HCC4017 및 HBEC30KT 세포주 친절 닥터 존 민나의 실험실에 의해 제공되었다. 이 작품은 닥터 리 장에 세실 H.와 아이다 녹색 기금에 의해 지원되었다.

주의 : 방사능과 함께 작업하는 동안, 실험자와 환경 오염을 방지하기 위해 적절한 예방 조치를 취할. 지역의 방사선 안전 지침에 따라 모든 폐기물을 폐기 할 것. 세포의 1. 준비 <ol><li> 포화 상태는 시험 당일의 80 % -90 %에 도달하도록 3.5 cm 플레이트 종자 세포. <ol><li> 세포 생장을 시드하는 세포의 종류와 성장 속도에 따라 다를 수 있습니다. 특정 일수 시약으로 처리하면 세포 생장이 헴 측정 일에 80 % -90 %가되도록 세포를 시드. 3.5 cm 플레이트로부터 얻은 세포의 수가 부족하면, 다음 단계에서 방사성 ALA의 동량 6cm 판을 사용한다. 주 : 개별 판을 쉽게 처리 할 수​​ 있기 때문에 개인 접시를 사용하면 좋습니다. </li></ol></li><li> 헴 측정 전 날, 최종 C에 도달하기 위해 0.1 ~ 0.3 μCi를 [14 C] 5-ALA 차가운 ALA를 추가방사성 물질 작업을위한 작업 영역에 맞는 각각의 배양 접시에 총 ALA 20 μM의 oncentration과 것은 다시 인큐베이터에 접시를 넣어. 이상적으로, 16 시간 동안 방사성 ALA에 품어. 참고 : 방사성 표지 된 5-ALA는 세포 라인에 따라 다를 수 있습니다 요구했다. 적어도 100 분 (CPM) 당 방사능 카운트가 카운트와 연관​​된 오차를 최소화 할 필요가있다. 이 연구중인 세포주 필요한 [14 C] 5-ALA의 최소한의 양을 결정하는 것이 바람직하다. 대부분의 실험에서 0.1 ~ 0.3 μCi를는 좋은 측정 값을 얻기에 충분하다. 감기 ALA의 추가는 선택 사항입니다. </li></ol> 2. 헴 추출 <ol><li> 얼음에 세포 배양 접시를 놓고 방사능 작업 영역에 맞게 가져 가라. <ol><li> 방폭 후드 전체 추출 및 증발 과정을 수행한다. 저장 에테르가 폭발 할 수 있기 때문에,에 에테르 저장하지 않는, 작은 병에 에테르를 사용하고 남은 액체를 증발한 달 이상을위한 개방형 병. 이 가연성이기 때문에 화염, 히터 근처에 아세톤을 사용하지 마십시오. 이 조직 배양 플라스틱을 용해시키는 유리 병에 시약을 함유하는 저장소 아세톤. </li></ol></li><li> 피펫을 사용하여 매체 대기음. 1X 차가운 PBS 1 ml의 세포를 한 번 씻으십시오. PBS를 대기음. </li><li> 고무 경찰관을 사용하여 판의 하단에있는 세포를 플레이트에 1X 차가운 PBS 1 ㎖를 추가하고 수집합니다. 레이블이 사전 냉장 2 ML 튜브 각 판에서 수집 된 세포를 전송합니다. 2 ml의 튜브에있는 모든 세포를 수집합니다. 참고 : 각 판에서 세포를 긁어 각 판의 신선한 고무 경찰관을 사용합니다. 각 플레이트를 들어 네 개의 2 ㎖의 튜브, 1.5 ML 튜브 및 섬광 유리 병을 필요로한다. </li><li> 4 ° C에서 1 분 15,000 XG에 스핀. </li><li> , 피펫을 사용하여 PBS를 꺼내 짧은 스핀을주고 잔여 PBS를 제거합니다. 1X PBS 100 ㎕에 재현 탁 세포. 소용돌이는 세포를 재현 탁과 얼음에 유지합니다. </li><li> 받아 10# 956; L 얼음에 1.5 ml의 microcentrifuge 관 및 저장소에 5 단계 및 전송의 단백질 농도를 측정합니다. 주 : 세포 용해 완충액은 세포에 첨가하고, 이후 단백질 농도를 측정하기 위해 얼음에 보관해야한다. </li><li> 4 ° C에서 30 초 동안 5,000 XG에서 5 단계에서 나머지 90 μl를 스핀; 완전히 200 μL 피펫 팁을 사용하여 PBS를 제거합니다. </li><li> 헴 추출 버퍼 300 μl를 추가 각 튜브 (자료 목록 참조). 그런 다음 15 초 동안 와류 믹스 1 분 동안 얼음에 넣어,이 3 번 반복합니다. <ol><li> 헴 추출 완충액 (HEB)를 첨가하고, 펠렛을 재현 탁 신속 튜브를 와동, 펠릿이 너무 오래 남아 HEB없이 신속 재현 탁되어야하기 때문에 한 번에 하나 또는 두 개의 튜브를 수행. HEB 모든 튜브에 첨가하고, 펠릿 후 재현 탁되면하는 펠릿을위한 HEB 버퍼에 남아 있으면 펠릿 HEB로 완전히 전환되지 않을 수 있음을 8 단계 참고 같이 얼음주기에 15 초간 와동 1 분을 수행 더 길게시간과 신속하게 재현 탁 없습니다. </li></ol></li><li> 30 초 동안 각 튜브와 소용돌이에 디 에틸 에테르 1.2 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 15,000 XG에 스핀. 참고 : 디 에틸 에테르 신속하게 피펫 팁의 부족. 아래로 한 번 또는 두 번이, 피펫 디 에틸 에테르 위를 제어하려면, 이렇게하면 피펫에 디 에틸 에테르를 유지하는 데 도움이됩니다. 신선한 피펫 팁을 사용하는이 때마다 반복합니다. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관 1 ML의 피펫 맨 (에테르) 상을 전송합니다. 9 단계에서와 같이 2 N 염산, 혼합하는 소용돌이와 스핀의 0.5 ML을 추가합니다. 주 : 에테르 염산 상 사이의 간격을 표시하는 것은 곤란하다. 따라서, 그것을 옅은 청색을주고, 실험 기간 동안 충분히 사용될 2 N HCl 용액에 트리 판 블루 소량 추가. 이 두 단계를 구분하는 데 도움이됩니다. 하부상은 청색되며 상부 에테르 상을 무색이 될 것이다. 새로운 튜브로 상단 무색 에테르 위상을 전송하고 낮은 염산 (파란색) 단계를 폐기합니다. </li><li> 10 단계를 반복이번 이상은 2 N HCl로 에테르 상을 씻어. 각 반복하는 동안 새로운 튜브 만 상단 에테르 위상을 전송하고 낮은 염산 단계를 폐기합니다. </li><li> HCl로 세 번째 세척 후, 섬광 유리 병에 1 ML의 피펫 상단 위상을 전송합니다. 화학 후드 O / N에서 샘플을 유지하여 디 에틸 에테르를 증발시켜 샘플을 건조시킵니다. </li></ol> 방사능 3. 측정 <ol><li> 다음 날, 단계 2.12에서 건조 된 샘플 섬광 액 5 mL를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 혼합 잘 흔들어. 섬광 계수기를 이용하여 방사능을 측정한다. </li></ol> 4. 계산 <ol><li> CelLytic M 버퍼의 동일한 양을 사용하여 단계 2.6에서를 Lyse이 세포를 4 ℃에서 5 분 동안 14,000 XG에 스핀 (자료 목록 참조). </li><li> 상청액의 분취 량을 취하여 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정한다. mg의 (TP) 단백질의 총량 = (90 μL의 *의 농. 단백질에(81); G / μL) / 1000 헴 합성 레벨 (방사능 / TP) = 단백질의 pmol의 / mg의. </li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

헴은 호흡 (26)를 통해 세포 에너지의 생성에 중요한 역할을한다. 변경된 헴 대사 암 28,41 포함한 다양한 질환과 관련이있는 것으로 알려져있다. 헴 합성의 억제는 HeLa 세포 26,41 세포주기 정지 및 세포 사멸을 일으키는 것으로 알려져있다. 그것은 높은 헴 합성 수준 폐암 세포 (28)의 진행과 연관되어 있음을 보여왔다. 따라서, 다른 조건 하에서 세포에서 헴 생합성의...

헴은 철 철과 프로토 포르피린 IX의 복잡한 수송 및 거의 모든 살아있는 유기체 1-3에 산소를 이용하기위한 중앙 분자이다. 헴의 독특한 구조는 이원자 가스 및 전자의 캐리어로서 기능 할뿐만 아니라, 다양한 다른 기능 1-5을 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 헴 산소 -6,7-의 전송 및 저장을 위해 미오글로빈 헤모글로빈의 산소에 결합한다. 또한, 호흡시에 시토크롬 전자 캐리어로 작동과 시토크롬 P450 효소에 의해 촉매 8,9 산화 환원 반응에서 전자 공여체로서 작용한다. 헴의 가장 중요한 특징 중 하나는 이러한 유전자 전사, 단백질 합성 및 마이크로 RNA의 생합성과 같은 4 세포 및 분자 공정에서 규제 역할을 할 수 있다는 것이다. 예를 들면, 포유류의 전사 리프레 Bach1의 활성 및 포유류 핵 REC를 제어함으로써 많은 유전자의 전사에 영향을 미치는eptor 목사 erbα 10 ~ 15. 헴 헴 또는 산소 (16)에 응답하여, 호흡 및 산화 적 손상의 제어에 관여하는 유전자의 활성화에 중요한 역할을 헴 활성제 단백질 HAP (1)의 작동을 조절한다. 헴 또한 3,17-20 시그널링 신경 성장 인자 (NGF)를 통한 신경 세포에서의 유전자 전사를 조절한다. 또한 헴 조절 eIF2α 키나아제 (HRI) 21-24의 활성을 조절함으로써 포유류 적혈구 세포에서 단백질 합성을 조절한다. 또한, 헴 적절한 세포 기능 및 세포 증식 4,20,25에 필수적인 티로신 키나제의 Src 릴화 Jak2과 같은 주요 신호 전달 단백질의 활성에 영향을 미친다. 그것은 헬라 세포의 헴 억제 노화 및 세포 사멸 (26)과 관련된 마커의 세포주기 정지 및 활성화가 발생하였습니다. 헴 결핍 또는 헴의 증가 수준은 모두 인간 27 심각한 건강에 미치는 영향과 관련이있다. 최근 분자ND 역학 연구는 높은 헴 섭취 양 협회 및 2 형 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환, 폐암, 대장 암, 췌장암 27,28 등 여러 암과 같은 질병의 위험 증가를 보여 주었다. 정상 및 폐 암 세포 저자 &#39;랩의 짝을 사용하는 것이 암세포 산소 소비, 헴 합성 및 헴 흡수 및 산소 이용률 28에 관여하는 단백질의 수준이 증가 된 것을 발견 하였다. 흥미롭게도, 헴 합성의 억제는 산소 소비, 증식, 암 세포 (28)의 이동과 콜로니 형성을 감소시켰다. 따라서, 내인성 헴의 레벨 변동이 분자 세포 프로세스 3,4,28,29의 조절에 중요한 역할을한다. 포유 동물에서, 헴의 생합성은 미토콘드리아와 세포질 4 (그림 1)에있는 효소를 포함, 여덟 단계에서 발생합니다. 헴 biosyn논문 ALA 신타 (아아) 4,31 의해 촉매 5- 아미노 레 불린 산 (5-ALA)을 형성 글리신 및 숙시 닐 -CoA의 응축과 미토콘드리아의 행렬에서 시작된다. 이것은 nonerythroid 세포에서 헴 생합성에서 속도 제한 단계이다. 5-ALA는 다음 다음 4 단계를 다시는 프로토 포르피린 IX (PPIX)로 변환되어 미토콘드리아로 가져 코프로 포르 피리 노겐 III (CPgenIII)​​를 형성하기 위해 발생하는 세포질에 밖으로 내 보냅니다. 마지막으로, 철의 한 분자는 헴, 페로 (FECH) 1,2,4에 의해 촉매 반응을 생성하기 위해 프로토 포르피린 IX (PPIX)에 통합된다. 헴 생합성의 레벨은 주로 세포 단단히 철 및 헴 (4)에 의해 제어된다 아아 효소의 수준에 따라 달라진다. 헴 생합성 유전자 결함은 특정 미네랄과 비타민 (예를 들어, 리보플라빈, 아연), 독소 (예를 들어, 알루미늄, 납 노출의 가용성에 의해 영향을받을 수있다), 특정 스테로이드 (의 산소 결핍, 발열 및 레벨 예를 들어, 에스트로겐) 32 ~ 35. 헴 합성의 수준은 다양한 질환 상태에 변경된다. 감소 헴 생합성 빈혈뿐만 아니라 신경 질환 3,36의 원인이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 증가 된 헴 생합성은 특정 암 28,37의 진행에 중요한 역할을한다. 헴은 포유 동물의 지방, 적혈구와 신경 세포 4,38-41의 성장, 분화 및 생존에 중요한 것으로 나타났다. 예를 들어, 헴의 결핍은 글루타민산 NMDA (N- 메틸 - 디 - 아스파 테이트) 수용체 (17)의 억제를 통해 기본 마우스 대뇌 피질의 신경 세포의 신경 돌기의 손상으로 이어집니다. 또한 헴 합성의 억제는 인간 경부 상피 암종 HeLa 세포 26,41 프로그래밍 세포 사멸을 야기한다. 따라서, 다른 조건에서 다양한 세포에서 헴 생합성 수준을 측정하는 단계와 progressi 병인 연구에 중요많은 질병의에. 여기에서는 [4- (14) C] 5- 레 블루 닉 산을 사용하여 세포 내 헴 합성의 수준을 측정하기 위해 빠르고 민감한 방법을 설명한다. 이것은 55의 Fe 또는 59의 Fe를 사용하는 다른 방법과 다른 방법이다. 그 방사선이 매우 약한 때문에 우리는 14 C를 사용하여 선호합니다. 반면, 강력한 보호는 철 동위 원소와 협력이 필요합니다. 또한,이 방법은 측정하고 빠른 방식으로 병렬로 서로 다른 셀에서 헴 합성을 비교하기위한 것이다. 헴 절대 수준을 측정하기 위하여, 하나는 HPLC 42,43의 사용을 포함하는 이전에 확립 된 방법을 사용할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

헴은 헤모글로빈, 미오글로빈 및 사이토 크롬 등 hemoproteins로 알려진 단백질의 광범위한 보철 기로서 기능한다. 그것은 같은 유전자 전사, 번역, 세포 분화 및 세포 증식 등의 다양한 분자와 세포 과정에 참여하고있다. 헴 생합성 레벨이 다른 조직과 세포 유형에 걸쳐 다양하며, 빈혈, 신경 장애 및 암과 같은 질병 상태로 변경된다. 이 기술을 사용하여 [4- (14) C] 5- 아미노 레 불린 산 ([14 C] 5-ALA), 포유류 세포에서 헴 합성의 수준을 측정하는 헴 생합성 경로에서 초기 전구체 중 하나. 이 분석은 헴에 혼입 된 방사능의 측정 및 헴 추출하여 [14 C] 5-ALA를 가진 세포의 배양을 수반한다. 이 절차는 정확하고 신속하다. 이 방법은 헴 생합성의 상대적인 수준보다는 헴 총 함량을 측정한다. 이 TECHN의 사용을 설명하기 위해헴 생합성 수준 개새끼 것은 여러 포유 동물 세포주에서 측정 하였다.

이 방법은 암 (HCC4017) 폐 세포 대 정상 (HBEC30KT)에서 헴 합성 수준을 비교하기 위해 사용되었다.이 정상 폐 세포 (HBEC30KT)보다 암세포 (HCC4017)에서 헴 합성의 더 높은 수준을 보여준다. 헴 합성의 레벨은 미토콘드리아 uncoupler 보닐 시안화 -3- chlorophenylhydrazone (CCCP)의 존재 하에서 정상 및 암 세포에서 측정 하였다. 세포는 헴 합성 수준을 측정하기 전에 24 시간 동안 10 μM의 CCCP ?...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

measurement-of-heme-synthesis-levels-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K 조회수.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

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Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

포유 동물 세포를 Trypsinizing 및 Subculturing

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

연구

생물학

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

규아 샤 프로 시저에 헴 Oxygenase - 1 Upregulation의 Bioluminescence 이미징

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

자기편 및 비 점착 성의 포유 동물 세포의 현장 Subcellular 분별 (분리)에서

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

임무 LentiPlex는 포유 동물 세포에서 shRNA 도서관 검사를 풀링

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...