HCC4017 및 HBEC30KT 세포주 친절 닥터 존 민나의 실험실에 의해 제공되었다. 이 작품은 닥터 리 장에 세실 H.와 아이다 녹색 기금에 의해 지원되었다.

주의 : 방사능과 함께 작업하는 동안, 실험자와 환경 오염을 방지하기 위해 적절한 예방 조치를 취할. 지역의 방사선 안전 지침에 따라 모든 폐기물을 폐기 할 것. 세포의 1. 준비 <ol><li> 포화 상태는 시험 당일의 80 % -90 %에 도달하도록 3.5 cm 플레이트 종자 세포. <ol><li> 세포 생장을 시드하는 세포의 종류와 성장 속도에 따라 다를 수 있습니다. 특정 일수 시약으로 처리하면 세포 생장이 헴 측정 일에 80 % -90 %가되도록 세포를 시드. 3.5 cm 플레이트로부터 얻은 세포의 수가 부족하면, 다음 단계에서 방사성 ALA의 동량 6cm 판을 사용한다. 주 : 개별 판을 쉽게 처리 할 수​​ 있기 때문에 개인 접시를 사용하면 좋습니다. </li></ol></li><li> 헴 측정 전 날, 최종 C에 도달하기 위해 0.1 ~ 0.3 μCi를 [14 C] 5-ALA 차가운 ALA를 추가방사성 물질 작업을위한 작업 영역에 맞는 각각의 배양 접시에 총 ALA 20 μM의 oncentration과 것은 다시 인큐베이터에 접시를 넣어. 이상적으로, 16 시간 동안 방사성 ALA에 품어. 참고 : 방사성 표지 된 5-ALA는 세포 라인에 따라 다를 수 있습니다 요구했다. 적어도 100 분 (CPM) 당 방사능 카운트가 카운트와 연관​​된 오차를 최소화 할 필요가있다. 이 연구중인 세포주 필요한 [14 C] 5-ALA의 최소한의 양을 결정하는 것이 바람직하다. 대부분의 실험에서 0.1 ~ 0.3 μCi를는 좋은 측정 값을 얻기에 충분하다. 감기 ALA의 추가는 선택 사항입니다. </li></ol> 2. 헴 추출 <ol><li> 얼음에 세포 배양 접시를 놓고 방사능 작업 영역에 맞게 가져 가라. <ol><li> 방폭 후드 전체 추출 및 증발 과정을 수행한다. 저장 에테르가 폭발 할 수 있기 때문에,에 에테르 저장하지 않는, 작은 병에 에테르를 사용하고 남은 액체를 증발한 달 이상을위한 개방형 병. 이 가연성이기 때문에 화염, 히터 근처에 아세톤을 사용하지 마십시오. 이 조직 배양 플라스틱을 용해시키는 유리 병에 시약을 함유하는 저장소 아세톤. </li></ol></li><li> 피펫을 사용하여 매체 대기음. 1X 차가운 PBS 1 ml의 세포를 한 번 씻으십시오. PBS를 대기음. </li><li> 고무 경찰관을 사용하여 판의 하단에있는 세포를 플레이트에 1X 차가운 PBS 1 ㎖를 추가하고 수집합니다. 레이블이 사전 냉장 2 ML 튜브 각 판에서 수집 된 세포를 전송합니다. 2 ml의 튜브에있는 모든 세포를 수집합니다. 참고 : 각 판에서 세포를 긁어 각 판의 신선한 고무 경찰관을 사용합니다. 각 플레이트를 들어 네 개의 2 ㎖의 튜브, 1.5 ML 튜브 및 섬광 유리 병을 필요로한다. </li><li> 4 ° C에서 1 분 15,000 XG에 스핀. </li><li> , 피펫을 사용하여 PBS를 꺼내 짧은 스핀을주고 잔여 PBS를 제거합니다. 1X PBS 100 ㎕에 재현 탁 세포. 소용돌이는 세포를 재현 탁과 얼음에 유지합니다. </li><li> 받아 10# 956; L 얼음에 1.5 ml의 microcentrifuge 관 및 저장소에 5 단계 및 전송의 단백질 농도를 측정합니다. 주 : 세포 용해 완충액은 세포에 첨가하고, 이후 단백질 농도를 측정하기 위해 얼음에 보관해야한다. </li><li> 4 ° C에서 30 초 동안 5,000 XG에서 5 단계에서 나머지 90 μl를 스핀; 완전히 200 μL 피펫 팁을 사용하여 PBS를 제거합니다. </li><li> 헴 추출 버퍼 300 μl를 추가 각 튜브 (자료 목록 참조). 그런 다음 15 초 동안 와류 믹스 1 분 동안 얼음에 넣어,이 3 번 반복합니다. <ol><li> 헴 추출 완충액 (HEB)를 첨가하고, 펠렛을 재현 탁 신속 튜브를 와동, 펠릿이 너무 오래 남아 HEB없이 신속 재현 탁되어야하기 때문에 한 번에 하나 또는 두 개의 튜브를 수행. HEB 모든 튜브에 첨가하고, 펠릿 후 재현 탁되면하는 펠릿을위한 HEB 버퍼에 남아 있으면 펠릿 HEB로 완전히 전환되지 않을 수 있음을 8 단계 참고 같이 얼음주기에 15 초간 와동 1 분을 수행 더 길게시간과 신속하게 재현 탁 없습니다. </li></ol></li><li> 30 초 동안 각 튜브와 소용돌이에 디 에틸 에테르 1.2 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 15,000 XG에 스핀. 참고 : 디 에틸 에테르 신속하게 피펫 팁의 부족. 아래로 한 번 또는 두 번이, 피펫 디 에틸 에테르 위를 제어하려면, 이렇게하면 피펫에 디 에틸 에테르를 유지하는 데 도움이됩니다. 신선한 피펫 팁을 사용하는이 때마다 반복합니다. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관 1 ML의 피펫 맨 (에테르) 상을 전송합니다. 9 단계에서와 같이 2 N 염산, 혼합하는 소용돌이와 스핀의 0.5 ML을 추가합니다. 주 : 에테르 염산 상 사이의 간격을 표시하는 것은 곤란하다. 따라서, 그것을 옅은 청색을주고, 실험 기간 동안 충분히 사용될 2 N HCl 용액에 트리 판 블루 소량 추가. 이 두 단계를 구분하는 데 도움이됩니다. 하부상은 청색되며 상부 에테르 상을 무색이 될 것이다. 새로운 튜브로 상단 무색 에테르 위상을 전송하고 낮은 염산 (파란색) 단계를 폐기합니다. </li><li> 10 단계를 반복이번 이상은 2 N HCl로 에테르 상을 씻어. 각 반복하는 동안 새로운 튜브 만 상단 에테르 위상을 전송하고 낮은 염산 단계를 폐기합니다. </li><li> HCl로 세 번째 세척 후, 섬광 유리 병에 1 ML의 피펫 상단 위상을 전송합니다. 화학 후드 O / N에서 샘플을 유지하여 디 에틸 에테르를 증발시켜 샘플을 건조시킵니다. </li></ol> 방사능 3. 측정 <ol><li> 다음 날, 단계 2.12에서 건조 된 샘플 섬광 액 5 mL를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 혼합 잘 흔들어. 섬광 계수기를 이용하여 방사능을 측정한다. </li></ol> 4. 계산 <ol><li> CelLytic M 버퍼의 동일한 양을 사용하여 단계 2.6에서를 Lyse이 세포를 4 ℃에서 5 분 동안 14,000 XG에 스핀 (자료 목록 참조). </li><li> 상청액의 분취 량을 취하여 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정한다. mg의 (TP) 단백질의 총량 = (90 μL의 *의 농. 단백질에(81); G / μL) / 1000 헴 합성 레벨 (방사능 / TP) = 단백질의 pmol의 / mg의. </li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

헴은 호흡 (26)를 통해 세포 에너지의 생성에 중요한 역할을한다. 변경된 헴 대사 암 28,41 포함한 다양한 질환과 관련이있는 것으로 알려져있다. 헴 합성의 억제는 HeLa 세포 26,41 세포주기 정지 및 세포 사멸을 일으키는 것으로 알려져있다. 그것은 높은 헴 합성 수준 폐암 세포 (28)의 진행과 연관되어 있음을 보여왔다. 따라서, 다른 조건 하에서 세포에서 헴 생합성의...

헴은 철 철과 프로토 포르피린 IX의 복잡한 수송 및 거의 모든 살아있는 유기체 1-3에 산소를 이용하기위한 중앙 분자이다. 헴의 독특한 구조는 이원자 가스 및 전자의 캐리어로서 기능 할뿐만 아니라, 다양한 다른 기능 1-5을 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 헴 산소 -6,7-의 전송 및 저장을 위해 미오글로빈 헤모글로빈의 산소에 결합한다. 또한, 호흡시에 시토크롬 전자 캐리어로 작동과 시토크롬 P450 효소에 의해 촉매 8,9 산화 환원 반응에서 전자 공여체로서 작용한다. 헴의 가장 중요한 특징 중 하나는 이러한 유전자 전사, 단백질 합성 및 마이크로 RNA의 생합성과 같은 4 세포 및 분자 공정에서 규제 역할을 할 수 있다는 것이다. 예를 들면, 포유류의 전사 리프레 Bach1의 활성 및 포유류 핵 REC를 제어함으로써 많은 유전자의 전사에 영향을 미치는eptor 목사 erbα 10 ~ 15. 헴 헴 또는 산소 (16)에 응답하여, 호흡 및 산화 적 손상의 제어에 관여하는 유전자의 활성화에 중요한 역할을 헴 활성제 단백질 HAP (1)의 작동을 조절한다. 헴 또한 3,17-20 시그널링 신경 성장 인자 (NGF)를 통한 신경 세포에서의 유전자 전사를 조절한다. 또한 헴 조절 eIF2α 키나아제 (HRI) 21-24의 활성을 조절함으로써 포유류 적혈구 세포에서 단백질 합성을 조절한다. 또한, 헴 적절한 세포 기능 및 세포 증식 4,20,25에 필수적인 티로신 키나제의 Src 릴화 Jak2과 같은 주요 신호 전달 단백질의 활성에 영향을 미친다. 그것은 헬라 세포의 헴 억제 노화 및 세포 사멸 (26)과 관련된 마커의 세포주기 정지 및 활성화가 발생하였습니다. 헴 결핍 또는 헴의 증가 수준은 모두 인간 27 심각한 건강에 미치는 영향과 관련이있다. 최근 분자ND 역학 연구는 높은 헴 섭취 양 협회 및 2 형 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환, 폐암, 대장 암, 췌장암 27,28 등 여러 암과 같은 질병의 위험 증가를 보여 주었다. 정상 및 폐 암 세포 저자 &#39;랩의 짝을 사용하는 것이 암세포 산소 소비, 헴 합성 및 헴 흡수 및 산소 이용률 28에 관여하는 단백질의 수준이 증가 된 것을 발견 하였다. 흥미롭게도, 헴 합성의 억제는 산소 소비, 증식, 암 세포 (28)의 이동과 콜로니 형성을 감소시켰다. 따라서, 내인성 헴의 레벨 변동이 분자 세포 프로세스 3,4,28,29의 조절에 중요한 역할을한다. 포유 동물에서, 헴의 생합성은 미토콘드리아와 세포질 4 (그림 1)에있는 효소를 포함, 여덟 단계에서 발생합니다. 헴 biosyn논문 ALA 신타 (아아) 4,31 의해 촉매 5- 아미노 레 불린 산 (5-ALA)을 형성 글리신 및 숙시 닐 -CoA의 응축과 미토콘드리아의 행렬에서 시작된다. 이것은 nonerythroid 세포에서 헴 생합성에서 속도 제한 단계이다. 5-ALA는 다음 다음 4 단계를 다시는 프로토 포르피린 IX (PPIX)로 변환되어 미토콘드리아로 가져 코프로 포르 피리 노겐 III (CPgenIII)​​를 형성하기 위해 발생하는 세포질에 밖으로 내 보냅니다. 마지막으로, 철의 한 분자는 헴, 페로 (FECH) 1,2,4에 의해 촉매 반응을 생성하기 위해 프로토 포르피린 IX (PPIX)에 통합된다. 헴 생합성의 레벨은 주로 세포 단단히 철 및 헴 (4)에 의해 제어된다 아아 효소의 수준에 따라 달라진다. 헴 생합성 유전자 결함은 특정 미네랄과 비타민 (예를 들어, 리보플라빈, 아연), 독소 (예를 들어, 알루미늄, 납 노출의 가용성에 의해 영향을받을 수있다), 특정 스테로이드 (의 산소 결핍, 발열 및 레벨 예를 들어, 에스트로겐) 32 ~ 35. 헴 합성의 수준은 다양한 질환 상태에 변경된다. 감소 헴 생합성 빈혈뿐만 아니라 신경 질환 3,36의 원인이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 증가 된 헴 생합성은 특정 암 28,37의 진행에 중요한 역할을한다. 헴은 포유 동물의 지방, 적혈구와 신경 세포 4,38-41의 성장, 분화 및 생존에 중요한 것으로 나타났다. 예를 들어, 헴의 결핍은 글루타민산 NMDA (N- 메틸 - 디 - 아스파 테이트) 수용체 (17)의 억제를 통해 기본 마우스 대뇌 피질의 신경 세포의 신경 돌기의 손상으로 이어집니다. 또한 헴 합성의 억제는 인간 경부 상피 암종 HeLa 세포 26,41 프로그래밍 세포 사멸을 야기한다. 따라서, 다른 조건에서 다양한 세포에서 헴 생합성 수준을 측정하는 단계와 progressi 병인 연구에 중요많은 질병의에. 여기에서는 [4- (14) C] 5- 레 블루 닉 산을 사용하여 세포 내 헴 합성의 수준을 측정하기 위해 빠르고 민감한 방법을 설명한다. 이것은 55의 Fe 또는 59의 Fe를 사용하는 다른 방법과 다른 방법이다. 그 방사선이 매우 약한 때문에 우리는 14 C를 사용하여 선호합니다. 반면, 강력한 보호는 철 동위 원소와 협력이 필요합니다. 또한,이 방법은 측정하고 빠른 방식으로 병렬로 서로 다른 셀에서 헴 합성을 비교하기위한 것이다. 헴 절대 수준을 측정하기 위하여, 하나는 HPLC 42,43의 사용을 포함하는 이전에 확립 된 방법을 사용할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

헴은 헤모글로빈, 미오글로빈 및 사이토 크롬 등 hemoproteins로 알려진 단백질의 광범위한 보철 기로서 기능한다. 그것은 같은 유전자 전사, 번역, 세포 분화 및 세포 증식 등의 다양한 분자와 세포 과정에 참여하고있다. 헴 생합성 레벨이 다른 조직과 세포 유형에 걸쳐 다양하며, 빈혈, 신경 장애 및 암과 같은 질병 상태로 변경된다. 이 기술을 사용하여 [4- (14) C] 5- 아미노 레 불린 산 ([14 C] 5-ALA), 포유류 세포에서 헴 합성의 수준을 측정하는 헴 생합성 경로에서 초기 전구체 중 하나. 이 분석은 헴에 혼입 된 방사능의 측정 및 헴 추출하여 [14 C] 5-ALA를 가진 세포의 배양을 수반한다. 이 절차는 정확하고 신속하다. 이 방법은 헴 생합성의 상대적인 수준보다는 헴 총 함량을 측정한다. 이 TECHN의 사용을 설명하기 위해헴 생합성 수준 개새끼 것은 여러 포유 동물 세포주에서 측정 하였다.

이 방법은 암 (HCC4017) 폐 세포 대 정상 (HBEC30KT)에서 헴 합성 수준을 비교하기 위해 사용되었다.이 정상 폐 세포 (HBEC30KT)보다 암세포 (HCC4017)에서 헴 합성의 더 높은 수준을 보여준다. 헴 합성의 레벨은 미토콘드리아 uncoupler 보닐 시안화 -3- chlorophenylhydrazone (CCCP)의 존재 하에서 정상 및 암 세포에서 측정 하였다. 세포는 헴 합성 수준을 측정하기 전에 24 시간 동안 10 μM의 CCCP ?...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

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Biology

12.0K 조회수.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.