우리 닥터 하 산 Yardimci 감사 하 고 종류의 프랜시스 크릭 연구소의 Dr.Sevim Yardimci 도움이 단일 분자 실험에의 컬럼비아 대학, 박사 에릭 C. 그린의 연구소에서 박사 다니엘 Duzdevich 박사 유지 북경 대학교의 태양과의 Chunlai 첸 박사 칭화 대학 유용한 토론에 대 한입니다. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 31371264, 31401059, CAS 혁신 팀과 뉴턴 고급 친교 (NA140085)에서 왕 사회에 의해 지원 되었다.

1. λ-ARS317 DNA 기판의 준비
<ol><li>DNA 기판 건설 및 포장<ol>
<li>소화 Xho을 사용 하 여 네이티브 λ DNA 나 효소; ARS317 신진의 genomic DNA에서 20를 포함 하는 뇌관을 사용 하 여 효 모 543 bp DNA 조각 베어링 증폭 bp 동종 시퀀스의 업스트림 및 다운스트림 Xho나 람다 DNA에서 효소 사이트. 추가 100 ng Xho의 λ DNA와 10 소화 DNA의 ng 동종 재결합 반응 시스템, 10 µ L를 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 반응을 품 어.</li>
		<li>재결합 λ DNA 패키지, 재결합 제품으로 람다 포장 추출의 25 µ L을 추가 하 고 90 분 30 ° C에서 반응을 품 어. 그런 다음 람다 포장 추출 반응 관에의 한 추가 25 µ L를 추가 합니다. 계속 품 어 90 분 30 ° C에서 반응.</li>
		<li>반응 시스템에 살 균 희석 버퍼 (10 mM Tris HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 m m MgCl2)의 500 µ L을 추가 하 고 부드럽게 튜브를 거꾸로 여러 번 설정 하 여 혼합. 클로 프롬의 25 µ L을 추가 하 고, 부드럽게 혼합, 4 ° c.에 저장</li>
		<li>포장 된 살 균 소의 100 µ L 및 100 µ L 세균 LE392MP의 추가 (0.8-에서 교양 1.0 파운드 매체 10 mm MgSO4추가 사용 하 여) 새로운 튜브로. 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>4 mL oftop agar (파운드 매체 + 0.7% agar 10mm MgSO4, 48 ° C에 냉각)으로 살 균 소 박테리아 혼합물의 200 µ L를 추가 합니다. 즉시 튜브를 거꾸로 여러 번 설정 하 여 혼합 하 고 미리 따뜻하게 (37 ° C) 파운드 접시에 부 어.</li>
		<li>37 ° C에서 접시를 밤새 품 어 그리고 λ-ARS317 패 PCR를 사용 하 고 시퀀싱 화면.</li>
	</ol>
</li>
	<li>액체 lysates11,18 에서 DNA 기질 정화<ol>
<li>살 균 ddH2O 10 m MgCl2 와 10 nM CaCl2의 200 µ L로 한 패를 선택 합니다. 200 µ L의 박테리아 LE392MP (파운드 매체에서 교양된 하룻밤)와 함께 혼합 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>NZCYM의 100 mL에 박테리아 살 균 소 혼합물을 추가 (10 g/L 뉴질랜드-아민, 5 g/L 효 모 추출 물, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino의, 그리고 2 g/L MgSO4·7H2O) 37 ° c.에 7 h에 대 한 문화와 매체 문화에 클로 프롬의 250 µ L을 추가 하 고 다른 10 분 동안 흔들어.</li>
		<li>200 mL 플라스 크에 문화를 전송 합니다. NaCl (1 M 최종 농도)의 5.8 g를 추가 하 고, 해산 저 어 30 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>셀 파편 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심. 200 mL 플라스 크에는 상쾌한을 수집 하 고 10% 말뚝8000 (m/V) 추가. 자석 교 반 장치에 의해 해산 하 고 30 분 이상 얼음에 품 어 저 어.</li>
		<li>살 균 소 침전에 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심. 제거는 상쾌한.</li>
		<li>살 균 소 희석 버퍼의 2 mL에 침전을 resuspend. 15 mL 튜브로 전송 하 고 RNase (최종 농도 20 µ g/mL)의 10 µ L 및 DNase (최종 농도 5 µ g/mL)의 40 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>0.3의 2 개 mL를 추가 M Tris HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1.25 %SDS, 15 µ L 성분 K (최종 농도 10 µ g/mL). 10 분 동안 65 ° C에서 품 어.</li>
		<li>사전 냉각된 칼륨 아세테이트 (3 M, pH 4.8)의 2 개 mL를 추가 하 고 10 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.</li>
		<li>불용 성 물질을 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 8000 x g에서 원심.</li>
		<li>에 상쾌한 소 프로 파 놀의 0.7 x 볼륨을 추가 합니다. 거꾸로 여러 번 튜브를 설정 하 여 혼합 하 고 실내 온도 (RT)에 2 분 동안 품 어.</li>
		<li>DNA를 침전 하는 RT에 10 분 동안 8000 x g에서 원심. 제거는 상쾌한.</li>
		<li>일단 70% 에탄올 10 분에 대 한 8000 x g에서 원심 분리 하 여 제거는 상쾌한 DNA를 씻어.</li>
		<li>부드럽게, 500 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 m m EDTA, pH 8.0)를 사용 하 여 DNA elute 그리고 1.5 mL 튜브에 DNA를 전송.</li>
		<li>두 번 페 놀을 사용 하 여 DNA를 추출: 10 분에 대 한 8000 g에서 원심 분리 하 여 클로 프롬.</li>
		<li>0.7 x 볼륨 소 프로 파 놀과 침전. 거꾸로 튜브, 부드럽게 내려와 10 분 동안 8000 x g에서 원심 회전 하 여 혼합.</li>
		<li>한 번 70% 에탄올으로 씻어, 테의 200 µ L에서 resuspend. DNA 농도 측정 하 고 12.5 µ g aliquots에-20 ° C에서 저장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
<ol><li>Biotinylated oligonucleotides phosphorylate를 (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-비오 틴-3') 출신의 왼쪽된 끝에 보완 λ DNA, oligonucleotides ddH2O, 1 µ L의 리가 버퍼, x 10의 7.5 µ L, T4 PNK의 0.5 µ L의 1 µ L (100 µ M)를 추가. 3 h 37 ° C에서 반응을 품 어.</li>
	<li>Λ-ARS317 phosphorylate, λ-ARS317의 12.5 µ g, 3 µ L 리가 버퍼 x 10의 추가, T4 PNK ddH2O 30 µ L의 총 볼륨의 1 µ L 3 h 37 ° C에서 반응을 품 어.</li>
	<li>Λ-ARS317와 oligonucleotides anneal, phosphorylated oligonucleotides의 0.5 µ L, ddH2O, phosphorylated λ-ARS317 관에 10 × 리가 버퍼의 25 µ L의 195 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 거꾸로 설정 하 여 혼합 하 고 65 ° C 블록 히터, 고 하자 블록에 33 ° C 아래에 샘플 쿨 5 분 턴에서 품 어.</li>
	<li>Λ-ARS317와 oligonucleotides 선, T4 DNA 리가의 1 µ L와 ATP (200 m m)의 0.63 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 거꾸로 설정 하 여 혼합 하 고 하룻밤 실 온에 2 시간 또는 4 ° C에서 품 어. 1 개월에 4 ° C에서 저장 합니다. 참고: 헤어 지는 DNA를 방지 하려면 모든 혼합 단계 할 수 하 여 부드럽게 튜브 거꾸로, 펫을 사용 하 여 혼합 하는 대신.</li>
</ol>3. Coverslip 청소 및 기능화
<ol><li>청소 하는 Coverslip<ol>
<li>4 착 색 항아리 (5 coverslips/병)에 장소 20 coverslips 에탄올, 30 분 동안 sonicate 고 초순 H2O 3 시간 coverslips를 헹 굴.</li>
		<li>1 M 수산화 칼륨 (KOH), 30 분 동안 sonicate 고 초순 H2O 3 시간 coverslips를 헹 굴. 에탄올 및 코 쥡니다 한 번 반복 합니다.</li>
		<li>30 분 동안, 아세톤과 sonicate 고 다음 초순 H2O 철저 하 게 린스 (3 번 이상). 참고: 아세톤 제거 해야 합니다 철저 하 게 rinsing 초순 H2O, 여 때 실수로 고생 솔루션 (아세톤) 등 유기 용 매 혼합 폭발이 발생할 수 있기 때문에14.</li>
		<li>피 라 솔루션에는 coverslips를 배치 (H2의 3:1 혼합 등4 과 30% H2O2)와 1 시간 동안 95 ° C에 품 어. 참고: 피 솔루션은 높은 활력과 침식, 그래서 신중 하 게 사용. 준비할 때 피 솔루션, 500 mL 유리 비 커에 H2O2 의 50 mL를 먼저 추가 하 고 그래서 H2의 150 mL를 추가 합니다4 비 커에 천천히.</li>
		<li>5 번 초순 H2O coverslips를 헹 구 십시오. 다음 각 coverslip 초순 H2O 3 비 커 가득 초순 H2O를 사용 하 여 철저 하 게 세척 하 고 건조 coverslip는 coverslip의 가장자리에서 종이 사용 하 여. 얼룩 항아리에는 coverslip를 놓고 30 분 동안 coverslip 110 ° C 오븐에서 철저 하 게 건조 합니다.<ol>
<li>메탄올을 가진 coverslip 린스 고 얼룩 단지 110 ° C 오븐을 다시는 coverslip 철저 하 게 건조 합니다. 참고:는 coverslip 철저 하 게 건조 매우 중요 하다, 물19존재는 일단 항 가능한 표면 구조를 많이 있을 것 이다 때문에.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip 기능화<ol>
<li>실 란 솔루션의 70 mL을 추가 (93% 메탄올, 아세트산, % 및 2 %5 항) 각 항아리에 뚜껑을 나사와 하룻밤 실 온에서 항아리를 두고.</li>
		<li>워시와 3.1.5, 건조 오븐에서 그들을 배치 하는 대신 철저 하 게 질소 가스를 사용 하 여 coverslips를 제외 하 고 단계에 설명 된 대로 coverslips를 건조.</li>
		<li>0.1 m M 신선한 만든 NaHCO3 (pH 8.2) 1 mL에 150mg mPEG (methoxy-폴 리 에틸렌 글리콜)의 biotin-말뚝 (biotin-폴 리 에틸렌 글리콜)의 6 mg를 철저 하 게 분해. 17 다음 원심 분리기, 불용 성 못을 제거 하는 1 분 동안 000 x g. 참고: 갓 만든된 NaHCO3 은 준비; pH를 조정할 필요가 있다.</li>
		<li>상자에 silanized coverslips를 놓고 두 개의 작은 coverslips silanized coverslips의 두 끝 위에 넣어. 100 µ L silanized coverslip의 중앙에 못 솔루션의 플라스틱 그리고 다른 silanized coverslip 상단에 배치.</li>
		<li>습기가 유지 상자에 일부 초순 h 조2O를 추가 하 고 어둠 속에서 적어도 3 h 말뚝 솔루션 coverslips를 품 어. 야간 보육도 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>Coverslip 쌍을 분리 하 고 기능성된 표면 얼굴 유지, 린스 초순 h 조2O를 사용 하 여 광범위 하 게, coverslips 질소 가스와 함께 그들을 건조.</li>
		<li>표시 마커 펜, 기능성된 측면 얼굴, 상자에 넣어에 저장 하는 상자 진공 desiccator 1 개월 유지를 사용 하 여 모서리 중 하나에 coverslips의 기능성된 측면.</li>
		<li>긴 시간 동안에 coverslips를 저장 하 한 coverslip 모자에 1 개의 구멍을 뚫고 50 mL 튜브에 다음 비닐 봉지에 튜브를 넣어 놓고 진공 실러를 사용 하 여 가방을 봉인 합니다. 이 방법에서는, coverslips는 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 약 3 개월.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 흐름 셀 조립
<ol><li>양면 테이프 (30 m m × 12 m m)는 주먹을 사용 하 여 조각의 센터에서 15 m m × 2 m m 채널을 절단.</li>
	<li>양면 테이프의 종이 쪽을 벗기십시오 고 두 개의 구멍을 유리 슬라이드에 붙여 넣습니다. 기포 제거를 누릅니다. 우리의 경험을 바탕으로, 그것은 쉽게 양면 테이프의 플라스틱 측면 보다 종이 쪽을 벗 하 여 기포를 제거 하.</li>
	<li>4 기능성된 coverslip (60 m m × 24 m m)를 잘라 조각 (30 × 12 mm) 다이아몬드로 만들어진 유리를 사용 하 여 학자, 하 고 질소 가스를 사용 하 여 파편을 제거. 기능성 유지 해야 측면 얼굴.</li>
	<li>이중 면 테이프의 플라스틱 면을 벗기십시오 고 기능성된 coverslip에 슬라이드를 붙여 넣습니다. 기포는 coverslip와 테이프를 제거 하려면을 살짝 누릅니다. 철저 하 게 공기 방울을 제거 버퍼 했다 그것으로 펌핑 하는 동안 누출에서 흐름 세포를 보호할 수 있습니다.</li>
	<li>입구와 출구 배관에 삽입 작은, 큰 구멍, 각각. 에폭시를 사용 하 여 튜브를 수정 합니다.</li>
	<li>Streptavidin (0.2 mg/mL)의 20 µ L 주사기를 사용 하 여 수동으로 흐름 세포로 펌프 하 고 10 분 동안 RT에서 품 어. 블로킹 버퍼10 streptavidin, 대체 흐름 세포로 펌프 그리고 실내 온도에서 보관.</li>
</ol>5. 단일 분자 시각화
<ol><li>532 nm 레이저와 640 nm 레이저를 사용 하 여 동시 여기 빨간색과 형광 현미경 테스트 슬라이드 # 1에서 a 5와 빨강의 초점 맞춤 얻을. 듀얼 파장 광학 (참조 테이블의 재료)를 분할 이미지를 생산.</li>
	<li>흐름 세포를 현미경에 놓고 10 mL 스프링 자동된 주입/철수 프로그래밍 가능 펌프에 설치 된 더 이상 배관 연결 콘센트 배관 연결. 참고: 주사기를 흐름 셀의 입구 배관에서 버퍼를 인출 하는 방법 아래에 언급 하는 흐름 셀으로 버퍼를 펌핑.</li>
	<li>공기를 신속 하 게 제거 하 여 흐름 셀에 버퍼 차단이 되었는지 확인 흐름 셀에 500 µ L/min에서 블로킹 버퍼를 펌프. 그리고 흐름 세포에 200 µ L/min에서 블로킹 버퍼를 펌프 콘센트 튜브 입구 배관 및 흐름 셀에서 기포를 완전히 제거를 플립. 참고: 모든 버퍼 흐름 셀으로 펌핑 해야 될 degassed 진공 desiccator에 사용 하기 전에 적어도 15 분 동안.</li>
	<li>블로킹 버퍼의 80 µ L로 biotinylated λ-ARS317 DNA의 0.5 µ L을 추가 하 고 2 분 25 µ L/min 흐름 셀에 펌프. 다음 50 µ L/분의 속도로 차단 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 λ-ARS317 DNA 플러시.</li>
	<li>흐름 세포에 블로킹 버퍼를 제거 하 50 µ L/min의 속도로 버퍼10 바인딩 200 µ L 펌프.</li>
	<li>0.2 µ L streptavidin 입히는 Qdot705 (1 µ M)의 추가 및 biotinylated 오크의 0.2 µ L (1.2 µ M) 튜브로 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 다음 버퍼 튜브에 바인딩 20 µ L을 추가 하 고 얼음에 놓습니다. 오크 Qdot705 의 최종 농도 약 10 nM.</li>
	<li>2 µ L 오크 Qdot705 의 추가 (10 nM), DTT (100 m m), 바인딩 버퍼의 96 µ L로 ATP (200 m m)의 1 µ L의 1 µ L. 오크 Qdot705 의 최종 농도 0.2 nM.</li>
	<li>흐름 셀에 10 µ L/min의 속도로 0.2 nM 오크 Qdot705 의 20 µ L를 펌프. 100 µ L/min의 속도로 바인딩 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 과도 한 오크 Qdot705 의 밖으로 플러시. 다음 100 µ L/min의 속도로 DNA 기판 얼룩 흐름 셀으로 30 nM SYTOX 오렌지 펌프 바인딩 버퍼.</li>
	<li>오크 Qdot705 신호를 자극 하 고 SYTOX 오렌지 스테인드 DNA 신호 각각 405 nm 레이저와 532 nm 레이저를 사용 하 여. 쿼드-밴드 대역 통과 필터 (FF01-446/510/581/703-25)를 사용 하 여 100 µ L/min 흐름으로 신호를 동시에 관찰 하 고 프레임 당 100 ms와 EM CCD로 이미지를 기록 합니다. 다양 한 분야에서 20 이미지 스택을 수집 합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>캘리포니아 대학교 샌 프란 시스 코 박사 론 베일의 연구소에 의해 개발 된 이미지 플러그인 (OI_cut_RGBmerge)를 기반으로 하는 새로운 플러그인, 스스로 의해 수정 되는 피지 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 자르기.<ol>
<li>이미지 (512 × 512 픽셀)의 스택 이미지 (256 × 256 픽셀)의 2 개 더미로 자르기. 하나는 532 nm 레이저 흥미로운 결과, 그리고 다른 한 405 nm 레이저 흥미로운 결과.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피지-이미지-스택-Z 프로젝트 (평균 강도)를 사용 하 여 61 순차적인 이미지를 처리 합니다.</li>
	<li>측정 길이 (LDNA) DNA와 dna의 DNA에 오크 Qdot705 (L오크) 바인딩 사이트에서 거리의 끝을 수동으로 곁.</li>
	<li>L오크/LDNA 의 결과 계산을 사용 하 여 excel r, 부트스트랩 메서드를 사용 하 여 데이터를 분석 그리고 히스토그램을 생성, 가우스 배급에 맞게.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase.">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+&#955;+DNA+purification+procedure+suitable+for+the+analysis+of+DNA+from+either+large+or+multiple+small+lysates.">A bacteriophage &#955; DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates.</a> Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).</li><li>Smith, E. A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prevent+the+loss+of+surface+functionality+derived+from+aminosilanes.">How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes.</a> Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).</li><li>Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+modification+of+&#955;-DNA+substrates+for+single-molecule+studies.">Efficient modification of &#955;-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기, 선물이 Qdot 표시 된 단백질 및 흐름 셀에서 TIRFM는을 사용 하 여 site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 관찰 하는 프로토콜. 필요한 단계는 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름-세포 준비, 및 단일 분자 이미징 사이트 수정 포함 됩니다. 주목 해야 한다 두 가지 요점을 확인 하 고 있습니다. 첫째, λ DNA와 관련 된 단계, 예를 들어, 어떤 가능한 손상 감소를 부드럽게 ...

단백질 및 DNA 사이 상호 작용, DNA 복제, DNA 수리, 전사 등 많은 복잡 한 생물 학적 과정에 필수적입니다. 기존의 접근 이러한 프로세스의 속성에 빛을 발산가, 비록 많은 키 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 최근, 급속 하 게 발전 한 분자 기술로 메커니즘의 일부 해결된1,2,3되었습니다.
주로 단백질 DNA 상호 작용을 실시간으로 시각화에 단일 분자 형광 현미경 검사 법의 응용 프로그램의 형광 탐지 및 형광 프로브 개발에 따라 달라 집니다. 단일 분자 연구를 위해 그것은 형광 탐지 시스템은 주로 상업적으로 사용할 수 있기 때문에 적합 한 형광 프로브 관심사의 단백질을 분류 하는 것이 중요.
형광 단백질 분자 생물학에 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 낮은 형광 밝기 및 photobleaching에 대 한 안정성 많은 단일 분자 분석에 응용 프로그램을 제한합니다. 양자 점 (Qdots)는 작은 발광 나노 입자4. 그들의 독특한 광 속성으로 인해 Qdots은 10-20 배 더 밝다 고 몇 천 배 더 많은 안정 보다 널리 사용 되는 유기 염료5. 또한, Qdots 있다 큰 Stokes shift (여기 및 방출 봉우리의 위치 사이의 차이)5. 따라서, Qdots 동안 양적 분석에서 이용 될 수 없습니다 오랜 관찰 (시간 분) 및 높은 신호 대 잡음 비율, 이미지의 수집에 대 한 사용할 수 있습니다.
날짜 하려면, site-specifically Qdots와 대상 단백질을 분류 하는 방법은 두 가지: Qdot 활용 된 주 또는 보조 항 체6,,78;의 원조로 또는 대상 단백질 Qdots와 직접, biotin와 streptavidin9,10,11,,1213사이 강한 상호 작용을 기반으로 라벨. Qdots Streptavidin 입히는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리의 최근 연구에서 site-specifically biotinylated 단백질을 높은 효율으로 신진 효 모에 BirA Avi 태그 단백질의 공동 overexpression에 의해 정화 되었다 vivo에서10. 다음 하 고 단일 분자 분석 실험14,15,,1617최적화, 단일 분자 수준의 사용에 Qdot 표시 된 단백질 및 DNA 사이 상호 작용 관찰 TIRFM10.
여기, 우리가 선택한 신진 관심사의 우리의 단백질으로 원래 인식 복잡 한 (오크)을 구체적으로 인식 하 고 자율적으로 복제 시퀀스 (ARS)에 바인딩할 수, 효 모. 다음 프로토콜 TIRFM를 사용 하 여 Qdot 표시 된 오크 ARS와의 상호 작용을 시각화 하는 단계별 절차를 제공 합니다. Site-specifically 수정된 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름 셀 어셈블리 및 단일 분자 이미징의 준비는 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3011</td>
			<td>Store 25 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-fusion cloning kit</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B22611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPlax Lambda 
			Packaging Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5110</td>
			<td>Bacterial strain LE392MP 
			is included in this package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10013092</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10012818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ-amine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J853-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22090-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring apparatus</td>
			<td>IKA</td>
			<td>KMO2 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122151</td>
			<td>15 mL, sterile, bulk, 500pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R4875-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5319-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0706-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated primers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22266882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10009259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>306568-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>80120891</td>
			<td>sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10011218</td>
			<td>30% Hydrogen peroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG 
			(methoxy-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-PEG 
			(biotin-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>IPC250-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum sealer</td>
			<td>MAGIC SEAL</td>
			<td>WP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped glass scribe</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>70036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/4</td>
			<td>inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL620001-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>LEAFTOP</td>
			<td>9005</td>
			<td>five minutes epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion/withdrawal 
			programmable pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Sapphire-532-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS-640-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Imaging 
			splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu photonics K.K.</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF illumination system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX2-RFAEVA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60&#215;TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>APON60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-edge laser dichroic 
			beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di01-R405/488/ 
			532/635-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-446/510/ 
			581/703-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF649-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET585/65m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET665lp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F36909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot705 Streptavidin Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q10163MP</td>
			<td>Store at 4 &#186;C, do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0220-25G</td>
			<td>Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M109-5G</td>
			<td>Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 &#956;l aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified &#955; dna at the single molecule level

형광 현미경 검사 법 단일 분자 수준에서 복잡 한 생물 학적 과정의 메커니즘을 해 부에 큰 기여를 했다. 단일 분자 DNA 단백질 상호 작용을 공부에 대 한 분석에서 고려에 대 한 두 가지 중요 한 요소는: 쉽게 관찰 하 고 적합 한 형광 프로브는 단백질을 라벨에 대 한 충분 한 길이와 DNA 기질. 48.5 kb λ DNA DNA 기판에 대 한 좋은 후보입니다. 양자 점 (Qdots), 형광 프로브 클래스로 장기간 관찰 (시간 분)와 높은 품질 이미지 수집 수 있습니다. 이 논문에서는, site-specifically 수정된 λ DNA를 준비 하 고 라벨 streptavidin 입히는 Qdots와 대상 단백질을 포함 하는 단일 분자 수준에서 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜 선물이. 개념 증명에 대 한 우리 오크 (복잡 한 원산지 인정) 신진 효 모에 관심사의 단백질으로 선택한 TIRFM 사용 하는 ARS (자동으로 복제 시퀀스)와 상호 작용을 시각화 합니다. 다른 형광 프로브에 비해, Qdots photobleaching에 대 한 그것의 높은 안정성 때문에 단일 분자 연구에 분명 한 이점이 있다 하지만이 속성 양적 분석에 응용 프로그램 제한에 주목 한다.

Qdot 표시 된 오크는 ARS의 상호작용을 시각화 하려면 우리가 먼저 λ-ARS317 DNA 기판 건설. ARS317를 포함 하는 DNA 조각 통합 되었다 Xho에 내가 사이트 (33.5 kb) 네이티브 λ DNA의 동종 재결합 (그림 1A). 재결합 제품 추출 물을 사용 하 여 패키지 된 고 포장된 살 균 소 입자 파운드 플레이트 (그림 1B)에 경작 되었다. 긍정적인 살 균 ...

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Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

여기, 선물이 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) site-specifically 수정된 λ DNA 기판 및 양자 점 단백질 분류를 사용 하 여 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜.

Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

JoVE Journal

Biology

7.5K 조회수.  Chinese Academy of Sciences. 여기, 선물이 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) site-specifically 수정된 λ DNA 기판 및 양자 점 단백질 분류를 사용 하 여 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜.

비디오: Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified λ DNA at the Single Molecule Level

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

연구

생물학

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

단일 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스 분석

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...