 헴 합성의 억제는 HeLa 세포 26,41 세포주기 정지 및 세포 사멸을 일으키는 것으로 알려져있다. 그것은 높은 헴 합성 수준 폐암 세포 (28)의 진행과 연관되어 있음을 보여왔다. 따라서, 다른 조건 하에서 세포에서 헴 생합성의...

헴은 철 철과 프로토 포르피린 IX의 복잡한 수송 및 거의 모든 살아있는 유기체 1-3에 산소를 이용하기위한 중앙 분자이다. 헴의 독특한 구조는 이원자 가스 및 전자의 캐리어로서 기능 할뿐만 아니라, 다양한 다른 기능 1-5을 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 헴 산소 -6,7-의 전송 및 저장을 위해 미오글로빈 헤모글로빈의 산소에 결합한다. 또한, 호흡시에 시토크롬 전자 캐리어로 작동과 시토크롬 P450 효소에 의해 촉매 8,9 산화 환원 반응에서 전자 공여체로서 작용한다. 헴의 가장 중요한 특징 중 하나는 이러한 유전자 전사, 단백질 합성 및 마이크로 RNA의 생합성과 같은 4 세포 및 분자 공정에서 규제 역할을 할 수 있다는 것이다. 예를 들면, 포유류의 전사 리프레 Bach1의 활성 및 포유류 핵 REC를 제어함으로써 많은 유전자의 전사에 영향을 미치는eptor 목사 erbα 10 ~ 15. 헴 헴 또는 산소 (16)에 응답하여, 호흡 및 산화 적 손상의 제어에 관여하는 유전자의 활성화에 중요한 역할을 헴 활성제 단백질 HAP (1)의 작동을 조절한다. 헴 또한 3,17-20 시그널링 신경 성장 인자 (NGF)를 통한 신경 세포에서의 유전자 전사를 조절한다. 또한 헴 조절 eIF2α 키나아제 (HRI) 21-24의 활성을 조절함으로써 포유류 적혈구 세포에서 단백질 합성을 조절한다. 또한, 헴 적절한 세포 기능 및 세포 증식 4,20,25에 필수적인 티로신 키나제의 Src 릴화 Jak2과 같은 주요 신호 전달 단백질의 활성에 영향을 미친다. 그것은 헬라 세포의 헴 억제 노화 및 세포 사멸 (26)과 관련된 마커의 세포주기 정지 및 활성화가 발생하였습니다. 헴 결핍 또는 헴의 증가 수준은 모두 인간 27 심각한 건강에 미치는 영향과 관련이있다. 최근 분자ND 역학 연구는 높은 헴 섭취 양 협회 및 2 형 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환, 폐암, 대장 암, 췌장암 27,28 등 여러 암과 같은 질병의 위험 증가를 보여 주었다. 정상 및 폐 암 세포 저자 &#39;랩의 짝을 사용하는 것이 암세포 산소 소비, 헴 합성 및 헴 흡수 및 산소 이용률 28에 관여하는 단백질의 수준이 증가 된 것을 발견 하였다. 흥미롭게도, 헴 합성의 억제는 산소 소비, 증식, 암 세포 (28)의 이동과 콜로니 형성을 감소시켰다. 따라서, 내인성 헴의 레벨 변동이 분자 세포 프로세스 3,4,28,29의 조절에 중요한 역할을한다. 포유 동물에서, 헴의 생합성은 미토콘드리아와 세포질 4 (그림 1)에있는 효소를 포함, 여덟 단계에서 발생합니다. 헴 biosyn논문 ALA 신타 (아아) 4,31 의해 촉매 5- 아미노 레 불린 산 (5-ALA)을 형성 글리신 및 숙시 닐 -CoA의 응축과 미토콘드리아의 행렬에서 시작된다. 이것은 nonerythroid 세포에서 헴 생합성에서 속도 제한 단계이다. 5-ALA는 다음 다음 4 단계를 다시는 프로토 포르피린 IX (PPIX)로 변환되어 미토콘드리아로 가져 코프로 포르 피리 노겐 III (CPgenIII)​​를 형성하기 위해 발생하는 세포질에 밖으로 내 보냅니다. 마지막으로, 철의 한 분자는 헴, 페로 (FECH) 1,2,4에 의해 촉매 반응을 생성하기 위해 프로토 포르피린 IX (PPIX)에 통합된다. 헴 생합성의 레벨은 주로 세포 단단히 철 및 헴 (4)에 의해 제어된다 아아 효소의 수준에 따라 달라진다. 헴 생합성 유전자 결함은 특정 미네랄과 비타민 (예를 들어, 리보플라빈, 아연), 독소 (예를 들어, 알루미늄, 납 노출의 가용성에 의해 영향을받을 수있다), 특정 스테로이드 (의 산소 결핍, 발열 및 레벨 예를 들어, 에스트로겐) 32 ~ 35. 헴 합성의 수준은 다양한 질환 상태에 변경된다. 감소 헴 생합성 빈혈뿐만 아니라 신경 질환 3,36의 원인이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 증가 된 헴 생합성은 특정 암 28,37의 진행에 중요한 역할을한다. 헴은 포유 동물의 지방, 적혈구와 신경 세포 4,38-41의 성장, 분화 및 생존에 중요한 것으로 나타났다. 예를 들어, 헴의 결핍은 글루타민산 NMDA (N- 메틸 - 디 - 아스파 테이트) 수용체 (17)의 억제를 통해 기본 마우스 대뇌 피질의 신경 세포의 신경 돌기의 손상으로 이어집니다. 또한 헴 합성의 억제는 인간 경부 상피 암종 HeLa 세포 26,41 프로그래밍 세포 사멸을 야기한다. 따라서, 다른 조건에서 다양한 세포에서 헴 생합성 수준을 측정하는 단계와 progressi 병인 연구에 중요많은 질병의에. 여기에서는 [4- (14) C] 5- 레 블루 닉 산을 사용하여 세포 내 헴 합성의 수준을 측정하기 위해 빠르고 민감한 방법을 설명한다. 이것은 55의 Fe 또는 59의 Fe를 사용하는 다른 방법과 다른 방법이다. 그 방사선이 매우 약한 때문에 우리는 14 C를 사용하여 선호합니다. 반면, 강력한 보호는 철 동위 원소와 협력이 필요합니다. 또한,이 방법은 측정하고 빠른 방식으로 병렬로 서로 다른 셀에서 헴 합성을 비교하기위한 것이다. 헴 절대 수준을 측정하기 위하여, 하나는 HPLC 42,43의 사용을 포함하는 이전에 확립 된 방법을 사용할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Diethy ether</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>HCl (Hydrochloric acid)</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Scintillation cocktail&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>882470</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>Radiolabeled 4-&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C aminolevulinic acid</td><td>Perkin-Elmer life sciences</td><td></td><td>Store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CelLytic M</td><td>Sigma</td><td>C2978</td><td>Mammalian cell lysis reagent</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specific reagent&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Component&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Dispense&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Heme extraction buffer:&lt;br /&gt;Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)</td><td>Acetone&lt;br /&gt; Concentrated HCl&lt;br /&gt;Water</td><td>25 ml&lt;br /&gt;1.3 ml&lt;br /&gt;5 ml</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

헴은 헤모글로빈, 미오글로빈 및 사이토 크롬 등 hemoproteins로 알려진 단백질의 광범위한 보철 기로서 기능한다. 그것은 같은 유전자 전사, 번역, 세포 분화 및 세포 증식 등의 다양한 분자와 세포 과정에 참여하고있다. 헴 생합성 레벨이 다른 조직과 세포 유형에 걸쳐 다양하며, 빈혈, 신경 장애 및 암과 같은 질병 상태로 변경된다. 이 기술을 사용하여 [4- (14) C] 5- 아미노 레 불린 산 ([14 C] 5-ALA), 포유류 세포에서 헴 합성의 수준을 측정하는 헴 생합성 경로에서 초기 전구체 중 하나. 이 분석은 헴에 혼입 된 방사능의 측정 및 헴 추출하여 [14 C] 5-ALA를 가진 세포의 배양을 수반한다. 이 절차는 정확하고 신속하다. 이 방법은 헴 생합성의 상대적인 수준보다는 헴 총 함량을 측정한다. 이 TECHN의 사용을 설명하기 위해헴 생합성 수준 개새끼 것은 여러 포유 동물 세포주에서 측정 하였다.

이 방법은 암 (HCC4017) 폐 세포 대 정상 (HBEC30KT)에서 헴 합성 수준을 비교하기 위해 사용되었다.이 정상 폐 세포 (HBEC30KT)보다 암세포 (HCC4017)에서 헴 합성의 더 높은 수준을 보여준다. 헴 합성의 레벨은 미토콘드리아 uncoupler 보닐 시안화 -3- chlorophenylhydrazone (CCCP)의 존재 하에서 정상 및 암 세포에서 측정 하였다. 세포는 헴 합성 수준을 측정하기 전에 24 시간 동안 10 μM의 CCCP ?...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

measurement-of-heme-synthesis-levels-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K 조회수.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

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Synthesis and Catalytic Performance of Gold Intercalated in the Walls of Mesoporous Silica

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties of the materials were investigated. We used a one pot sol-gel approach to intercalate gold nano particles in the walls of mesoporous silica. To start with the synthesis, P123 was used as template to form micelles. Then TESPTS was used as a surface modification agent to intercalate gold nano particles. Following this process, TEOS was added in as a silica source which underwent a polymerization process in acid environment. After hydrothermal processing and calcination, the final product was acquired. Several techniques were utilized to characterize the porosity, morphology and structure of the gold intercalated mesoporous silica. The results showed a stable structure of mesoporous silica after gold intercalation. Through the oxidation of benzyl alcohol as a benchmark reaction, the GMS materials showed high selectivity and recyclability.

Here, we present a protocol with a sol-gel process to synthesize gold intercalated in the walls of mesoporous materials (GMS), which is confirmed to possess a mesoporous matrix with gold intercalated in the walls imparting great stability and recyclability.

합성과 메조 포러스 실리카의 벽에 금 층상의 촉매 성능

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties ...

연구

화학

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Neonatal hypoxia ischemia is characterized by inadequate blood perfusion of a tissue or a systemic lack of oxygen. This condition is thought to cause/exacerbate well documented neonatal disorders including neurological impairment 1-3. Decreased adenosine triphosphate production occurs due to a lack of oxidative phosphorylation. To compensate for this energy deprived state molecules containing high energy phosphate bonds are degraded 2. This leads to increased levels of adenosine which is subsequently degraded to inosine, hypoxanthine, xanthine, and finally to uric acid. The final two steps in this degradation process are performed by xanthine oxidoreductase. This enzyme exists in the form of xanthine dehydrogenase under normoxic conditions but is converted to xanthine oxidase (XO) under hypoxia-reperfusion circumstances 4, 5. Unlike xanthine dehydrogenase, XO generates hydrogen peroxide as a byproduct of purine degradation 4, 6. This hydrogen peroxide in combination with other reactive oxygen species (ROS) produced during hypoxia, oxidizes uric acid to form allantoin and reacts with lipid membranes to generate malondialdehyde (MDA) 7-9. Most mammals, humans exempted, possess the enzyme uricase, which converts uric acid to allantoin. In humans, however, allantoin can only be formed by ROS-mediated oxidation of uric acid. Because of this, allantoin is considered to be a marker of oxidative stress in humans, but not in the mammals that have uricase.
We describe methods employing high pressure liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography mass spectrometry (GCMS) to measure biochemical markers of neonatal hypoxia ischemia. Human blood is used for most tests. Animal blood may also be used while recognizing the potential for uricase-generated allantoin. Purine metabolites were linked to hypoxia as early as 1963 and the reliability of hypoxanthine, xanthine, and uric acid as biochemical indicators of neonatal hypoxia was validated by several investigators 10-13. The HPLC method used for the quantification of purine compounds is fast, reliable, and reproducible. The GC/MS method used for the quantification of allantoin, a relatively new marker of oxidative stress, was adapted from Gruber et al 7. This method avoids certain artifacts and requires low volumes of sample. Methods used for synthesis of MMDA were described elsewhere 14, 15. GC/MS based quantification of MDA was adapted from Paroni et al. and Cighetti et al. 16, 17. Xanthine oxidase activity was measured by HPLC by quantifying the conversion of pterin to isoxanthopterin 18. This approach proved to be sufficiently sensitive and reproducible.

A method is described to measure biochemical markers of neonatal hypoxia-ischemia. The approach utilizes high pressure liquid chromatography (HPLC) and Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC/MS).

신생아 Hypoxia의 생화 학적 측정

Neonatal hypoxia ischemia is characterized by inadequate blood perfusion of a tissue or a systemic lack of oxygen. This condition is thought to ...

의학

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

세포와 조직에서 코엔자임 A의 정량화

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

생화학

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

갓 분리된 마우스 간세포의 현탁액에서의 지방산 β산화의 측정

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

면역학 및 감염병학

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

생물학

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

생체공학

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The use of experimental animal models of iron overload or deficiency has been instrumental to advance knowledge of the mechanisms involved in the systemic and cellular regulation of iron homeostasis. The measurement of total iron levels in animal tissues is commonly performed with atomic absorption spectroscopy or with a colorimetric assay based on the reaction of non-heme iron with a bathophenanthroline reagent. For many years, the colorimetric assay has been used for the measurement of the non-heme iron content in a wide range of animal tissues. Unlike atomic absorption spectroscopy, it excludes the contribution of heme iron derived from hemoglobin contained in red blood cells. Moreover, it does not require sophisticated analytical skills or highly expensive equipment, and can thus be easily implemented in most laboratories. Finally, the colorimetric assay can be either cuvette-based or adapted to a microplate format, allowing higher sample throughput. The present work provides a well-established protocol that is suited for the detection of alterations in tissue iron levels in a variety of experimental animal models of iron overload or iron deficiency.

Here, a protocol for the measurement of the non-heme iron content in animal tissues is provided, using a simple, well-established colorimetric assay that can be easily implemented in most laboratories.

Bathophenanthroline-based Colorimetric Assay를 이용한 조직 비헴철 함량 측정

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

유세포분석을 사용한 마우스 뇌 히스톤 변형 정량화

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

저자 스포트라이트: 유전자 발현 조절 연구의 개선 사항

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

요약

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Bathophenanthroline-based Colorimetric Assay를 이용한 조직 비헴철 함량 측정

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

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